張華崇+閆振華+趙樹琪+黃曉莉+戴寶生+李蔚

摘要：熱激因子（heat shock factors，HSFs）是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)熱激應(yīng)答的一類轉(zhuǎn)錄因子，在熱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用。從已釋放的二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉全基因組測序結(jié)果中分別鑒定到42個和40個HSFs蛋白家族成員，運用生物信息學(xué)分析其序列特征、亞細(xì)胞定位、聚類分析和保守基序等。結(jié)果表明，亞洲棉HSFs蛋白長度116～526個氨基酸，分子量13 748.4～60 028.2 u，等電點4.40～8.75；雷蒙德氏棉HSFs蛋白長度為190～528個氨基酸，分子量21 993.0～60 413.6 u，等電點4.36～9.50。染色體定位顯示二倍體棉花中的HSFs基因不均勻分布在13條染色體上；聚類分析表明，HSFs蛋白序列分為A、B、C 3類，每一亞類中二倍體棉花與擬南芥的蛋白具有較高的同源性，趨向于聚集在一起，且每個亞組具有相同或相似的保守基序類型及排列順序。

關(guān)鍵詞：二倍體棉花；熱激轉(zhuǎn)錄因子；全基因組；生物信息學(xué)

中圖分類號： Q755 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0035-08

熱激因子（heat shock factors，HSFs）是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)熱激應(yīng)答的一類轉(zhuǎn)錄因子，在熱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用[1-2]。1988年，HSFs基因首先在酵母中發(fā)現(xiàn)[3]，植物中的HSFs基因最先在番茄中克隆獲得[4]。典型的熱激轉(zhuǎn)錄因子一般包括4個部分：N端的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化結(jié)構(gòu)域（HR-A/B）、細(xì)胞核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）、細(xì)胞核輸出信號（Nuclear export signal，NES），少數(shù)還具有一個C端激活域（Cterminal activation domain，CTAD）[5]。位于HSFs基因N端的DBD中含有一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的疏水結(jié)構(gòu)，能特異地結(jié)合熱激元件（heat stress element，HSE），誘導(dǎo)下游熱激蛋白表達(dá)[6-7]。HR-A/B含有2個疏水七肽重復(fù)區(qū)域A和B，通過形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)促使HSFs形成同源三聚體，根據(jù)保守DBD和HR-A/B區(qū)的結(jié)構(gòu)特點，熱激轉(zhuǎn)錄因子又可以分為A、B、C 3類[8-9]，在A 類、C類基因中，HR-A/B中A、B結(jié)構(gòu)域之間分別有21個和7個氨基酸插入；在B類基因中，無氨基酸殘基插入[6，10]。NLS和NES含有一簇堿性氨基酸殘基，與HSFs蛋白家族的亞細(xì)胞定位相關(guān)[11-12]。CTAD以芳族的、大的疏水的及酸性的氨基酸（AHA）基元為特征，在A類基因中含特有激活HSFs功能的AHA基元[6]。

棉花是喜溫植物，適當(dāng)高溫可加快棉株生長發(fā)育，但長時間的高溫嚴(yán)重影響花粉發(fā)育、授粉和受精，對棉花產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。隨著全球氣候的變暖，棉花的耐高溫育種顯得尤其重要。本研究利用已釋放的二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉全基因組測序結(jié)果[13-14]，通過生物信息學(xué)技術(shù)掃描全基因組HSFs，進(jìn)一步分析其進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位、理化性質(zhì)預(yù)測和保守基序等，為下一步的選育耐高溫新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 全基因組檢索HSF基因

HSF基因的結(jié)構(gòu)域信息（PF00447）下載自Pfam數(shù)據(jù)庫[15]，利用軟件HMMER3.1b2[16]在Cottongen（https：//www.cottongen.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉HSFs基因家族氨基酸序列，經(jīng)Smart網(wǎng)站[17]（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域預(yù)測確認(rèn)。

擬南芥HSF基因家族氨基酸序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫[18]。

1.2 理化性質(zhì)預(yù)測

通過ExPASy網(wǎng)站中的程序Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對HSFs蛋白家族蛋白分子量、等電點等基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.3 亞細(xì)胞定位

利用在線軟件WOLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html），以及在線網(wǎng)站Soft Berry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）中的PROTCOMP 程序共同對HSFs蛋白家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.4 聚類分析

利用生物信息學(xué)軟件MEGA5.2對鑒定的二倍體棉花中的HSFs蛋白家族和擬南芥中的HSFs蛋白家族進(jìn)行多重序列比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次重復(fù)。

1.5 基序分析

利用MEME軟件分析HSFs蛋白家族的motif類型和順序。具體參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)測數(shù)10，其他參數(shù)為默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花HSF基因家族鑒定

利用結(jié)構(gòu)域預(yù)測得到的結(jié)構(gòu)域信息（PF00447），通過對二倍體棉花全基因組搜索，發(fā)現(xiàn)亞洲棉和雷蒙德氏棉分別有42條和40條具有典型HSF結(jié)構(gòu)域蛋白，并統(tǒng)計了其蛋白號、蛋白長度及對應(yīng)基因所在的染色體（表1），結(jié)果顯示，亞洲棉HSFs蛋白長度為116～526個氨基酸不等；雷蒙德氏棉HSFs蛋白長度為190～528個氨基酸不等。亞洲棉基因組中的42個HSFs基因家族成員不均勻分布在13條染色體上，其中，A11號染色體分布最多，為8個；A6號染色體分布最少，為1個。雷蒙德氏棉基因組中的40個HSFs基因家族成員也不均勻分布在13條染色體上，其中，D3、D4和D6號染色體分布最多，均為5個；D1、D2和D12號染色體分布最少，均為1個。endprint

2.2 棉花HSFs蛋白家族理化性質(zhì)預(yù)測

利用在線網(wǎng)站對二倍體棉花HSFs蛋白家族理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測（表1），預(yù)測結(jié)果，二倍體棉花中HSFs蛋白分子量存在較大差異。其中，亞洲棉中分子量最大的是Cotton_A_14557，達(dá)到了60 028.2 u，分子量最小的是Cotton_A_24993，為13 748.4 u；雷蒙德氏棉中分子量最大的是Gorai.004G284200，為60 413.6 u，分子量最小的是Gorai.006G087100，為21 993.0 u。等電點變化范圍也比較大，其中，亞洲棉中Cotton_A_01784等電點最大，為8.75，Cotton_A_00864最小，為4.40；雷蒙德氏棉中Gorai.006G125000等電點最大，為9.50，Gorai.008G170800最小，為4.36，表明HSFs蛋白家族從酸性到堿性都有分布。

2.3 棉花HSFs蛋白家族亞細(xì)胞定位

為了了解HSFs蛋白家族發(fā)揮功能的區(qū)域，利用2種亞細(xì)胞定位軟件預(yù)測了二倍體棉花HSFs蛋白家族亞細(xì)胞定位（表2），結(jié)果表明，2種軟件WoLF PSORT和Protcomp預(yù)測結(jié)果類似，大部分HSFs蛋白家族定位于細(xì)胞核。根據(jù)軟件WoLF PSORT預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HSFs蛋白家族定位于1～4個位置不等，但除亞洲棉中Cotton_A_24993和除了雷蒙德氏棉中Gorai.006G087100分別定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)外，其余HSFs蛋白家族定位于細(xì)胞核分值最高；根據(jù)Protcomp預(yù)測發(fā)現(xiàn)，除了雷蒙德氏棉中Gorai.004G284200定位于細(xì)胞質(zhì)中，其余HSFs蛋白家族均定位于細(xì)胞核。綜上所述，二倍體棉花的HSFs蛋白家族中至少有一種預(yù)測定位于細(xì)胞核，這符合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中調(diào)控基因表達(dá)的作用特點。

2.4 棉花HSFs蛋白家族聚類分析

為了揭示二倍體棉花HSFs蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系，將亞洲棉和雷蒙德氏棉的42條和40條HSFs蛋白，與下載的21條擬南芥HSFs蛋白家族進(jìn)行聚類分析（圖1）。結(jié)果顯示，103條HSFs蛋白序列分為了A、B、C 3類，其中A類含有9個亞類（A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9），二倍體棉花都不含有A7亞類，每一亞類中二倍體棉花與擬南芥的蛋白具有較高的同源性，趨向于聚集在一起，例如，雷蒙德氏棉 Gorai.008G170800、Gorai.N013300和亞洲棉Cotton_A_25561、Cotton_A_00864、Cotton_A_24993與擬南芥中的HSF蛋白AT1G67970（AtHsfA8a）互為同源蛋白而聚集在一起。B類含有5個亞類（B1、B2、B3、B4、B5），且二倍體棉花中完整地含有5個亞類，而擬南芥不含有亞類B5。C類中只有1個亞類C1，且二倍體棉花和擬南芥中都存在。此外，不同亞類HSF蛋白雖聚集在一起，但二倍體棉花與擬南芥卻趨向于形成不同的分枝，且亞洲棉中存在與雷蒙德氏棉同源的HSF蛋白（除Cotton_A_24993和Cotton_A_22025）。

2.5 棉花HSFs蛋白家族基序分析

對二倍體棉花82個HSFs蛋白家族保守基序的分析結(jié)果見圖2，82個HSFs蛋白家族含有10個保守基序，長度為11～50個氨基酸。進(jìn)一步分析10個保守基序在不同亞組HSFs蛋白中的分布（圖3）， 結(jié)果表明， HSFs蛋白家族含有保守基序個數(shù)從2～8個不等，每個亞組具有相同或相似的保守基序類型及排列順序。例如，A1亞類Gorai.003G053300、Gorai.003G183900、Gorai.007G033300、Gorai.004G257000、Gorai.008G225200、Gorai.013G183500、Cotton_A_02851、Cotton_A_05732、Cotton_A_23520、Cotton_A_07921、Cotton_A_33386和Cotton_A_09182具有相似的基序（7～8個），也具有相似的排列順序。

3 討論

在全球氣候變暖的環(huán)境下， 高溫對棉花的正常生長發(fā)育產(chǎn)生了不利的影響，常常誘使棉葉凋萎，花粉失水干縮，蕾鈴大量脫落[19]。HSFs是植物響應(yīng)熱激脅迫保護(hù)自身免受高溫傷害的一類轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、大豆中分別有21、25、52個HSFs[20-22]。本研究基于二倍體棉花雷蒙德氏棉和亞洲棉測序的完成，通過全基因組進(jìn)行搜索分析，亞洲棉和雷蒙德氏棉分別鑒定出42個和40個具有典型HSF結(jié)構(gòu)域蛋白，Wang等利用表達(dá)序列標(biāo)簽組裝和全基因組分析技術(shù)在陸地棉D(zhuǎn)亞組中也鑒定得到40個HSFs基因[9]。本研究中HSFs蛋白家族分為A、B、C 3類，每類含有的HSF數(shù)目不同，理化性質(zhì)也存在較大差異，且不均勻地分布在不同染色體上，表明二倍體棉花HSFs蛋白家族存在廣泛的多樣性，這也為功能的多樣性奠定了基礎(chǔ)。

HSFs作為一類轉(zhuǎn)錄因子，要通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)行使功能，其表達(dá)模式有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)2類，廣泛參與植物響應(yīng)高溫、干旱和氧化等多種逆境脅迫[23-25]。雖然在模式植物擬南芥和番茄中的研究較為詳盡，擬南芥AtHSFA2基因過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性[26-27]，而敲除AtHSFA2基因抑制了下游熱激蛋白基因的表達(dá)，明顯提高了擬南芥對高溫敏感性[28-29]。棉花中關(guān)于HSFs研究的報道還很少，相關(guān)研究表明，陸地棉中HSFs基因在響應(yīng)高溫和纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[9]。但HSFs表達(dá)調(diào)控機制尤其是上游調(diào)控機制，不同HSFs基因在響應(yīng)同一外界刺激和同一HSFs基因在不同逆境脅迫中是否存在保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等等，還有待進(jìn)一步研究闡明。

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