曹尚銀+牛娟+張杰+李好先+薛輝+陳麗娜+劉蓓蓓+張富紅+趙第廣

摘要：對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，簡稱2-DE）、相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantification，簡稱iTRAQ）2種技術(shù)進(jìn)行比較，以期為石榴的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供選擇參考。取花后120 d的三白石榴籽粒為材料，分別用雙向電泳、iTRAQ 2種技術(shù)檢測三白石榴籽粒蛋白。結(jié)果表明，利用2-DE技術(shù)檢測到890種蛋白；通過質(zhì)譜鑒定出5種蛋白；利用iTRAQ技術(shù)得到1 940種蛋白，其中分子量在10 ku以下的有16種，200 ku以上的有19種，pH值大于11的有11種，說明iTRAQ技術(shù)在鑒定大分子、小分子蛋白方面具有優(yōu)勢。由以上結(jié)果可知，iTRAQ技術(shù)比2-DE技術(shù)能發(fā)現(xiàn)更多數(shù)量、更多種類的蛋白，而且iTRAQ技術(shù)可以通過信息檢索了解到被檢索肽段的真實(shí)身份，該技術(shù)的出現(xiàn)，使得對(duì)同種蛋白質(zhì)表達(dá)變化的鑒定更為準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2-DE）；相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）；蛋白質(zhì)組學(xué)；石榴

中圖分類號(hào)： Q946.1；S665.401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0068-03

基因功能的主要執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的研究對(duì)揭示基因的功能及生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重要意義。然而生命體內(nèi)的蛋白質(zhì)極為復(fù)雜，一般每個(gè)細(xì)胞和組織都有數(shù)千甚至上萬種蛋白，因而需要一種技術(shù)能將大量蛋白同時(shí)進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是近年來發(fā)展的新技術(shù)，是從整體水平上認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的存在及活動(dòng)方式（表達(dá)、修飾、功能、相互作用等），從而更好地闡明生命科學(xué)本質(zhì)的學(xué)科[1]；蛋白質(zhì)組學(xué)可以系統(tǒng)地研究植物體的生理生化變化，動(dòng)態(tài)描述蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異，并鑒定出與其生理生化變化相關(guān)的蛋白或基因，以分析植物不同生長時(shí)期、不同環(huán)境條件對(duì)生命過程的影響，從蛋白水平解釋植物各種生理過程的分子機(jī)制[2]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于果實(shí)的發(fā)育和組織器官分化、突變體以及對(duì)生物和非生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制、生理生化過程以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究等方面均有著重要的理論與實(shí)踐意義。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方法有雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，簡稱2-DE）、相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，簡稱iTRAQ）技術(shù)。2-DE是指利用蛋白質(zhì)的帶電性和分子量大小的差異，通過2次電泳達(dá)到分離蛋白質(zhì)群的技術(shù)[3]。2-DE 利用不同蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量的差異，將不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子在第1向等電聚焦（IEF）時(shí)分離，然后不同分子量的蛋白質(zhì)分子在第2向聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)被分離，將復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。經(jīng)過多年發(fā)展，目前這種方法可同時(shí)分離數(shù)千種蛋白，具有分析簡便、快速、分辨率高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用較多的技術(shù)手段。但是，由于受到原理和技術(shù)本身的限制，雙向電泳技術(shù)自誕生以來，始終存在一些難以解決的缺陷，例如2-DE僅能分離水溶性蛋白，而無法應(yīng)對(duì)非水溶性蛋白或某些極端蛋白；同一樣品獲得的不同重復(fù)膠之間經(jīng)常存在一定的誤差，導(dǎo)致試驗(yàn)重復(fù)性不佳，操作繁瑣，致使試驗(yàn)周期相對(duì)較長等[4]。傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)無法對(duì)2個(gè)蛋白質(zhì)樣品的差異進(jìn)行檢測與定量，因而不能應(yīng)用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

由于蛋白質(zhì)濃度對(duì)于蛋白功能的實(shí)現(xiàn)具有重要的作用，一種特殊蛋白質(zhì)在濃度上的變化，就能預(yù)示其細(xì)胞的突變過程。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)、絕對(duì)濃度進(jìn)行測定就變得非常重要[5]。iTRAQ技術(shù)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems）（ABI）在2004年推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)[6]。如今，該技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究中得到了極其廣泛的應(yīng)用，其關(guān)鍵是iTRAQ試劑，該試劑由3種不同的化學(xué)標(biāo)簽組成，即報(bào)告基團(tuán)部分（質(zhì)量為113、114、115、116、117、118、119、121 u）、平衡基團(tuán)部分（balance group）（質(zhì)量為192、191、190、189、188、187、186、184 u）和1個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán)部分（reactive group）。上述8種報(bào)告基團(tuán)通過平衡基團(tuán)與反應(yīng)基團(tuán)相連，可以同時(shí)研究8組樣品[7]。因此，該技術(shù)同時(shí)可以對(duì)1個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或1個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定。如今，iTRAQ技術(shù)已經(jīng)在果樹蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究中得到了極其廣泛的應(yīng)用，如Marsh等應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究了白粉菌感染后的葡萄品種Cabernet Sauvignon（敏感型）的蛋白質(zhì)組變化[8]。但是到目前為止，關(guān)于石榴的蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少，有關(guān)石榴果實(shí)發(fā)育和代謝相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚處于起步階段，僅有軟籽和硬籽石榴果皮雙向電泳圖譜對(duì)比分析[9]，及軟籽石榴和硬籽石榴籽粒差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析[10]。本試驗(yàn)以三白石榴籽粒為材料，對(duì)2-DE、iTRAQ 2種技術(shù)在石榴籽粒中的蛋白鑒定效果進(jìn)行比較研究，以期找出適合石榴組織或器官蛋白質(zhì)組研究的方法，為石榴蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所石榴優(yōu)良品種比較圃內(nèi)7年生白皮的三白石榴（扦插苗定植）為試驗(yàn)材料，三白石榴為白花、白皮、白籽（硬籽），5月中下旬為盛花期，9月中下旬成熟。從石榴園中選取樹體健壯、大小一致、無病蟲害的9株結(jié)果樹，每3株為1組，共3次重復(fù)。在大蕾期標(biāo)記大小基本一致的花蕾，于9月20日取花后120 d的樹冠北面中部內(nèi)堂果實(shí)，迅速切取果實(shí)中部籽粒，立刻用液氮保存，然后置于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法endprint

1.2.1 雙向電泳 采用三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取石榴籽?？偟鞍?。稱取1 g石榴種子加液氮研磨粉碎，在磨好的樣品粉末中加入預(yù)冷的10% TCA-丙酮溶液（含0.1%二硫蘇糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟），-20 ℃靜置2 h；高速離心20 min，棄上清；將沉淀物放入冷凍真空干燥機(jī)中干燥20 min，將干燥的蛋白粉末采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量[11]。雙向電泳時(shí)蛋白質(zhì)上樣量為110 μg，經(jīng)固相pH梯度（IPG）（pH值4～7）膠條水合作用過夜后，再進(jìn)行一維等電聚焦。而后將固化pH值梯度（IPG）膠條用平衡液Ⅰ[0.375 mol/L 三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），10 mg/mL 二硫蘇糖醇，痕量溴酚藍(lán)]和平衡液Ⅱ[0.375 mol/L 三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸，pH值8.8，6 mol/L 尿素，20%甘油，2% SDS，0.1%二硫蘇糖醇，25 mg/mL 碘乙酰胺，痕量溴酚藍(lán)]分別平衡15 min后進(jìn)行雙向垂直SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測[12]，而后用Image Scanner掃描儀（GE Healthcare，USA）對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描，采用PDQuest 7.2軟件（Bio-Rad，Hercules，USA）進(jìn)行圖像分析，包括蛋白點(diǎn)檢測、背景扣除、人工校正和凝膠匹配等幾個(gè)步驟，對(duì)感興趣的蛋白點(diǎn)進(jìn)行切膠、酶解、肽段濃縮、除鹽、點(diǎn)板。將點(diǎn)板后的樣品放入4 800 TOF/TOF串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀（ABI，USA）檢測。第1級(jí)質(zhì)譜得到的肽片段質(zhì)量指紋圖譜、肽質(zhì)量指紋圖譜與第2級(jí)質(zhì)譜得到的肽片段序列信息一起通過GPS Explorer 3.6（ABI，USA）和Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找出匹配的蛋白。

1.2.2 iTRAQ 同樣采用TCA-丙酮沉淀法提取石榴籽?？偟鞍?，方法同“1.2.1”節(jié)。蛋白質(zhì)定量后取試驗(yàn)樣品 150 μg，還原，烷基化。胰酶處理，用iTRAQ試劑（ABI，USA）標(biāo)記樣品，用119、121 u胰酶標(biāo)記后混合。用Shimadzu LC-20AB HPLC Pump分離，A流動(dòng)相含25 mmol/L磷酸二氫鈉、25%乙腈溶液，pH值2.7，B流動(dòng)相含25 mmol/L磷酸二氫鈉、含1 mol/L氯化鉀的25%丙烯腈，pH值2.7。將分離后的肽段進(jìn)一步用NanoAcquity（Waters，USA）進(jìn)行反相分離，A有機(jī)相含2%乙腈和0.1%甲酸，B有機(jī)相含98%乙腈和0.1%甲酸，點(diǎn)板。利用Q-EXACTIVE（Thermo Fisher Scientific，USA）質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測。本研究中石榴籽粒蛋白鑒定所使用的數(shù)據(jù)庫為石榴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。得到的肽片段序列信息通過Mascot 2.3.02（Matrix Science Inc，Boston）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找出匹配的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 三白石榴籽粒的2-DE分析

選用IPG膠條的pH值范圍為4.0～7.0，marker分子量范圍為14.4～116.2 ku，電泳圖中分離的黑點(diǎn)為蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，三白石榴籽粒共檢測到890個(gè)蛋白點(diǎn)。用PDQuest7.4軟件對(duì)籽粒雙向凝膠電泳圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在14.4～116.2 ku范圍內(nèi)，分子量主要集中在40～60 ku，大多數(shù)為中性蛋白；pH值主要集中在5.0～5.5，多為酸性蛋白。

2.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間（MALDI-TOF/TOF MS）質(zhì)譜鑒定

根據(jù)雙向電泳所得PfkB碳水化合物激酶家族蛋白的肽片段質(zhì)量指紋圖及其肽序列信息（圖1），通過GPS-MASCOT的離子搜索模式檢索NCBInr真核生物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，檢索種屬為綠色植物，數(shù)據(jù)庫檢索的方式為combined，片段離子質(zhì)量容差為±0.3 u，最大允許漏切位點(diǎn)為1，酶為胰蛋白酶；質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF 100×10-6，串聯(lián)質(zhì)譜誤差（MS/MS tolerance）為0.2 u。檢索出后的蛋白質(zhì)的分值及其所有肽段離子的總分值都在95%的可信區(qū)間內(nèi)，即錯(cuò)誤概率在 0.002 5 內(nèi)，才確定此蛋白鑒定成功。

2.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）鑒定的iTRAQ試驗(yàn)蛋白質(zhì)

在數(shù)據(jù)庫搜索中，MASCOT的離子搜索模式檢索石榴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。所有的胰蛋白酶特異性要求容差設(shè)定在可接受的范圍內(nèi)。半胱氨酸的烷基化設(shè)為固定修飾，肽段質(zhì)量誤差為0.02 u，其余參數(shù)同“2.2”節(jié)。通過iTRAQ分析可知，三白石榴籽粒中共檢測鑒定出1 940種蛋白質(zhì)，參與了53種代謝通路。在等電點(diǎn)3.0～12.0和分子量7.0～700 ku的范圍內(nèi)，其中分子量在10 ku以下的有16種蛋白，200 ku以上的有19種蛋白，pH值大于11的有11種蛋白。

2.4 iTRAQ試驗(yàn)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果

在串聯(lián)質(zhì)譜中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，帶不同同位素標(biāo)簽的同一多肽產(chǎn)生質(zhì)量為114、116、118、120 u的報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。圖2為果糖激酶表達(dá)豐度的iTRAQ二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)分別利用2-DE、iTRAQ技術(shù)研究、比較了三白石榴籽粒的蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化。通過2-DE研究發(fā)現(xiàn)，三白石榴籽粒中共有890種蛋白，而用iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)了1 940種蛋白，參與了53種代謝通路?？梢奿TRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)總蛋白的種類、數(shù)量都比雙向電泳技術(shù)要多。由于雙向電泳和iTRAQ技術(shù)原理的差異，2-DE技術(shù)發(fā)現(xiàn)的蛋白大多是胞漿蛋白，而iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)的不僅有胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白。因?yàn)樵?-DE技術(shù)樣品的制備中，要將組織或細(xì)胞中的蛋白釋放出來并處于溶解狀態(tài)，而疏水性蛋白和膜性蛋白是難以溶解的，因此容易丟失[13]。由于雙向電泳技術(shù)本身的弊端，2-DE技術(shù)中首先要進(jìn)行一維固相pH值梯度等電聚焦，強(qiáng)堿性的蛋白則需要克服反向、陰極向陽極移動(dòng)以及電滲流等問題，難以分離和檢測強(qiáng)堿性的蛋白。加上受高豐度蛋白的影響，低豐度蛋白的量少。因此，對(duì)于低豐度蛋白、極大（相對(duì)分子質(zhì)量>200 ku）和極小蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量<10 ku）、極堿性蛋白和疏水性蛋白都難以進(jìn)行有效分離，限制了其應(yīng)用范圍。而iTRAQ技術(shù)可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定[14]。在本試驗(yàn)中，利用iTRAQ技術(shù)檢測到分子量在10 ku以下的有16種蛋白，200 ku以上的有19種蛋白，pH值大于11的有11種蛋白，而在雙向電泳中未檢測到這類蛋白。這可能是因?yàn)樵谌u甲基氨基甲烷/甘氨酸緩沖液中，樣品和游離的十二烷基硫酸鈉離子持續(xù)進(jìn)行積累濃縮，與小分子量蛋白發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生的帶較模糊，從而降低小分子量蛋白的分辨率，其次，可能由于質(zhì)譜儀對(duì)小分子量蛋白較難鑒定。關(guān)于高分子量蛋白較少的原因，一方面由于高分子量蛋白滲進(jìn)IPG膠條比較困難，另一方面是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物被解聚成多肽或者是大分子，這都是二維電泳技術(shù)本身的一些局限性[15-16]，導(dǎo)致它對(duì)低豐度蛋白、偏堿蛋白，分子量偏大或偏小的蛋白等難以分離和檢測，而此類蛋白對(duì)于基礎(chǔ)與應(yīng)用研究都極為重要（甚至比高含量結(jié)構(gòu)蛋白更為重要）。此外，有時(shí)1個(gè)蛋白點(diǎn)含有不止1種蛋白，而在雙向電泳中無法檢測到，如PfkB碳水化合物家族蛋白在雙向電泳中為1個(gè)蛋白，而在iTRAQ中檢測到5個(gè)PfkB碳水化合物家族蛋白，說明雙向電泳的靈敏度和重復(fù)性仍然不理想。而iTRAQ技術(shù)中的iTRAQ試劑為同位素，能與賴氨酸及所有肽鏈的氨基末端連接，即在理論上它能標(biāo)記上所有的氨基酸。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，iTRAQ具有較好的定量效果和良好的重復(fù)性[1]，因此，用該技術(shù)檢測的蛋白數(shù)量和種類要比2-DE技術(shù)的多。在本研究中，iTRAQ技術(shù)得到的蛋白數(shù)量是雙向電泳的2倍的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，而且在雙向電泳中鑒定到的蛋白在iTRAQ試驗(yàn)中也都能檢測到。另外，由于2-DE操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以實(shí)現(xiàn)和質(zhì)譜的直接聯(lián)用，不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。而iTRAQ技術(shù)可同時(shí)對(duì)8種或4種樣本進(jìn)行定量比較，省時(shí)省力。將非凝膠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析的目的。endprint

綜上所述，iTRAQ在鑒定和比較總蛋白的數(shù)量、種類上比二維電泳技術(shù)有明顯的優(yōu)勢。而且，iTRAQ技術(shù)可以通過信息檢索了解到被檢索肽段的真實(shí)身份，iTRAQ技術(shù)的出現(xiàn)，使得對(duì)同種蛋白質(zhì)的變化鑒定更為準(zhǔn)確。本研究對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中的二維電泳和iTRAQ 2種技術(shù)在石榴籽粒中的蛋白鑒定效果進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，iTRAQ技術(shù)得到的蛋白數(shù)量較多，種類豐富，可能更有利于進(jìn)一步研究石榴籽粒中復(fù)雜的代謝通路，從而為籽粒形成的分子機(jī)制研究提供一定的理論參考。

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