李小玲+華智銳+張丹婷

摘要：在40 ℃高溫脅迫下，測定秦嶺高山杜鵑幼苗在不同濃度ALA（25、50、75、100、125 mg/L）處理后幼苗熱害指數(shù)，葉片葉綠素、脯氨酸、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性。結果發(fā)現(xiàn)，ALA可以提高高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片葉綠素含量及SOD、POD、CAT活性，降低MDA含量，促進葉片內(nèi)游離脯氨酸含量的積累，并在一定程度上降低熱害指數(shù)。其中，50 mg/L ALA葉面噴施處理時對提高秦嶺高山杜鵑耐熱性相對效果最好。結果表明，葉面噴施ALA可以降低秦嶺高山杜鵑的熱害指數(shù)，緩解熱損傷，提高植株的耐熱性。

關鍵詞：ALA；耐熱性；高山杜鵑；生理特性

中圖分類號： S685.210.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0176-04

杜鵑屬中陜西特有種較多，且具有單種蘊藏量大、抗寒性極強、觀賞價值及藥用價值高等特點，成為西北地區(qū)急需開發(fā)的野生資源之一[1]。而鎮(zhèn)安木王國家森林公園的杜鵑花集中分布在雙頭馬景區(qū)和茨溝杜鵑花景區(qū)，多為大葉美容杜鵑，在跑馬梁深處和鷹嘴峰上分布的則為秀雅杜鵑[2]。近年來，由于全球氣溫不斷升高，高溫逆境對植物的生理生態(tài)過程造成了巨大的影響，而這對植物的耐熱性也提出了更高的要求。杜鵑屬植物主要分布在高海拔地區(qū)，生長繁殖要求冷涼的環(huán)境，對高溫的耐受力不強，在其研究中溫度已成為制約其生長的主要環(huán)境因子。因此，人們在對該屬植物的引種栽培及育種研究中，耐熱性的研究顯得至關重要。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA），又稱為δ-氨基酮戊酸，是生物體活細胞中的一種非蛋白氨基酸[3]，是葉綠素、鈷胺素、亞鐵血紅素等所有卟啉類化合物生物合成的前體物質[4]。大量研究表明，ALA除了作為葉綠素生物合成的重要中間產(chǎn)物外，還能夠促進作物的光合作用[5-8]，增加產(chǎn)量[9]，提高甜瓜[5]、西瓜[10]、黃瓜及辣椒的抗冷性[11-12]，參與植物抗逆性生理反應，具有調節(jié)光合色素的合成、提高光合效率、提高生物體內(nèi)保護酶活性、保護細胞膜穩(wěn)定性等功能[4-6]，有類似于植物激素的調控效應[13]。目前，對于ALA的應用研究主要集中在抗冷性、抗鹽性、抗旱性等方面，而在抗高溫方面的研究則較少，有關ALA在高山杜鵑耐熱性生理方面的研究未見報道。本研究以秦嶺高山杜鵑為材料，研究在高溫脅迫下ALA對植物生理狀態(tài)的影響，旨在為杜鵑屬植物的引種栽培、耐熱育種和園林應用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

所用秦嶺高山杜鵑幼苗采自鎮(zhèn)安木王國家森林公園，ALA購自西安晶博試劑公司，含量≥99.5%，分析純試劑AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 將秦嶺高山杜鵑幼苗移栽在直徑為 15 cm 左右的花盆中，每盆栽幼苗3株，基質為腐葉土與松針土，體積比1 ∶ 2。處理期間每天傍晚噴施0.1%硫酸亞鐵水溶液，經(jīng)過1周的緩苗期后，每天18：00葉面噴施外源物質ALA，連續(xù)噴施1周；ALA濃度分別為25、50、75、100、125 mg/L（溶液現(xiàn)用現(xiàn)配），每種濃度處理3盆；以蒸餾水作為對照，1周后選取生長狀態(tài)大體一致的幼苗于人工氣候箱中進行高溫脅迫。脅迫溫度：40 ℃/30 ℃（晝/夜），光照度 10 000 lx，高溫處理4 d。每間隔24 h進行1次相關生理指標的測定、熱害指數(shù)的統(tǒng)計和計算。

1.2.2 幼苗相關生理指標的測定 分別稱取不同處理下的高山杜鵑葉片0.2 g，測定其葉綠素含量（葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a+b含量和葉綠素b/葉綠素a）、游離脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性。通過觀察并統(tǒng)計高山杜鵑熱害指數(shù)分析其熱害情況。測定方法：葉綠素含量采用丙酮-碳酸鈣法[14]測定，脯氨酸含量采用鄒琦的磺基水楊酸法[15]測定；MDA含量測定參考硫代巴比妥酸（TBA）[14]檢測法。SOD活性采用李合生[16]氮藍四唑（NBT）法測定；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[14]；CAT活性測定采用紫外吸收法測定[16]。以上指標重復測定3次，求其平均值，熱害指數(shù)參考趙冰等的方法[17]計算。

2 結果與分析

2.1 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗熱害指數(shù)的影響

在逆境條件下，植物形態(tài)特征的變化可作為評價植物受損情況及抗逆性強弱的直接指標。在高溫處理1 d后，高山杜鵑幼苗出現(xiàn)了不同程度的熱損傷，隨著時間的延長，植株葉片開始出現(xiàn)萎縮枯黃，且枯黃面積不斷加大。對照組熱害指數(shù)持續(xù)上升且高于所有處理組，而經(jīng)不同濃度外源ALA處理后杜鵑幼苗熱害指數(shù)增長相對緩慢且均低于對照組。結果表明，高溫脅迫抑制了高山杜鵑幼苗生長，適宜濃度ALA通過緩解高溫脅迫對植物造成的損傷，提高植物的耐熱性。當ALA濃度為50 mg/L時，熱害指數(shù)增長最緩慢，植株熱損傷程度最低，生長狀況相對較好（圖1）。

2.2 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗生長相關生理指標的影響

2.2.1 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片葉綠素含量的影響 高溫逆境下，2種葉綠素含量都呈現(xiàn)下降的趨勢（圖2），這說明高溫脅迫顯然抑制了秦嶺高山杜鵑幼苗葉片中葉綠素含量。經(jīng)過不同濃度的ALA處理后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量和葉綠素b/葉綠素a多表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且均高于對照組的結果。25～100 mg/L ALA高溫處理3 d時2種葉綠素含量及葉綠素b/葉綠素a的值均達到最大，且50 mg/L ALA處理的效果最好，在此濃度下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片中光合色素含量最大，光合作用也最強（圖2至圖5）。由此可見，適宜濃度的外源ALA可提高光合色素的含量，且有效地緩解了高溫脅迫對高山杜鵑幼苗葉片光合色素合成的抑制效應，促進了秦嶺高山杜鵑葉片的光合作用，有利于植物在逆境下生長。endprint

2.2.2 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片脯氨酸含量的影響 高溫脅迫期間，脯氨酸含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，外施不同濃度ALA處理后，游離脯氨酸含量均高于對照組，當ALA濃度為50 mg/L時，脯氨酸含量上升最快，且在處理4 d達到最大值（圖6）。由此可見，秦嶺高山杜鵑在經(jīng)歷高溫脅迫時脯氨酸含量呈上升趨勢，而葉面噴施不同濃度的外源ALA促進了脯氨酸含量的積累，提高了植物的滲透調節(jié)能力，緩解了熱害對植物的損傷。

2.2.3 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片MDA含量的影響 隨著高溫脅迫時間的延長，高山杜鵑幼苗葉片MDA含量呈上升趨勢（圖7），說明高溫逆境下細胞質膜發(fā)生了過氧化作用，引起質膜正常的生理功能發(fā)生紊亂。通過不同濃度的ALA處理后，隨著濃度升高，處理2～4 d MDA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，在ALA濃度為50 mg/L時，葉片中MDA含量大幅度降低至所有處理中最低，減緩的效果最為明顯，75、100 mg/L ALA處理也不同程度地緩解了高溫脅迫引起的MDA量升高的趨勢，但效果不明顯。而當ALA濃度為125 mg/L時，處理3～4 d MDA含量則高于對照組。結果說明，適宜濃度的外源ALA處理能夠有效地減緩高溫脅迫下高山杜鵑幼苗生長受到的傷害。

2.2.4 ALA對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片SOD、POD、CAT活性的影響 隨著高溫脅迫時間的延長，3種抗氧化酶的活性呈先上升后下降的趨勢（圖8至圖10），這說明高山杜鵑幼苗對脅迫的反應比較明顯。經(jīng)不同濃度的外源ALA處理后，3種抗氧化酶的活性均整體呈現(xiàn)出升高的趨勢，并與對照形成明顯差異，且當ALA達到50 mg/L時，其效果最好。SOD、POD、CAT活性隨著時間的推移持續(xù)上升，在處理1 d時上升幅度均達到最大值，分別為60.21、59.69、30.98 U/mg；處理2～4 d，雖在75、100 mg/L ALA處理時保護酶活性有所降低，但仍高于對照組，當ALA濃度為 125 mg/L 時3種保護酶活性最低，且低于對照。

3 討論

植物在其整個生長發(fā)育過程中常常會遭受各種非生物因子的脅迫， 其中溫度是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一。高溫逆境下，植物起初表現(xiàn)為生理代謝紊亂，通過啟動自身的調控系統(tǒng)維持在逆境下生長，當高溫損傷超過植物本身的防御能力時，植物就會表現(xiàn)出相應的熱害癥狀，嚴重時萎蔫死亡。本試驗結果表明，隨著高溫脅迫時間的延長，秦嶺高山杜鵑葉片失綠變黃甚至萎蔫枯萎，熱害指數(shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，經(jīng)不同濃度的ALA處理后，熱害指數(shù)上升程度減弱，且50 mg/L ALA處理的效果最好，熱害指數(shù)最低。由此表明，葉面噴施ALA可以降低植株的熱害指數(shù)，緩解熱損傷，提高植株的耐熱性。

葉綠素含量與光合機能大小密切相關。ALA能夠調節(jié)植物葉綠素的合成，促進葉綠素a轉化為葉綠素b，防止葉綠素酶分解，從而保護光合器官。Downton等研究表明，葉綠素含量下降是引起光合速率降低的根本原因[18-19]。汪良駒等研究表明，ALA處理可以提高甜瓜葉片葉綠素含量，尤其是葉綠素b的含量，從而導致葉綠素b/葉綠素a比值增大，有利于植株在弱光下捕獲光能，提高光合速率[20]。本試驗中，高溫脅迫后秦嶺高山杜鵑幼苗葉片的葉綠素含量呈持續(xù)下降趨勢，說明高溫脅迫影響了植物體內(nèi)葉綠素的合成，對植物的光合器官造成了損害。經(jīng)不同濃度的外源ALA處理后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量和葉綠素b/葉綠素a均有不同程度的提高，且均高于對照組，外施50 mg/L ALA處理后高山杜鵑幼苗葉片葉綠素含量和葉綠素b/葉綠素a均達到最大值。由此表明，不同濃度的外源ALA處理，能不同程度地促進葉綠素的合成，減緩高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片葉綠素含量和葉綠素b/葉綠素a的下降，從而改善高山杜鵑葉片光合作用的進行，有利于植物在逆境下生長。

脯氨酸可以反映植物抗逆性的強弱，主要起到維持滲透調節(jié)、防止植物體內(nèi)水分的丟失、提高原生質膠體的穩(wěn)定性等作用。正常情況下，脯氨酸合成酶類通過反饋抑制作用控制植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，當植物處于逆境條件下，脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制效應降低，導致體內(nèi)游離脯氨酸含量升高[21]。在逆境脅迫條件下，耐熱植物與不耐熱植物相比，體內(nèi)積累了更多的脯氨酸，并且耐熱性強弱與植物體內(nèi)脯氨酸維持積累的時間長短呈現(xiàn)正相關[22]。徐剛等研究結果表明，ALA通過提高植物體內(nèi)滲透調節(jié)物質含量以及抗氧化酶活性來提高植物的抗逆性[23]。本試驗結果表明，與對照組相比，外施不同濃度的ALA可提高高溫逆境下高山杜鵑幼苗的脯氨酸含量，且ALA濃度為50 mg/L時，作用效果最好，脯氨酸含量最高。

Martineau等研究認為，高溫傷害的本質是植物細胞膜受損及膜透性的增加[24]，而MDA為膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，可作為脂質過氧化的指標來衡量細胞膜脂過氧化程度和植物抗逆性的強弱。有研究表明，植物抗熱性的強弱與高溫脅迫下MDA含量的增加呈現(xiàn)負相關[25]。徐曉潔等研究表明，外施ALA減緩了番茄幼苗體內(nèi)MDA的積累，緩解了逆境對植物的傷害[26]。本試驗中，高溫脅迫后，MDA的含量持續(xù)升高，當噴施一定濃度的ALA處理后，MDA的含量有不同程度的降低，說明外源ALA能夠抑制膜脂過氧化作用，降低膜系統(tǒng)受到的損害，提高膜的穩(wěn)定性，提高植物在逆境下的生存能力。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶，它可催化超氧陰離子自由基（ O-2 · ）生成O2和H2O2，而生成的H2O2則由POD、CAT清除。這3種酶的活性高低直接反映了植物抗逆性的強弱。王凱紅等認為這3種抗氧化酶與杜鵑屬植物的耐熱性在很大程度上具有相關性，可用來鑒定杜鵑屬植物的耐熱性[27]。本試驗結果表明，高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性均有提高，、外施不同濃度的ALA后，SOD、POD、CAT活性隨著濃度升高呈先升后降趨勢，且在ALA濃度為50 mg/L時活性最大，當ALA濃度為125 mg/L時3種保護酶活性最低，且多低于對照，說明高濃度ALA反而會降低其活性，加劇高溫脅迫的影響。endprint

綜上所述，ALA可以提高高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑幼苗葉片葉綠素含量及SOD、POD、CAT活性，降低MDA含量，促進葉片內(nèi)游離脯氨酸含量的積累，并在一定程度上降低熱害指數(shù)。50 mg/L ALA葉面噴施處理對提高秦嶺高山杜鵑耐熱性相對效果最好。

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