賀鵬，趙西耀，陳煜森，陳霄儀，鄭偉明

自噬相關(guān)基因Atg7 rs11706903單核苷酸多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性

賀鵬1，趙西耀2，陳煜森3，陳霄儀3，鄭偉明1

目的 研究Atg7內(nèi)含子區(qū)rs11706903單核苷酸多態(tài)性與帕金森病的關(guān)系。方法 2013年1月至2017年3月，收集130例帕金森病患者(病例組)和同期109例健康體檢者(對照組)血樣，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析方法檢測Atg7 rs11706903基因多態(tài)性。結(jié)果 rs11706903位點各基因型病例組基因型頻率AA 10.00%、AC 52.31%、CC 37.69%，等位基因頻率A 36.15%、C 63.85%；對照組基因型頻率AA 7.34%、AC 49.54%、CC 43.12%，等位基因頻率A 32.11%、C 67.89%。兩組間無顯著性差異(χ2＜1.001,P＞0.05)。結(jié)論 Atg7內(nèi)含子區(qū)rs11706903單核苷酸多態(tài)性與帕金森病可能無關(guān)。

帕金森??；自噬相關(guān)基因；內(nèi)含子；單核苷酸多態(tài)性；rs11706903

帕金森病是常見于中老年人的進行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為特征，在65歲以上人群中患病率達1.7%。隨著社會人口的老齡化，帕金森病患病率和致殘率有升高趨勢，給家庭和社會帶來沉重負擔。帕金森病病因迄今不明，目前普遍認為帕金森病并非單一因素所致，多種因素可能參與其中。遺傳因素可使患病易感性增加，在環(huán)境因素及衰老的相互作用下，通過氧化應(yīng)激、線粒體功能衰竭、細胞凋亡、自噬等機制，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量變性丟失而發(fā)病。許多研究顯示，基因因素在帕金森病發(fā)病中至少占27%的作用，而在一些人口中，至少占33%[1]。已經(jīng)確定PARK1～PARK13等單基因與帕金森病有關(guān)。單基因遺傳性帕金森病很少見，僅占帕金森病總數(shù)5%左右，絕大多數(shù)帕金森病為散發(fā)性。對其致病基因及蛋白產(chǎn)物功能進行深入研究，有助于闡明帕金森病的遺傳機制，為尋找帕金森病治療靶點提供依據(jù)。

近來報道提示，自噬與帕金森密切相關(guān)[2]。自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,ATG)是自噬通路的關(guān)鍵基因，本研究探討Atg7內(nèi)含子rs11706903位點多態(tài)性與散發(fā)性帕金森病發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2013年1月至2017年3月，在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院建德分院、廣東省人民醫(yī)院南海醫(yī)院(佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院)和廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院診治的帕金森病患者130例(病例組)，所有患者均符合英國帕金森病協(xié)會腦庫的帕金森病臨床診斷標準，并經(jīng)1年隨訪證實[3]。

排除標準：①帕金森病癥狀和體征是由于腦外傷、腦腫瘤、病毒感染、腦血管病或其他已知的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及已知的藥物和/或化學(xué)毒物引起；②患者有眼外肌麻痹、小腦體征、體位性低血壓、錐體系損害、肌萎縮等。

對照組為同期同院健康體檢者109例。經(jīng)臨床檢查和/或影像學(xué)檢查，排除心、腦、肝、腎疾病，糖尿病、炎癥等疾病。

所有標本的收集均經(jīng)患者本人或其家屬同意，簽署知情同意書，并經(jīng)各自就醫(yī)的醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會同意。

病例組平均年齡(71.47±8.84)歲，對照組(70.79±11.02)歲(t=0.529,P=0.597)；病例組男/女性別比為72/58，對照組為64/45(χ2=0.268,P=0.604)。兩組間年齡及性別構(gòu)成均無顯著性差異。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集及提取

取早晨空腹靜脈血5 ml，3.8%檸檬酸鈉抗凝。碘化鉀法提取外周血白細胞的基因組DNA，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及基因目的片段擴增

選擇Atg7基因內(nèi)含子區(qū)rs11706903位點，應(yīng)用引物設(shè)計軟件PRIMER 5.0設(shè)計引物。

1.2.3 主要儀器

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、移液器(100～1000 μl、20～200 μl、0.5～10 μl)：BBI公司。SW-CJ-1D潔凈工作臺：江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠。DK-8D型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司。DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：上海琪特分析儀器有限公司。YXJ-2離心機：湘儀離心機儀器有限公司。H6-1微型電泳槽：上海精益有機玻璃制品儀器廠。凝膠成像系統(tǒng)：GENE GENIUS公司。U-3010紫外-可見分光光度計：HITACHI公司。

1.2.4 主要試劑

TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(without Mg2+:100 mmol/L Tris-HCl、 500 mmol/L KCl、 0.8%Nonidet)、25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L dNTP、Marker：BBI公司。6×DNA Loading Dye、SK1141 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒：生工公司。限制性內(nèi)切酶：MBI Fermentas公司。

1.2.5 反應(yīng)過程

取0.5 ml PCR反應(yīng)管，加入10×Taq Buffer 1.5 μl、2.5 mmol/L dNTP(each)0.3 μl、50 pmol/μl F 引物0.2 μl、50 pmol/μl R 引物 0.2 μl、基因組 DNA 1.0 μl、5 U/μl TaqDNA 聚合酶 0.1 μl、MgCl21.2 μl、蒸餾水11 μl，總反應(yīng)體積 15 μl。置 PCR 反應(yīng)擴增儀中擴增：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，(68±0.5)℃退火45 s，72℃延伸60 s，20個循環(huán)；再次95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，再重復(fù)20個循環(huán)，72℃延伸6 min。

1.2.6 基因型鑒別及分析

PCR產(chǎn)物用MBI限制性內(nèi)切酶酶切，參照內(nèi)切酶說明書操作。酶切體系 15 μl，包括PCR 產(chǎn)物 10 μl、10×Buffer R 1.5 μl、10 U/μl內(nèi)切酶酶 0.1 μl、蒸餾水3.4 μl，37℃水浴8 h以上。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠(Agarose LE,Sangon)，電壓150 V，在TBE緩沖液中電泳30 min。凝膠成像系統(tǒng)對電泳帶型照相、分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。Har-dy-Weinburg平衡吻合度和各組基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

擴增片段長152 bp。野生型(AA基因型)無酶切位點，酶切后可見長度為152 bp條帶，突變雜合子(AC基因型)酶切后可見152 bp、114 bp和38 bp三條條帶，突變純合子(CC基因型)酶切后可見114 bp和38 bp兩條條帶。

為驗證聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法的可靠性，選取對照組14和88號標本送上海生工公司進行測序，測序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果吻合。

病例組和對照組各基因型分布見表1。經(jīng)χ2檢驗均符合Hardy-Weinburg平衡定律，表明在所調(diào)查人群中已達到遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一個孟德爾群體。見表1。

兩組rs11706903位點基因型頻率及等位基因頻率均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2。

表1 兩組rs11706903位點基因型分布比較(n)

表2 兩組rs11706903等位基因頻率比較(n)

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細胞的一種蛋白質(zhì)降解方式。研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以利用泛素標簽進行底物識別和加工，批量降解細胞內(nèi)大分子、聚集的蛋白質(zhì)和受損的細胞器[4]。通過對不同時間小鼠進行解剖，發(fā)現(xiàn)自噬缺陷的神經(jīng)元內(nèi)存在異常蛋白質(zhì)及細胞器，如異常線粒體、過氧化物酶體等的積累，并與多聚泛素蛋白發(fā)生累積，形成包涵體[5]。隨著時間延長，包涵體大小和數(shù)量都在增加。提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)自噬缺乏導(dǎo)致神經(jīng)元退變[6-7]。

Crews等[8]通過對含有路易體的患者尸檢、運用轉(zhuǎn)基因鼠、Western blotting、顯微鏡觀察等方法發(fā)現(xiàn)，存在路易體的患者和具有α-突觸核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)的小鼠存在Atg7水平降低；在含路易體的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)自噬標記物異常表達；超微結(jié)構(gòu)分析顯示眾多異常自噬體存在。提示自噬與帕金森病發(fā)病相關(guān)[9-10]。

Atg7是自噬過程中的必需成分[11-12]。它在催化過程中起泛素樣激酶E1酶的作用，可以識別Atg3和Atg10，并把它們分別轉(zhuǎn)運到Atg8和Atg12上，使之連接。在哺乳動物細胞自噬泡形成過程中，Atg3、Atg5、Atg7、Atgl0、Atg8和Atg12參與兩條泛素樣蛋白加工修飾系統(tǒng)：Atg12-Atg5結(jié)合系統(tǒng)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-Atg8脂化系統(tǒng)[13]。兩個途徑均與Atg7催化作用密切相關(guān)，Atg7缺陷將不能發(fā)生自噬[14]。特異性自噬損害導(dǎo)致小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元丟失、低分子量α-Syn積累和泛素化蛋白質(zhì)聚集體存在[15]。這包括帕金森病許多病理特征。

Atg7基因進化保守，由282,455 bp組成，編碼基因位于染色體3q25.3，含有18個外顯子，轉(zhuǎn)錄生成含676個氨基酸殘基的蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，Atg7基因在自噬通路中起重要作用[16-17]。Ahmed等[18]使用表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，產(chǎn)生了在黑質(zhì)致密部、中腦其他區(qū)域及后腦多巴胺能神經(jīng)元中特異刪除Atg7基因的小鼠。Pattison等[19]利用此小鼠模型，運用Western blotting、高效液相色譜分析、電子顯微鏡觀察、行為測試等方法，發(fā)現(xiàn)小鼠全腦突觸前α-Syn和富含亮氨酸重復(fù)激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)蛋白累積；運用抗體檢測的方法，發(fā)現(xiàn)泛素陽性包涵體存在于中樞系統(tǒng)廣泛區(qū)域中；小鼠也顯示自噬功能完全喪失導(dǎo)致的行為缺陷，包括異常的抓握反射、震顫、協(xié)調(diào)運動降低。LRRK2基因常染色體顯性突變是導(dǎo)致家族性帕金森病最常見的基因原因，亦與其散發(fā)性病例相關(guān)[20-22]。Chen等[23]在散發(fā)性帕金森病患者和種族匹配的健康對照者中，對Atg7基因啟動子進行雙向測序，在5例帕金森病患者中，發(fā)現(xiàn)4個新的雜合子突變體，降低Atg7基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。提示Atg7基因啟動子序列突變可能是帕金森病的危險因素。但Atg7基因內(nèi)含子與帕金森病的關(guān)系迄今未見報道。

本研究證實，漢族人群Atg7基因內(nèi)含子區(qū)rs11706903存在多態(tài)性，但病例組的各基因型頻率與對照組無顯著性差異。提示rs11706903多態(tài)性與散發(fā)型帕金森病發(fā)病無明顯聯(lián)系。

由于目前尚未發(fā)現(xiàn)與該位點有關(guān)的其他研究結(jié)果，基于以下原因?qū)τ诒狙芯筷幮越Y(jié)果的解讀尚需謹慎：①因種族差異，基因型及等位基因頻率分布往往明顯不同；②由于環(huán)境因素、研究對象選擇標準等的差異，或基因多態(tài)性間連鎖不平衡，可能影響實驗結(jié)果；③由于研究的樣本量不夠大，導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)效能不足；④可能存在樣本偏倚[24-25]。需在其他人群、更大樣本、更嚴格入組標準背景下進行進一步研究，評估該基因變異對帕金森病發(fā)病的作用。

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Association of Single Nucleotide Polymorphisms of Autophagy-related Genes Atg7 Site rs11706903 and Parkinson's Disease

HE Peng1,ZHAO Xi-yao2,CHEN Yu-sen3,CHEN Xiao-yi3,ZHENG Wei-ming1
1.Department of Neurology,Guangdong General Hospital's Nanhai Hospital(the Second People's Hospital of Nanhai District Foshan City),Foshan,Guangdong 528251,China;2.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital(Jiande Branch),School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 311600,China;3.Department of Neurology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong 52400l,China

ZHAO Xi-yao.E-mail:13588181243@163.com

Objective To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphisms(SNP)of rs11706903,intron region of Atg7,and Parkinson's disease(PD).Methods From January,2013 to March,2017,130 PD patients and 109 healthy subjects were recruited and collected the blood samples.SNPs of rs11706903 were detected with polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism.Results For the patients,the genotype frequencies of rs11706903 were AA 10.00%,AC 52.31%and CC 37.69%;and allele frequencies were A 36.15%and C 63.85%.For the healthy controls,the genotype frequencies of rs11706903 were AA 7.34%,AC 49.54%and CC 43.12%;and allele frequencies were A 32.11%and C 67.89%.There was no significant difference in frequencies of genetypes and alleles beteen two groups(χ2＜1.001,P＞0.05).Conclusion There might be no relationship between SNPs ofAtg7 intron region rs11706903 and PD.

Parkinson's disease;autophagy-related genes;intron;single nucleotide polymorphisms;rs11706903

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.015

R742.5

A

1006-9771(2017)11-1313-04

[本文著錄格式] 賀鵬，趙西耀，陳煜森，等.自噬相關(guān)基因Atg7 rs11706903單核苷酸多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)性[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(11):1313-1316.

CITED AS:He P,Zhao XY,Chen YS,et al.Association of single nucleotide polymorphisms of autophagy-related genes Atg7 site rs11706903 and Parkinson's disease[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1313-1316.

杭州市醫(yī)療衛(wèi)生科研項目(No.20150633B82)。

1.廣東省人民醫(yī)院南海醫(yī)院(佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，廣東佛山市528251；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院建德分院神經(jīng)內(nèi)科，浙江建德市311600；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東湛江市524001。作者簡介：賀鵬(1972-)，男，漢族，湖北丹江口市人，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)疾病遺傳學(xué)。通訊作者：趙西耀(1980-)，男，漢族，河南開封市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)疾病遺傳學(xué)。E-mail:13588181243@163.com。

2017-03-29

2017-08-30)