陸永嘉，嚴(yán)雋陶，馬書杰，陶然，馬穎，史智君，孔亞敏，王春紅

推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)坐骨神經(jīng)延期縫合大鼠神經(jīng)再生的效果

陸永嘉1，嚴(yán)雋陶1，馬書杰2，陶然2，馬穎1，史智君1，孔亞敏1，王春紅1

目的 探討推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)坐骨神經(jīng)橫斷傷延期外膜修復(fù)后促進(jìn)神經(jīng)再生的效果。方法 60只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)等分為對(duì)照組、模型組和治療組。后兩組建立坐骨神經(jīng)橫斷傷延期外膜縫合模型，治療組給予捏法推拿及跑臺(tái)訓(xùn)練，每天1次。分別于干預(yù)后1個(gè)月、2個(gè)月各取10只大鼠檢測(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)、再生神經(jīng)軸突數(shù)及施萬細(xì)胞數(shù)，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與模型組比較，治療組MCV在干預(yù)后2個(gè)月加快(p＜0.05)，軸突數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)，施萬細(xì)胞數(shù)增加(p＜0.05)，電鏡下?lián)p傷較輕。結(jié)論 推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練可促進(jìn)損傷的周圍神經(jīng)再生。

坐骨神經(jīng)；神經(jīng)再生；推拿；跑臺(tái)訓(xùn)練；大鼠

周圍神經(jīng)損傷是臨床常見病，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙和不同程度感覺障礙。周圍神經(jīng)損傷的治療主要是促進(jìn)神經(jīng)再生，延緩骨骼肌萎縮。臨床由于受諸多因素影響，部分周圍神經(jīng)損傷患者很難得到Ⅰ期神經(jīng)修復(fù)，常需等到條件允許或神經(jīng)損傷程度及范圍確定后，才能進(jìn)行Ⅱ期神經(jīng)修復(fù)[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)推拿手法及主動(dòng)運(yùn)動(dòng)都是重要的神經(jīng)康復(fù)方法，廣泛應(yīng)用于臨床。推拿手法對(duì)神經(jīng)損傷后恢復(fù)早期有一定療效，有助于延緩骨骼肌萎縮，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；通過刺激神經(jīng)，可以提高受損神經(jīng)興奮性，延緩?fù)俗兯俣萚2-5]；推拿手法具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀之效，能促進(jìn)血液循環(huán)，提高新陳代謝，進(jìn)而改善神經(jīng)肌肉的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[6-9]，促進(jìn)骨骼肌與神經(jīng)恢復(fù)。本研究探討推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)失神經(jīng)后延期縫合坐骨神經(jīng)再生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)11400700150167。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK(滬)2014-0008，5只/籠，自由進(jìn)食飲水，室溫18℃，濕度40%～50%。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)分為對(duì)照組(n=20)、模型組(n=20)和治療組(n=20)，每組再分為造模后1個(gè)月、2個(gè)月2個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛：上海西唐生物科技有限公司。石蠟、甲醛、戊二醛、鋨酸、氨水、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2：上海國(guó)藥集團(tuán)。光譜二抗、DBA濃縮試劑盒、中性樹脂、蘇木精：上海長(zhǎng)島生物科技有限公司。CX41正置顯微鏡：OLYMPUS公司。透射電子顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)：PHILIPS公司。SQ2125石蠟切片機(jī)：MEDITE公司。IMS圖像分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技(上海)有限公司。D5100數(shù)碼相機(jī)：NIKON公司。自制手法模擬儀：本校與復(fù)旦大學(xué)共同研制。RM-6240BD多道生理信號(hào)處理系統(tǒng)、YLS-15A大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機(jī)：成都儀器廠。

1.3 造模方法

采用坐骨神經(jīng)橫斷傷立即縫合模型。模型組和治療組采用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)。右下肢局部剃毛，常規(guī)消毒；無菌條件下距坐骨結(jié)節(jié)下方約0.5 cm處行臀部切口，從股二頭肌與半腱肌間顯露坐骨神經(jīng)干，10倍顯微鏡下鈍性分離，于距梨狀肌下緣1 cm處切斷坐骨神經(jīng)干，兩斷端返折180°，但不縫入附近肌組織；縫合肌間筋膜與皮膚。4 d后打開原切口，將斷端神經(jīng)游離并修剪后，外科顯微鏡下11/0縫合線行外模縫合，對(duì)端縫合神經(jīng)。縫合肌間筋膜與皮膚。術(shù)后碘伏消毒，青霉素鈉25萬U肌肉注射。每天1次，共3 d。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后3周，模型組和對(duì)照組不作任何干預(yù)，治療組進(jìn)行以下干預(yù)。①手法模擬儀模擬捏法行推拿干預(yù)，壓強(qiáng)6 kPa，捏2 min，間隔1 min。②采用YLS-15A大鼠轉(zhuǎn)輪式跑步機(jī)進(jìn)行訓(xùn)練，5 r/min共5 min。

以上干預(yù)均每天1次，于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

各組于干預(yù)后1個(gè)月、2個(gè)月行以下指標(biāo)檢測(cè)。

1.5.1 大體觀察

觀察術(shù)后切口情況、肌肉萎縮程度、右下肢活動(dòng)能力、步態(tài)變化及足趾潰瘍等。

1.5.2 坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(motor conduction velocity,MCV)

采用RM-6240BD四通道生理記錄儀，采集頻率100 kHz，掃描速度0.8 ms/格，靈敏度4 mV，時(shí)間常數(shù)0.2 s；頻波頻率100 Hz，刺激電壓1 V，波寬0.1 ms。將刺激電極正負(fù)極平行插入坐骨結(jié)節(jié)下方坐骨神經(jīng)走行兩側(cè)，相距約1 cm；記錄電極分別置于腘窩處和跟腱處神經(jīng)走行兩側(cè)；地線位于刺激電極和腘窩處記錄電極之間。兩對(duì)記錄電極的距離/動(dòng)作電位出現(xiàn)的時(shí)間差即為坐骨神經(jīng)MCV。每只大鼠測(cè)3次，取平均值。

1.5.3 坐骨神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)

坐骨神經(jīng)MCV測(cè)定結(jié)束后，斷頸處死各組大鼠，取出右側(cè)坐骨神經(jīng)斷端下神經(jīng)組織1 cm，石蠟包埋，切片，HE染色。高倍鏡下每標(biāo)本取5個(gè)視野，HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)記錄視野內(nèi)坐骨神經(jīng)軸突數(shù)。

1.5.4 施萬細(xì)胞計(jì)數(shù)

石蠟切片用SP-9003試劑盒(美國(guó)ZYMED公司)行S-100免疫組織化學(xué)染色。用HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)400倍鏡下每標(biāo)本取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 電鏡觀察

坐骨神經(jīng)組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水、滲透、包埋，超薄切片，染色，透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。計(jì)量資料以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

手術(shù)過程中有2只大鼠因麻醉意外死亡，由備用大鼠補(bǔ)齊；神經(jīng)修復(fù)術(shù)后全部動(dòng)物存活。大鼠手術(shù)側(cè)早期出現(xiàn)失神經(jīng)支配表現(xiàn)，部分足部皮膚發(fā)紅，少數(shù)足趾腫脹；1周左右傷口愈合，傷口無感染。術(shù)后1～3周，各組均有大鼠出現(xiàn)不同程度足底潰瘍、噬趾，踝關(guān)節(jié)不同程度僵硬、跖屈受限，坐骨神經(jīng)支配區(qū)出現(xiàn)肌肉萎縮，右下肢跛行。足部潰瘍經(jīng)百多邦外用后明顯好轉(zhuǎn)。近1個(gè)月時(shí)，各組大鼠潰瘍基本愈合，術(shù)側(cè)肌萎縮明顯減輕，跛行步態(tài)減輕，踝關(guān)節(jié)功能活動(dòng)不同程度恢復(fù)。

2.2 坐骨神經(jīng)MCV

模型組和治療組MCV均較對(duì)照組下降(p＜0.05)，治療組1個(gè)月時(shí)MCV與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，2個(gè)月時(shí)MCV大于模型組(p＜0.05)。見表1。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)MCV比較(m/s)

2.3 坐骨神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)

模型組和治療組坐骨神經(jīng)軸突數(shù)均高于對(duì)照組(p＜0.05)。坐骨神經(jīng)軸突數(shù)治療組呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組呈下降趨勢(shì)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)軸突數(shù)比較(/視野)

2.4 施萬細(xì)胞計(jì)數(shù)

模型組和治療組坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞數(shù)1個(gè)月時(shí)均高于對(duì)照組(p＜0.05)，2個(gè)月時(shí)模型組與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)。治療組1個(gè)月時(shí)坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞數(shù)與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，2個(gè)月時(shí)多于模型組(p＜0.05)。見表3。

表3 兩組各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞數(shù)比較(/視野)

2.5 電鏡觀察

1個(gè)月時(shí)，對(duì)照組可見有髓神經(jīng)纖維排列，髓鞘形狀正常，間隙適當(dāng)；模型組見脫髓鞘現(xiàn)象發(fā)生，有髓神經(jīng)纖髓鞘外觀不規(guī)整；治療組神經(jīng)纖維松散，以小型神經(jīng)纖維多見，髓鞘形態(tài)不佳。2個(gè)月時(shí)，對(duì)照組見有髓神經(jīng)纖維正常排列；模型組有髓神經(jīng)纖維髓鞘外形呈扁平狀，不規(guī)整，部分髓鞘出現(xiàn)空泡，有脫髓鞘趨勢(shì)；治療組有髓神經(jīng)纖維總體結(jié)構(gòu)明確，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)仍略松散，可見施萬細(xì)胞。見圖1。

3 討論

本研究顯示，推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練能加快坐骨神經(jīng)損傷失神經(jīng)后延期縫合大鼠坐骨神經(jīng)MCV。神經(jīng)傳導(dǎo)速度可反映周圍神經(jīng)功能狀態(tài)，臨床上常用于評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷程度及功能恢復(fù)情況[10-13]。神經(jīng)損傷后神經(jīng)傳導(dǎo)性受損，表現(xiàn)為神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢或消失。本研究顯示，神經(jīng)損傷修復(fù)后，坐骨神經(jīng)MCV明顯減弱；手法及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，坐骨神經(jīng)MCV明顯恢復(fù)。

推拿和運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制可能通過促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖，幫助再生神經(jīng)沿正確的方向生長(zhǎng)延伸，進(jìn)而調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)軸突的再生。但手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練促進(jìn)延期縫合大鼠神經(jīng)再生的效應(yīng)需要時(shí)間，在1個(gè)月時(shí)，手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練的優(yōu)勢(shì)并不明顯，占主導(dǎo)地位的是神經(jīng)縫合后的自我修復(fù)；2個(gè)月時(shí)，手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生的優(yōu)勢(shì)才得以體現(xiàn)。盡管坐骨神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)沒有顯著性差異，但通過電鏡觀察，可見有髓神經(jīng)纖維改善情況；結(jié)合施萬細(xì)胞增殖，推測(cè)對(duì)于有軸突功能的改善仍需進(jìn)一步時(shí)間積累。

本研究MCV恢復(fù)，提示神經(jīng)修復(fù)后軸突再生，并有部分到達(dá)終末，對(duì)靶器官進(jìn)行再支配。

圖1 各組坐骨神經(jīng)各時(shí)間點(diǎn)超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡,bar=10 μm)

施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞，最初來源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)脊細(xì)胞[14]，廣泛存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，與軸突關(guān)系密切，可以包繞軸突，形成髓鞘，進(jìn)行所謂的有髓神經(jīng)纖維；也可包繞軸突不形成髓鞘，即無髓神經(jīng)纖維[15]。周圍神經(jīng)損傷后，施萬細(xì)胞即刻發(fā)生形態(tài)行為學(xué)改變，最為明顯的是沃勒變性。在周圍神經(jīng)損傷再生過程中，施萬細(xì)胞的功能尤為突出。首先，施萬細(xì)胞進(jìn)行自身細(xì)胞增殖，為軸突的再生提供通過的管道；其次，施萬細(xì)胞表達(dá)、分泌多種神經(jīng)再生所需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)；其三，施萬細(xì)胞與新生軸突進(jìn)行包繞，形成有髓、無髓神經(jīng)纖維，促進(jìn)軸突成熟；最后，施萬細(xì)胞能夠神經(jīng)肌肉接頭處促進(jìn)神經(jīng)再支配。

本研究顯示，神經(jīng)顯微修復(fù)后，施萬細(xì)胞數(shù)一直穩(wěn)定保持在較高水平；在此期間，治療組施萬細(xì)胞數(shù)持續(xù)高于對(duì)照組，手法及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖。施萬細(xì)胞增殖可為新生神經(jīng)軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)提供良好環(huán)境，促進(jìn)再生軸突沿著正確的方向生長(zhǎng)，加速神經(jīng)軸突直徑增大、髓鞘厚度增加，提高坐骨神經(jīng)MCV。

本研究觀察時(shí)間最長(zhǎng)3個(gè)月，而坐骨神經(jīng)損傷后肢體功能恢復(fù)尚需較長(zhǎng)時(shí)間，目前的結(jié)果尚不能全面顯示推拿聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷再生中的作用。周圍神經(jīng)損傷后再生機(jī)制復(fù)雜，尤其是延期進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)，情況更加復(fù)雜。推拿及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生及肢體功能恢復(fù)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Effect of Tuina Combined with Treadmill Training on Nerve Regeneration after Sciatic Nerve Delayed Suture in Rats

LU Yong-jia1,YAN Jun-tao1,MA Shu-jie2,TAO Ran2,MA Ying1,SHI Zhi-jun1,KONG Ya-min1,WANG Chun-hong1
1.Department of Tuina,Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai Univesity of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China;2.College of Rehabilitation,Shanghai Univesity of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

YAN Jun-tao.E-mail:doctoryjt@sohu.com

Objective To explore the effect of the combination of Tuina and treadmill training on nerve regeneration after sciatic nerve transection.Methods A total of 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group,model group and treatment group equally.The sciatic nerve was transected in the latter two groups and the epineurium suture was delayed four days.Then the treatment group accepted Tuina and treadmill training once a day.The motor conduction velocity(MCV)of sciatic nerve was measured one and two months after intervention in ten rats respectively,while the number of regenerated axons and Schwann cells was counted,and structures of sciatic never were observed under electron microscopy.Results Compared with the model group,the MCV accelerated in the treatment group(p＜0.05),the number of axons was not significantly different(P＞0.05),and the number of Schwann cells increased two months after modeling(p＜0.05),with less injury under electron microscopy.Conclusion Tuina combined with treadmill training can promote the regeneration of the injured peripheral nerve.

sciatic nerve;nerve regeneration;Tuina;treadmill training;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.007

R745

A

1006-9771(2017)11-1273-05

[本文著錄格式] 陸永嘉，嚴(yán)雋陶，馬書杰，等.推拿手法聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)坐骨神經(jīng)延期縫合大鼠神經(jīng)再生的效果[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(11):1273-1277.

CITED AS:Lu YJ,Yan JT,Ma SJ,et al.Effect of Tuina combined with treadmill training on nerve regeneration after sciatic nerve delayed suture in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1273-1277.

1.國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.30973806;No.81373764)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.81603713)。

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院推拿科，上海市200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海市201203。作者簡(jiǎn)介：陸永嘉(1988-)，男，漢族，上海市人，博士研究生，主要研究方向：推拿防治骨骼肌萎縮。通訊作者：嚴(yán)雋陶。E-mail:doctoryjt@sohu.com。

2017-04-17

2017-06-22)