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(1.貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心， 貴陽 550025;2.貴州大學(xué)林學(xué)院， 貴陽 550025)

貴州桂花種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

羅仙英，桂敬飛，嚴(yán)治，明毅，田雨風(fēng)，范付華

(1.貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心， 貴陽 550025;2.貴州大學(xué)林學(xué)院， 貴陽 550025)

通過ISSR分子標(biāo)記，對(duì)貴州不同地區(qū)的54份桂花種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性研究。選取11條多態(tài)性引物用于正式擴(kuò)增，獲得清晰、重復(fù)性好的DNA譜帶93條，多態(tài)位性譜帶80條，占總擴(kuò)增帶的86%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增8.45條；應(yīng)用810和830的引物組合，構(gòu)建了桂花種質(zhì)的ISSR指紋圖譜，可以有效區(qū)分所有供試材料；利用NTSYS和POPGENE 32進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出相似系數(shù)與遺傳距離，構(gòu)建了54個(gè)樣本的聚類樹狀圖；以遺傳相似系數(shù)0.69為閾值把54份供試桂花材料分為4類，聚類結(jié)果與地域及海拔具有一定相關(guān)性。因此，ISSR技術(shù)能夠有效地用于桂花種質(zhì)資源的鑒別及遺傳關(guān)系的解析。

桂花； ISSR分子標(biāo)記； 遺傳多樣性； 聚類分析

桂花(OsmanthusfragransLour.) 原產(chǎn)我國(guó)西南部喜馬拉雅山東段，為木犀科(Oleaceae)木犀屬(OsmanthusLour.) 常綠灌木或小喬木，葉對(duì)生，花期一般為8月上旬—10月上旬，花簇生，香味濃郁。桂花為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，栽培歷史悠久，觀賞價(jià)值高，應(yīng)用廣泛，也是常見的保健食品。桂花在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，受不同環(huán)境及栽培方式等的影響，發(fā)生了豐富的遺傳變異，擁有眾多遺傳資源。根據(jù)花期、花色等性狀，通常將桂花分為四季桂、金桂、丹桂、銀桂等4個(gè)品種群，隨著長(zhǎng)期的自然雜交及人工選育，各品種群形成了豐富多樣的栽培種，迄今共記載了逾166個(gè)桂花品種[1]。貴州年平均氣溫在15.3 ℃左右，7月平均溫度22.8～30.9 ℃，1月平均溫度0 ℃以上，地處中國(guó)西南部氣候溫和，適于桂花的種植。但是，貴州桂花的品種鑒定及其開發(fā)利用尚處于滯后階段，研究其資源遺傳多樣性對(duì)遺傳改良和優(yōu)異種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。關(guān)于桂花遺傳多樣性的研究已有一些報(bào)道，但鮮有對(duì)貴州本地桂花資源的評(píng)價(jià)研究[2-5]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)貴州野生桂花分布較為集中地區(qū)的部分桂花種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性及親緣關(guān)系評(píng)價(jià)，并構(gòu)建了相應(yīng)的指紋圖譜，以期為貴州省桂花種質(zhì)創(chuàng)新、開發(fā)利用及保護(hù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

此次所試材料采集于貴州不同的地理環(huán)境，共收集了54份野生桂花資源(表1)，它們?cè)谛螒B(tài)特征上具有明顯的差異，選取其嫩葉置于保鮮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室加入液氮后置于-80 ℃冰箱中保存。

表1 供試貴州桂花種質(zhì)

序號(hào)代碼來源地序號(hào)代碼來源地序號(hào)代碼來源地1QZ1清鎮(zhèn)19KL23凱里37LB41荔波2QZ2清鎮(zhèn)20KL24凱里38LB42荔波3QZ3清鎮(zhèn)21KL25凱里39LB43荔波4QZ5清鎮(zhèn)22KL26凱里40LB44荔波5QZ6清鎮(zhèn)23KL27凱里41GD45貴定6QZ7清鎮(zhèn)24KL28凱里42GD46貴定7QZ8清鎮(zhèn)25KL29凱里43GD47貴定8QZ9清鎮(zhèn)26KL30凱里44GD48貴定9HS10惠水27KL31凱里45GD49貴定10HS11惠水28DY32都勻46GD50貴定11HS12惠水29DY33都勻47HX4花溪12HS13惠水30DY34都勻48HX20花溪13HS14惠水31TR35銅仁49HX21花溪14HS15惠水32TR36銅仁50HX22花溪15HS16惠水33ZY37遵義51HX51花溪16KY17開陽34ZY38遵義52HX52花溪17AS18安順35ZY39遵義53HX53花溪18AS19安順36ZY40遵義54HX54花溪

圖1 引物823對(duì)部分供試材料的擴(kuò)增結(jié)果

1.2 DNA的提取及檢測(cè)

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP 320，天根生化科技有限公司)提取54份樣品基因組DNA，提取步驟參照試劑盒里的說明書。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性及大致濃度，存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 PCR的擴(kuò)增及檢測(cè)

參照范付華等[6-7]的方法，稍作修改，選取UBC公司公布的ISSR引物序列，經(jīng)過篩選，選出合適的引物及每個(gè)引物的最佳退火溫度。經(jīng)優(yōu)化體系，PCR 反應(yīng)體系為10μL，含5μL Mix，0.5μL引物，3.5μL dd H2O及1μL DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，根據(jù)不同引物選擇最優(yōu)溫度復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。用含GeneGreen染料的1.8%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，上樣量為5μL，恒壓90 V，電泳50 min，之后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按分子標(biāo)記的有無記錄成二進(jìn)制數(shù)據(jù)，錄入Excel表格，具有明顯譜帶的位置記為1，無帶或帶不清晰的位置記為0。將結(jié)果導(dǎo)入POPGENE 32(Version 1.32)軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析；采用NTSYSpc 2.1軟件UPGMA聚類法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪出54份桂花材料的聚類分析樹狀圖[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR 引物PCR擴(kuò)增多態(tài)性

用篩選的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的11條ISSR引物對(duì)供試桂花材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)，共獲得93個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)80個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為86%；每個(gè)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)在5～13個(gè)之間，平均每個(gè)引物擴(kuò)增位點(diǎn)8.45個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)7.27個(gè)；可統(tǒng)計(jì)的譜帶大小主要集中在170～1 400 bp之間。其中，多態(tài)性比率達(dá)到100%的引物有814、830、891；引物810的多態(tài)性位點(diǎn)比率最低，為77%。圖1為ISSR引物823對(duì)部分供試材料的PCR擴(kuò)增圖譜。

2.2 桂花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

用POPGENE 32軟件對(duì)所有供試材料進(jìn)行分析，結(jié)果表明，桂花的平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性信息指數(shù)分別是1.989 2、1.481 3、0.291 1、0.446 5，其多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)到98.92%。對(duì)不同地理來源桂花的分析結(jié)果顯示，凱里采集地的平均觀察等位基因數(shù)為1.548 4，有效等位基因數(shù)1.310 6，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.177 8，Shannon多樣性信息指數(shù)0.268 0；荔波地區(qū)桂花平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)分別為1.376 3、1.279 7，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性信息指數(shù)分別0.155 3、0.225 6；清鎮(zhèn)桂花種質(zhì)平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性信息指數(shù)分別1.645 2、1.407 3、0.232 1、0.344 0。

表2 ISSR引物及其擴(kuò)增結(jié)果

編號(hào)引物引物序列(5’?3‘)退火溫度(℃)總位點(diǎn)數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)比率(%)1810(GA)8T53．01310772814(CT)8A52．0661003815(CT)8G51．097784823(TC)8C52．076865825(AC)8T51．0108806830(TG)8G52．0551007841(GA)8YC57．065838842(GA)8YG52．0109909844(CT)8RC54．011109110845(CT)8RG53．01198211891HVH(TG)754．055100

2.3 供試種質(zhì)的DNA指紋圖譜

根據(jù)每個(gè)供試材料的DNA擴(kuò)增圖譜中ISSR標(biāo)記位點(diǎn)條帶的有無或缺失用0和1進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，結(jié)果由0和1的排列形成數(shù)字符串，構(gòu)建數(shù)字指紋圖譜。其中，引物810和830的組合所擴(kuò)增的譜帶在不同供試材料中表現(xiàn)出明顯差異，由此建立的DNA指紋圖譜能將其完全區(qū)分開來(表3)。通過對(duì)54個(gè)桂花供試材料的ISSR擴(kuò)增帶數(shù)進(jìn)行分析，檢測(cè)到QZ 7擁有2條特異性譜帶，為引物810的750 bp和950 bp

表3 供試桂花材料的ISSR特征數(shù)字指紋

編號(hào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

注:A代表ISSR引物810，B代表引物830，編號(hào)順序與表1相同。

圖2 桂花54份供試材料的UPGMA聚類分析樹狀圖

左右的特異性條帶，這些特異性條帶可以將QZ 7從所有供試材料鑒別出來。

2.4 ISSR 遺傳相似性系數(shù)和聚類分析

54份供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.473～0.978之間，其中QZ 7與ZY 40遺傳相似系數(shù)最小，KL 26、KL 27遺傳相似性系數(shù)最大。供試材料的聚類分析樹狀圖見圖2，以遺傳相似系數(shù)0.59為閾值，可將材料分為2大類。第Ⅰ類包含53個(gè)樣本，占總供試樣本的98.14%。第Ⅱ類只有QZ 7采來的一個(gè)樣本，而且這個(gè)樣本與清鎮(zhèn)的其它樣本遺傳相似系數(shù)相差很大。

以遺傳相似系數(shù)0.69 為閾值，可把第Ⅱ類的 53個(gè)桂花品種分為3個(gè)組。其中第1組共有23個(gè)樣本，包括清鎮(zhèn)剩余全部樣本、花溪區(qū)桐木嶺方向的3個(gè)樣本、惠水的7個(gè)樣本、安順，開陽的所有樣本以及凱里市大風(fēng)洞鄉(xiāng)桐油坪村的2個(gè)樣本；其中惠水的遺傳相似系數(shù)在HS 10和HS 13 2個(gè)材料中最小，為0.68，最大的遺傳相似系數(shù)出現(xiàn)在HS 15和HS 16中，為0.839。第2組包括了貴定樣本(GD 49、GD 50)、花溪樣本(HX 51、HX 52、HX 53、HX 54)；第3組包含了凱里(KL 25、KL 26、KL 27、KL 28、KL 29、KL 30、KL 31)、遵義、都勻、銅仁、貴定(GD 45、GD 46、GD 47、GD 48)及荔波等地的24個(gè)樣本。

從遺傳相似性系數(shù)表中查找出，花溪所有供試材料中，遺傳相似系數(shù)系數(shù)最小為0.58，來自于HX 52和HX 21，最大的相似系數(shù)為0.85，在HX 51和HX 52間出現(xiàn)。荔波與遵義的桂花種質(zhì)遺傳相似系數(shù)在0.63～0.82之間。根據(jù)圖2結(jié)果顯示，從總體來看桂花的遺傳多樣性受地域及海拔的影響，相同地點(diǎn)采集的桂花樣本具有較近的親緣關(guān)系，列如KL 26、KL 27采于2棵較近的桂花樹，其相似系數(shù)達(dá)到98%。

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外已采用SRAP[9]、RAPD[10]、及SSR[11]等方法用于桂花遺傳多樣性評(píng)價(jià)和品種鑒定，但這些分子標(biāo)記存在著諸如操作復(fù)雜、開發(fā)成本高、穩(wěn)定性差等缺陷，很少用于大規(guī)模的遺傳分析。ISSR是由Zietkiewicz等基于SSR提出的可用于檢測(cè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間DNA序列差異的分子標(biāo)記[12]。ISSR擴(kuò)展產(chǎn)物多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)比RFLP、RAPD、SSR豐富，可以覆蓋被測(cè)對(duì)象更多的基因組信息，因此在種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性評(píng)價(jià)中得到廣泛應(yīng)用[5-8，13-14]。本次研究供試桂花54份材料ISSR分子標(biāo)記揭示了桂花種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性，其多態(tài)性比率為98.92%，聚類分析圖中顯示，QZ 7與另外的53個(gè)樣本的GS(相似系數(shù))遺傳差異較大，其原因?yàn)樵摌颖九c其他樣本采集距離和海拔相差較大；另外采集樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)，該樣本植株尚處開花期，完全不同于其它材料，而當(dāng)時(shí)所處月份為5月，因而判斷其為四季桂。四季桂作為一個(gè)獨(dú)特的類群，其分類地位一直引人關(guān)注。從圖3可以看出，作為實(shí)驗(yàn)中唯一能確定的四季桂個(gè)體，與其它品種群桂花遺傳差異較大，這與前人的研究結(jié)論一致[14-15]，也再次印證四季桂與秋桂類的遺傳距離較遠(yuǎn)，且穩(wěn)定可靠。地理來源相同的部分種質(zhì)資源有相對(duì)聚合的現(xiàn)象，與其親緣關(guān)系較近有關(guān)，但品種差異也是影響桂花親緣關(guān)系的一個(gè)重要因素。

種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)能為人工育種、種質(zhì)創(chuàng)新及利用提供有力的依據(jù)。遺傳多樣性的高低反映了遺傳背景的復(fù)雜程度及該物種存在的歷史遠(yuǎn)近[16]。本實(shí)驗(yàn)采用11條ISSR引物，對(duì)54份貴州野生桂花種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從分子水平上表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性，表明貴州野生桂花的生長(zhǎng)歷史長(zhǎng)遠(yuǎn)，并且具有復(fù)雜的遺傳變異。本次研究中，同一地理來源的桂花種質(zhì)沒有嚴(yán)格聚在相同的大類中，但桂花花期、葉形等形狀上表現(xiàn)有一定的趨同。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是 1) 引物數(shù)量相對(duì)較少，使得標(biāo)記位點(diǎn)和決定性狀的關(guān)鍵基因連鎖程度較低甚至不具有連鎖性； 2) 采集樣本雖來自同一地區(qū)，但所處海拔、土壤條件、坡位、氣候等環(huán)境因子的差異也可能導(dǎo)致遺傳基因的變異。另外，前期研究表明，相同品種群的桂花遺傳背景相對(duì)一致[6]，可以預(yù)判，不同地理來源但聚在相同大類的桂花種質(zhì)可能為同一品種群。因此為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的信息，需要結(jié)合多種分子、酶學(xué)及形態(tài)學(xué)標(biāo)記綜合分析。

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Genetic Diversity Analyses ofOsmanthusfragransLour.in Guizhou with ISSR Markers

LUOXianying,GUIJingfei,YANZhi,MINGYi,TIANYufeng,FANFuhua

2017-01-17

貴州大學(xué)大學(xué)生SRT計(jì)劃“貴州桂花種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析”(貴大SRT字[2015]088號(hào))。

羅仙英(1995—)，女，本科，林學(xué)專業(yè)，E-mail：1570880469@qq.com。

范付華，副教授，E-mail:fanfuhua1982@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.06.062

S 685.13

A

1001-4705(2017)06-0062-05