*劉嚴(yán)木

(四川師范大學(xué)附屬中學(xué) 四川 610000)

p53蛋白性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

*劉嚴(yán)木

(四川師范大學(xué)附屬中學(xué) 四川 610000)

p53作為關(guān)鍵腫瘤抑制蛋白參與了50%以上腫瘤的發(fā)生,本文對p53基本特性進(jìn)行了初步地分析,通過分析p53氨基酸組成、疏水性表明p53蛋白具有酸性蛋白質(zhì)、膠原蛋白、核蛋白、一些RNA結(jié)合模體等特征,整體呈現(xiàn)親水性.利用MEGA軟件進(jìn)行p53系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明人p53與日本獼猴,食蟹猴,獼猴的p53親緣關(guān)系高度相近.使用PSORT II分析工具對p53亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測,表明p53蛋白主要分布在細(xì)胞核中.使用PRABI-GERLAND算法對p53二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明18.07%為α螺旋,18.07%為β折疊,63.87%為無規(guī)則卷曲.最后,采用同源建模(比較建模)方法構(gòu)建了p53蛋白的三級結(jié)構(gòu),從建模質(zhì)量評估表明預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確.

p53蛋白;系統(tǒng)發(fā)育分析;亞細(xì)胞定位預(yù)測;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一.自1979年倫敦癌癥研究所工作的David Lane和Lionel Crawford,美國普林斯頓大學(xué)(Princeton University)的Daniel Linzer和Arnold Levine等研究小組發(fā)現(xiàn)p53基因后,對其相關(guān)研究一直在持續(xù)進(jìn)行.人們對p53基因的研究經(jīng)歷了癌蛋白抗原,癌基因到抑癌基因的認(rèn)識轉(zhuǎn)變.p53蛋白的實際分子量只有43.7kDa,因為該蛋白富含脯氨酸,所以在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗中的遷移率偏慢,于SDS凝膠電泳中測得分子量約53kDa.p53蛋白主要通過以下機(jī)制來避免癌癥發(fā)生:(1)當(dāng)DNA受損失,p53蛋白活化DNA修復(fù)蛋白以修復(fù)DNA.(2)p53蛋白能抑制細(xì)胞周期于G1/S節(jié)律點上,檢查細(xì)胞基因組的完整性,并使DNA修復(fù)蛋白有更充足時間修復(fù)DNA損傷部位.(3)若細(xì)胞DNA損傷,p53蛋白開啟細(xì)胞凋亡程序,避免細(xì)胞不正常增值.突變型p53蛋白使細(xì)胞無限生長,與腫瘤發(fā)生密切相關(guān).p53與大部分人類腫瘤有關(guān),如肝癌,乳腺癌,膀胱癌,胃癌等.在癌癥高發(fā)的當(dāng)今社會,研究p53基因及其基因產(chǎn)物無疑具有重要意義.本研究通過氨基酸組成分析,亞細(xì)胞定位預(yù)測,p53系統(tǒng)發(fā)育分析以及p53的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測對p53蛋白的序列特性與蛋白結(jié)果做了初步分析,以期對p53蛋白有更進(jìn)一步地認(rèn)識.

1.材料與方法

(1)材料

人與其它物種p53蛋白氨基酸序列

從uniprot上下載人或其它物種p53蛋白氨基酸序列(FASTA格式),以人p53蛋白序列為例:

gt;sp|P04637|P53_HUMAN Cellular tumor antigen p53 OS=Homo sapiens GN=TP53 PE=1 SV=4

MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPD DIEQWFTEDPGP

DEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYG FRLGFLHSGTAK

SVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQH MTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPY EPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEV RVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLD GEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPG

GSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD

(2)方法

①p53氨基酸組成分析

利用ProtParam進(jìn)行p53氨基酸組成分析.ProtParam允許各種物理和化學(xué)的一個給定的存儲蛋白參數(shù)計算Swiss-Prot和TrEMBL或用戶輸入的蛋白序列.計算參數(shù)包括分子量,理論等電點,氨基酸組成,原子組成,消光系數(shù),估計的半衰期,不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪總平均指數(shù)和親水性.

②系統(tǒng)發(fā)育分析(分子進(jìn)化分析)

使用MEGA(版本5.2)軟件進(jìn)行p53系統(tǒng)發(fā)育分析.MEGA是一款可以根據(jù)所提供的氨基酸序列,分析在物種進(jìn)化過程中物種的親緣關(guān)系的一種算法,并將結(jié)果以進(jìn)化樹的形式呈現(xiàn),是目前最為常用的系統(tǒng)發(fā)育分析軟件之一.

③亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用PSORT II分析工具對p53亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測.PSORT II從氨基酸序列預(yù)測亞細(xì)胞定位.它將動物蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞骨架,細(xì)胞核,細(xì)胞膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體,溶酶體,線粒體,等細(xì)胞結(jié)構(gòu).

④p53蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

⑤p53蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

進(jìn)行p53三級結(jié)構(gòu)預(yù)測將利用SWISS-MODEL.SWISSMODEL是一個完全自動化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模服務(wù)器,采用同源建模(比較建模)方法構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)果.該方法包括:A.搜索與目標(biāo)蛋白序列相似的模板蛋白;B.BLAST搜索;C.目標(biāo)序列與模板序列比對;D.ClustalW/X;E.建立骨架(將模板結(jié)構(gòu)疊加起來,找結(jié)構(gòu)保守區(qū)域).

2.結(jié)果與分析

(1)氨基酸組成分析

圖1 p53蛋白氨基酸組成分析結(jié)果

氨基酸組成分析:占比大于5.0%,即含量高于平均值的有丙氨酸(Ala,A),天冬氨酸(Asp,D),谷氨酸(Glu,E),甘氨酸(Gly,G),賴氨酸(Lys,K),亮氨酸(Leu,L),脯氨酸(Pro,P),精氨酸(Arg,R),絲氨酸(Ser,S),蘇氨酸(Thr,T).最高為脯氨酸(Pro,P),占比11.45%,最低為色氨酸(Trp,W),占比1.02%.

根據(jù)特定高含量氨基酸對應(yīng)蛋白質(zhì)的類型,推斷該蛋白質(zhì)具有以下特點:

①酸性蛋白質(zhì).因為D,E含量較高;

②膠原蛋白.因為G含量較高;

③核蛋白.因為K,R含量較高;

差異化教學(xué)是根據(jù)學(xué)生的特點、興趣和天賦的不同，有針對性的制定人才培養(yǎng)計劃，每個學(xué)生都有符合自身特點的教學(xué)安排。通過這些安排，教師有目的、有計劃、有組織地引導(dǎo)學(xué)生積極自覺地學(xué)習(xí)，使得學(xué)生在自己最適合的方向快速成長，才能迅速提高，成為能夠很好適應(yīng)社會的人才。

④一些RNA結(jié)合模體,因為S,R含量較高;

⑤黏蛋白,寡聚糖結(jié)合位點,因為S,T含量較高.

(2)疏水性分析

圖2 p53蛋白疏水性曲線

橫軸表示氨基酸位點,縱軸表示疏水性值.

藍(lán)色線條表示疏水性參考線,藍(lán)線上方表示疏水,下方表示親水.

據(jù)圖可知,p53蛋白約有4個疏水性區(qū)域,氨基酸呈疏水性對應(yīng)區(qū)域分別約為20-40位,70-90位,110-150位,250-260位.其余均為親水性區(qū)域,其中280-310區(qū)間呈現(xiàn)顯著的親水性.總體分析來看,因為p53蛋白多數(shù)曲線位于藍(lán)線下方,即p53蛋白總體呈現(xiàn)親水性.

(3)系統(tǒng)發(fā)育分析(進(jìn)化分析)

圖3 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

接著,我們想了解p53蛋白在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系是怎樣的,為此我們做了p53系統(tǒng)發(fā)育分析.最大進(jìn)化樹根據(jù)親緣關(guān)系將不同物種進(jìn)行分類,每個大類下還有相應(yīng)小類.數(shù)值越大表明預(yù)測的親緣關(guān)系越可靠.本次的材料選用了家貓(Felis catus)、家犬(Canis lupus familiaris)、馬(Equus caballus)、白鯨(Delphinapterus leucas)、牛(Bos taurus)、野豬(Sus scrofa)、樹鼩(Tupaia belangeri)、智人(Homo sapiens)、日本獼猴(Macaca fuscata)、食蟹猴(Macaca fascicularis)、獼猴(Macaca mulatta)、灰倉鼠(Cricetulus griseus)、小鼠(Mus musculus)以及大鼠(Rattus norvegicus)的p53蛋白序列.

據(jù)上圖分析,最大進(jìn)化樹一共有11種分類(包括大分類和小分類).其中灰倉鼠,小鼠,大鼠的親緣關(guān)系高度相近.日本獼猴,食蟹猴,獼猴的親緣關(guān)系高度相近.人與日本獼猴,食蟹猴,獼猴的親緣關(guān)系高度相近,推測是因為人是由靈長類動物進(jìn)化而來所有保留高度的相似性.白鯨,牛,豬的值小于50,證明三者的親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn).

(4)亞細(xì)胞定位預(yù)測

PSORT II部分運行結(jié)果顯示p53蛋白有91.3%為細(xì)胞核,4.3%為細(xì)胞骨架,4.3%為囊泡分泌系統(tǒng).這說明p53蛋白絕大多數(shù)在細(xì)胞核中,這與多數(shù)情況p53與DNA結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)功能有關(guān).

(5)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 二級結(jié)構(gòu)類型及含量.藍(lán)色表示α螺旋,紅色表示擴(kuò)展鏈,紫色表示無規(guī)則卷曲

從上述結(jié)果可以知曉,p53蛋白18.07%為α螺旋,18.07%為β折疊,63.87%為無規(guī)則卷曲.其中無規(guī)則卷曲占絕大多數(shù).

圖5 各位點氨基酸為α螺旋,擴(kuò)展鏈,無規(guī)則卷曲的概率.

(6)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

選用SWISS-MODEL提供的MODEL 01(此模板為p53-DNA結(jié)合的三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)),通過同源模建方法對p53蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測.3D結(jié)構(gòu)如下:

圖6 p53蛋白用SWISS-MODEL分析后不同模型類型以及不同顯示方式展示

圖7 建模質(zhì)量評估.橫坐標(biāo)表示氨基酸位點,縱坐標(biāo)表示預(yù)測局部與靶標(biāo)的相似性.

從圖7可以看出,SWISS-MODEL對p53蛋白的約90-280個氨基酸與模板的相似性較高,從而說明這一預(yù)測區(qū)間較為準(zhǔn)確,300-320區(qū)間由于與模板的序列差異較大,從而相對預(yù)測準(zhǔn)確性偏低.從全局模型質(zhì)量評估(GMQE)數(shù)值來看(值為0.60),說明整體模型預(yù)測分析較準(zhǔn)確.

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劉嚴(yán)木(2000-),男,四川師范大學(xué)附屬中學(xué);研究方向:生物科學(xué).

Properties and Structure Analysis of p53 Protein

Liu Yanmu
(Affiliated High School of Sichuan Normal University, Sichuan, 610000)

p53, as a key tumor suppressor protein, is involved in the occurrence of more than 50 % of tumor. This paper makes a preliminary analysis of the basic characteristics of p53 and through the analysis of p53 amino acid composition and hydrophobicity, the results indicate that p53 protein has the feature of acidic protein, collagen, nuclear protein, some RNA binding motifs and it presents hydrophilic as a whole. Using the MEGA software to make the phylogenetic analysis of p53, the results show that it has a close genetic relationship with the p53 of Japanese macaques, crab monkeys and rhesus monkeys. Using PSORT II analysis tool to predict p53 subcellular localization, it showed that p53 protein was mainly distributed in the nucleus. Using the PRABI-GERLAND algorithm to predict p53 secondary structure, the results show that 18.07% present alpha helix, 18.07%present beta folding, and 63.87% present random coil. Finally, the three-level structure of p53 protein was constructed by homologous modeling(comparative modeling) method, and the prediction results were indicated to be accurate from the modeling quality assessment.

p53 protein;phylogenetic analysis;subcellular localization prediction;secondary structure prediction;tertiary structure prediction

O

A