向云鳳 宋惠玲 茍恩進 李 青 顧勝利 韓 允 湯正珍 黃 波

腸道病毒71型VP1抗原表位多肽疫苗的實驗研究

向云鳳1宋惠玲1茍恩進1李 青2顧勝利2韓 允2湯正珍2黃 波2

目的 根據(jù)貴州省手足口病患兒腸道病毒71型(EV71)分離株的VP1結構蛋白序列研制多肽疫苗并研究其對小鼠的免疫保護作用。方法 2013年3月1日至2015年12月31日從貴州省手足口病患兒的咽拭子樣本中分離到17株EV71毒株，其VP1氨基酸序列一致(共297個氨基酸)，據(jù)此設計并合成多肽片段(除最后一段為27個氨基酸外，其余均為20個氨基酸)；用感染EV71的手足口病病愈患兒的陽性血清，通過間接ELISA法篩選出免疫原性較好的多肽片段，制成多肽疫苗；用多肽疫苗免疫ICR健康雌鼠，并設未免疫的對照(Con)；將雌鼠的子代小鼠隨機分為注射和不注射EV71病毒顆粒的2個亞組；注射病毒2 d后處死所有小鼠，分別取小鼠的骨骼肌、小腸和腦組織，通過RT-PCR檢測病毒感染情況，同時HE染色后在顯微鏡下觀察病理改變。結果 共設計并合成19段含交叉序列的多肽片段，從中篩選出3段免疫原性較好的(P2：VSRALTHALPAPTGQNTQVS；P4：ALQAAEIGASSNASDESMIE；P8：YANWDIDITGYAQMRRKVEL)， 制成多肽疫苗并免疫雌鼠，取雌鼠的子代小鼠進行后續(xù)試驗。RT-PCR結果顯示，各感染病毒亞組的骨骼肌、小腸和腦組織中均能檢測到EV71病毒，而未感染病毒亞組均檢測不到；病理結果顯示，未接種多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后，骨骼肌、小腸和腦組織均出現(xiàn)明顯的炎性改變；接種多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小腸和腦組織的炎性改變明顯減輕，3種多肽疫苗對EV71所致炎癥的改善作用無明顯差異；接種多肽疫苗母鼠的未注射病毒亞組子代小鼠骨骼肌、小腸和腦組織中均未檢測到EV71病毒，也未觀察到明顯的炎性改變。結論 本研究成功制備VP1抗原表位多肽疫苗并在動物實驗中證實了其有效性和安全性，可為今后相關疫苗的研制提供方法學借鑒。

手足口?。?腸道病毒EV71； 結構蛋白VP1； 多肽疫苗； 貴州

臨床上尚無治療手足口病的特異性藥物, 以對癥支持治療為主。腸道病毒71型(EV71) 是手足口病常見病原體。EV71滅活疫苗(2015年獲批)的Ⅲ期臨床試驗結果顯示其預防EV71引起的手足口病的保護率分別為90%和80%以上[1-3]。然而，EV71的分子流行病學研究表明[4]，EV71基因突變發(fā)生頻繁，具有遺傳多樣性。

EV71的結構蛋白VP1暴露于病毒表面，是重要的抗原表位，為中和抗體結合位點，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，故以VP1為主體的疫苗可能有很好的免疫原性。貴州省遵義市第一人民醫(yī)院2013年3月1日至2015年12月31日從全省手足口病患兒的咽拭子樣本中共分離到17株EV71毒株，比對發(fā)現(xiàn)其VP1氨基酸序列一致。本研究擬根據(jù)該段VP1的氨基酸序列設計不同的多肽片段，篩選出免疫原性較好的制成VP1抗原表位多肽疫苗，研究其對小鼠的免疫保護作用，從而為研制對貴州地區(qū)手足口病更有針對性的EV71新型疫苗提供方法。

1 方法

1.1 VP1多肽片段的設計合成 根據(jù)VP1氨基酸序列設計并合成含交叉序列的多肽片段，每段多肽片段由15個氨基酸加下游的5個氨基酸構成共20個氨基酸的多肽序列，最后一段共27個氨基酸。多肽片段的合成由重慶WesternBiotechnology公司完成。

1.2 EV71感染手足口病病愈患兒IgG陽性血清的篩選 分離EV71病毒株時收集同期證實為EV71感染且處于恢復期不同時間的手足口病病愈患兒血清，采用人腸道病毒71型IgG抗體ELISA試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)檢測血清抗EV71的IgG抗體，篩選顯色最深即抗體濃度最高的血清進行后續(xù)實驗。

1.3 VP1多肽片段的篩選 將1.1中設計合成的多肽片段包被固相載體ELISA板，每條多肽設4個重復孔，加入1.2中篩選得到的EV71感染手足口病病愈患兒的陽性血清，4個重復孔中的血清濃度梯度依次為1∶100、1∶200、1∶400和1∶800，37℃孵育1 h，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(北京索萊寶科技有限公司，貨號：SE101)，37℃孵育1 h，底物顯色后測定吸光度，篩選出免疫原性較好(OD值較高且數(shù)值具有較好梯度)的多肽片段。

1.4 多肽疫苗免疫方法及效果判斷 本研究中6～8周齡ICR健康雌鼠和雄鼠購自北京華阜康生物科技股份有限責任公司。①將1.3中篩選出的多肽分別用0.9%氯化鈉溶液溶解，終濃度為1 mg·mL-1，再與同體積的弗氏完全佐劑混合，制成多肽疫苗。②將多肽疫苗0.1 mL經(jīng)腹腔注射6～8周齡ICR健康雌鼠，每種多肽疫苗接種4只雌鼠，1周后重復免疫1次，并設置對照(不接種疫苗，4只雌鼠)。③將接種疫苗和不接種疫苗的雌鼠分別與雄鼠合籠。④從各多肽疫苗免疫和不疫苗雌鼠的子代小鼠中取32只，隨機分為2個亞組(各16只)，1個亞組出生后立即予腹腔注射5×107TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)的EV71病毒顆粒(前期實驗分離純化的EV71病毒經(jīng)過感染RD細胞培養(yǎng)增殖后獲取)，另1個亞組不注射病毒。⑤注射病毒2 d后全部處死2個亞組小鼠，分別取小鼠的骨骼肌、小腸和腦組織各2份。1份標本抽提RNA后行RT-PCR[寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的試劑盒]檢測病毒感染的情況，EV71的PCR引物序列如下，F(xiàn)：5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’，R：5’-ACCCAWAGTAGTCGGTTCCGC-3’；另1份標本經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察病理改變。

2 結果

2.1 VP1多肽片段的合成及篩選 設計并合成19段含交叉序列的多肽片段P1～19，序列詳見表1。

表1 19段多肽片段的氨基酸序列

任意選擇在EV71監(jiān)測時段的手足口病恢復期不同時間的6例患兒血清，ELISA檢測顯示感染后第19天患兒血清中IgG抗體濃度最高。以此IgG陽性血清通過間接ELISA法共篩選到3段免疫原性較好的多肽片段，分別為P2、P4和P8，其在VP1氨基酸序列中的相應位置分別為16～35、46～65、106～125。

2.2 雌鼠接種VP1多肽疫苗后對新生小鼠感染EV71的免疫保護作用 以P2、P4和P8多肽片段制成多肽疫苗并免疫雌鼠，同時設立未免疫的對照，子代小鼠相應地表示為P2、P4、P8和對照組(Con)，各組小鼠均再分為感染病毒亞組(v)和未感染病毒亞組(u)，以EV71引物行RT-PCR，圖1顯示，感染病毒亞組小鼠的骨骼肌、小腸和腦組織中均檢測到EV71病毒，未感染病毒亞組小鼠均未檢測到。

骨骼肌病理觀察結果(圖2)：未感染病毒亞組(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)小鼠骨骼肌肌纖維形狀較為一致，大小均勻，肌細胞無明顯病變。感染病毒亞組(E～I)小鼠骨骼肌肌纖維均出現(xiàn)不同程度的骨骼肌炎癥改變，其中Con-圖2E和F病變最重，可見部分肌纖維腫脹、萎縮、斷裂、橫紋消失，間質(zhì)灶狀出血，局部散在淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞浸潤；P2-G、P4-H和P8-I 小鼠骨骼肌病理改變較Con輕，僅見少數(shù)肌纖維萎縮；P2、P4和P8之間相互比較，病變程度未見明顯差異。

小腸病理觀察結果(圖3)：未感染病毒亞組小鼠小腸組織未見明顯病理改變(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)。感染病毒亞組小鼠小腸組織均出現(xiàn)不同程度的病理改變，其中Con-E和F病變最重，可見小腸黏膜出血，伴少量中性粒細胞浸潤，腸黏膜上皮及腺上皮細胞部分腫脹，空泡變性明顯；P2-G、P4-H和P8-I小鼠腸組織病理改變較Con輕，僅可見腸黏膜上皮及腺上皮細胞部分腫脹，部分空泡變性；P2、P4和P8組間比較，病變程度未見明顯差異。

圖1各組小鼠骨骼肌、小腸和腦組織的EV71病毒核酸PCR檢測結果

注 采用瓊脂糖凝膠電泳，1～8分別代表P2-v、P2-u、P4-v、P4-u、P8-v、P8-u、Con-v和Con-u組，M:分子量標志物。用本文EV71引物經(jīng)RT-PCR擴增后目的條帶為508 bp

圖2各組小鼠骨骼肌病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分別為未感染病毒亞組P2、P4、P8和Con，未見明顯病變。感染病毒亞組中，E、F為Con，骨骼肌部分肌纖維腫脹(上箭頭)、萎縮(下箭頭)，局部散在淋巴細胞和單核細胞浸潤(左箭頭)，間質(zhì)灶狀出血(右箭頭)；G、H和I分別為P2、P4和P8，均可見少數(shù)肌纖維萎縮，組間無明顯差異

圖3各組小鼠小腸組織病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分別為未感染病毒亞組P2、P4、P8和Con，未見明顯病變。感染病毒亞組中，E、F為Con，小腸黏膜組織部分腫脹(右箭頭)、空泡變性(下箭頭)，黏膜伴中性粒細胞浸潤(上箭頭)，黏膜出血(左箭頭)；G、H和I分別為P2、P4和P8，均可見少量小腸黏膜上皮腫脹、空泡變性，組間無明顯差異

腦組織病理觀察結果(圖4)：未感染病毒亞組小鼠腦組織細胞大小正常，染色均勻，未見明顯病理改變(P2-A、P4-B、P8-C、Con-D)。感染病毒亞組小鼠腦組織均出現(xiàn)不同程度的病理改變，其中Con-E病變最重，可見腦組織明顯水腫，部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞漿腫脹、核偏位等變性和壞死；P2-F、P4-G和P8-H小鼠腦組織病變較Con輕，可見腦組織輕度水腫，少數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)胞漿腫脹、核偏位等變性；P2、P4和P8組間相互比較，病變程度未見明顯差異。

圖4各組小鼠腦組織病理切片(HE，×400)

注 A、B、C、D分別為未感染病毒亞組P2、P4、P8和Con，未見明顯病變。感染病毒亞組中，E為Con，腦組織明顯水腫，部分神經(jīng)元胞漿腫脹、核偏位等變性(右箭頭)及壞死(下箭頭)；F、G、H分別為P2、P4和P8，均可見少數(shù)神經(jīng)元胞漿腫脹、核偏位，組間無明顯差異。

3 討論

EV71是引起手足口病的主要感染病原。少數(shù)手足口病患兒可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎和急性遲緩性麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)病變，嚴重者導致腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫甚至死亡，這類患兒即使存活也常留有不可逆的后遺癥，嚴重威脅兒童的健康。在目前缺乏特異性抗病毒藥物治療手足口病的情況下，開展EV71疫苗相關研究對有效控制手足口病疫情至關重要。

目前，國內(nèi)唯一投入臨床使用的EV71疫苗是滅活疫苗，通過將C4亞型EV71毒株(FY-23K-B)接種于人二倍體細胞，經(jīng)培養(yǎng)、病毒收獲、滅活和純化后，加入氫氧化鋁佐劑和甘氨酸穩(wěn)定劑制成[5]。本課題組前期對貴州省各地區(qū)的EV71分離株進行遺傳進化分析表明，貴州地區(qū)流行的EV71基因型與國內(nèi)其他地區(qū)流行的EV71基因型一致，均屬于C4a亞型，故國內(nèi)已投入使用的疫苗對預防貴州省EV71型手足口病預防是是有效的。但是，我們同時發(fā)現(xiàn)，EV71病毒基因組存在堿基突變的情況。有研究表明，EV71基因具有變異快速的特點，年進化率約為1.35×10-2/核苷酸[6]。也有研究表明EV71存在基因重組現(xiàn)象[7]。一旦EV71重組病毒獲得進化優(yōu)勢，就會成為新的主導類型，可能導致新型手足口病病毒感染呈聚集性爆發(fā)，屆時現(xiàn)有EV71滅活疫苗的免疫效能可能會降低。因此，研發(fā)EV1新型疫苗十分重要。

VP1是EV71病毒的主要抗原決定簇之一。目前，國內(nèi)外已有多位學者對EV71 VP1亞單位疫苗進行了相關研究。Foo等[8]利用VP1區(qū)域合成多條多肽片段免疫小鼠，并進行血清中和抗體檢測，發(fā)現(xiàn)某些片段能較好地刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體。Chang等[9]用EV71毒株免疫小鼠，篩選出具有中和活性的單克隆抗體，用合成的VP1多肽片段進行體外單抗中和表位檢測，發(fā)現(xiàn)中和單抗能與VP1某些區(qū)域特異性結合。

本研究根據(jù)貴州省EV71分離株的VP1氨基酸序列設計并合成19條多肽片段，用EV71感染手足口病病愈患兒的陽性血清篩選出3段免疫原性較好的片段，制成多肽疫苗后免疫雌鼠，待小鼠出生后腹腔注EV71病毒顆粒，通過觀察小鼠骨骼肌、小腸和腦組織的病理改變研究多肽疫苗免疫雌鼠后對小鼠的保護作用。結果表明，未接種多肽疫苗母鼠的子代小鼠在感染EV71病毒后，骨骼肌、小腸和腦組織均出現(xiàn)明顯的炎性改變；接種多肽疫苗母鼠的子代小鼠骨骼肌、小腸和腦組織的炎性改變明顯減輕，表明用本研究研制的VP1多肽疫苗免疫母鼠后對小鼠有較好的免疫保護作用。3種多肽疫苗對EV71感染引起的炎癥的改善作用無明顯差異，表明篩選出的3段多肽片段均有較好的免疫原性。同時，單純接種3種多肽疫苗的小鼠骨骼肌、小腸和腦組織中均未檢測出EV71病毒，也未見明顯的炎性改變，證實了VP1抗原表位多肽疫苗的安全性。本研究采用EV71感染患兒的陽性血清來篩選多肽片段，此方法篩選出的多肽片段可能具有更好的代表性，更能有效地刺激人體產(chǎn)生中和抗體。

與滅活疫苗相比，抗原表位多肽疫苗具有以下優(yōu)勢：①更適用于應對EV71病毒的變異；②能達到快速、高效生產(chǎn)的要求, 降低疫苗制作的成本；③疫苗中無完整的病毒結構, 安全性較高。本研究成功制備VP1抗原表位多肽疫苗并在動物實驗中證實了其有效性和安全性，可為今后相關疫苗的研制提供方法學借鑒。

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2017-09-01

2017-09-19)

(本文編輯：孫晉楓)

ExperimentalstudyoftheepitopepeptidevaccineagainstthestructuralproteinVP1ofenterovirus71strain

XIANGYun-feng1,SONGHui-ling1,GOUEn-jin1,LIQing2,GUSheng-li2,HANYun2,TANGZheng-zhen2,HUANGBo2

(1GraduateSchoolofZunyiMedicalCollege,Zunyi, 563000，China; 2DepartmentofPediatrics,TheThirdAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi563000，China)

HUANG Bo, E-mail: 672879381@qq.com

ObjectiveTo make the epitope peptide vaccine by using the structural protein VP1 of enterovirus 71 (EV71) strain isolated from Guizhou area and investigate the immune protective effects on mice.MethodsThe VP1 amino acid sequences of 17 EV71 strains isolated from throat swab samples of children patients with hand-foot-mouth disease between March 1, 2013 and December 31, 2015 in Guizhou area were consistent(a total of 297 amino acids). Peptide fragments were designed and synthesized by using the amino acid sequence, that the last one was 27 amino acids, the others were 20 amino acids. The epitope peptide vaccine was made by using the polypeptide fragments with better immunogenicity, which was screened out by indirect ELISA method and IgG positive serum of children who recovered from EV71 infection. Then the epitope peptide vaccine was used to protect healthy ICR female rats and the control group was set that female rats weren't inoculated (con). The neonatal rats were randomly divided into 2 subgroups of injected and non injected EV71 virus. The mice were killed 2 days after injection of the virus, then the tissue was harvested from the skeletal muscle, the small intestine and brain of all neonatal rats which was used to check EV71 virus by RT-PCR and agarose gel electrophoresis and observed the pathological lesion by Hamp;E.Results3 peptide vaccines were made by using polypeptide fragments with better immunogenicity screened from 19 segments polypeptide fragments with cross sequences. The female mice were immunized by using the peptide vaccines and the subsequent experiments were carried out in neonatal rats. RT-PCR results showed that EV71 virus could be detected in infected groups, could not be detected in uninfected groups. The pathological lesion showed that skeletal muscle, intestine and brain tissue had obvious inflammatory changes in the neonatal rats infected with EV71 virus but the female mice weren't immunized. Inflammatory changes were significantly alleviated in the neonatal rats infected with EV71 virus and the female mice were immunized, there was no significant difference in each tissue between the three vaccinated groups. No obvious inflammatory lesion was found in each tissue of the neonatal rats which didn't infected with EV71 virus and the female mice were immunized.ConclusionIn our study, VP1 epitope peptide vaccine was successfully prepared, and its efficacy and safety were confirmed in animal experiments, it can provide methodological reference for the development of related vaccines in the future.

hand-foot-mouth disease; enterovirusEV71; VP1; Epitope peptide vaccine; Guizhou

國家自然科學基金項目：81260292；遵義市科技局科技計劃基金項目：遵市科合社字【2013】14號；遵義市科學技術基金項目遵市科合人才【2015】24號；遵義市“15851人才精英工程”培養(yǎng)人才在研項目經(jīng)費資助項目：2013-20

1 遵義醫(yī)學院研究生院 貴州遵義，563000；2 遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學科 貴州遵義，563000

黃波，E-mail:672879381@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.05.013