， ， ， ， ， ， ， (.貴州省旱糧研究所， 貴陽550006； .貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽 55005；.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院麥作研究中心， 貴陽 55005； .貴州省植保研究所， 貴陽 550006)

藍粒小麥育種衍生材料染色體的C帶檢測

隋建樞1，姚躍坤2，胡梅3，張素勤3，辛智海2，王偉1，陳天青1，何慶才4
(1.貴州省旱糧研究所， 貴陽550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院麥作研究中心， 貴陽 550025； 4.貴州省植保研究所， 貴陽 550006)

本研究應(yīng)用改良的C-帶技術(shù)，對供試藍粒小麥衍生后代11個株系共94個單株進行了分析檢測，結(jié)果表明：94個單株中有25個單株檢測到了長穗偃麥草的4 Ag染色體，導(dǎo)入率為26.60%。本研究結(jié)果可為藍粒小麥育種后代的選育提供理論參考。

藍粒小麥； 衍生材料； C-帶

藍粒小麥是1976年從長穗偃麥草(AgropyronelongatumL，10x=70)與普通小麥(Triticumaestivum，6x=42)復(fù)合雜交后代中選育出來的。李振聲研究證明，藍粒小麥籽粒的藍色色素存在于胚乳細胞的糊粉層中，藍粒小麥的形成是由于含有控制藍色色素生物合成基因的1對長穗偃麥草染色體取代了1對小麥染色體從而進入到普通小麥中[1]；穆素梅等進一步研究證明，長穗偃麥草的4 E染色體攜有藍色糊粉層基因，是由1對長穗偃麥草染色體4 Ag代換了小麥染色體4 D所形成的[2]。Li Z S等經(jīng)過連鎖遺傳分析發(fā)現(xiàn)，粗桿、寬葉、直葉、深綠色及半冬性等許多農(nóng)藝性狀與藍色胚乳性狀密切相關(guān)，且隨著含有藍色胚乳基因染色體數(shù)量的不同而呈現(xiàn)出相應(yīng)的劑量效應(yīng)[3]。

植物染色體的C-帶技術(shù)始于Pardue和Gall觀察到將小鼠染色體與隨體DNA進行原位雜交后，經(jīng)Giemsa染色，著絲粒區(qū)染色很深[4]。Arrighi和徐道覺在此基礎(chǔ)上建立了C-帶技術(shù)[5]。最早將C帶技術(shù)應(yīng)用于小麥染色體鑒定開始于1974年，經(jīng)歷了40多年的發(fā)展，這項技術(shù)在小麥染色體鑒定中獲得了越來越多學(xué)者的認可，并在小麥育種中得到了較為廣泛的應(yīng)用[6]。趙燕麗等[7]用改良的Giemsa C-帶技術(shù)對10個經(jīng)輻射處理的帶有黑麥某些性狀的普通小麥品系進行鑒定，結(jié)果鑒定出1個小麥-黑麥易位系及2個小麥-黑麥異代換系。亓增軍等[8]為改進小麥-黑麥1 RS·1 BL易位系的抗病性，利用染色體C-帶技術(shù)從1 RS·1 BL與6 VS·6 AL易位系雜交后代F2中，鑒定出小麥-黑麥-簇毛麥雙重易位純合體1 RS·1 BL,6 VS·6 AL(2n=42)。

本研究利用染色體C-分帶技術(shù)，對長穗偃麥草和普通小麥遠緣雜交穩(wěn)定后代株系進行染色體帶型分析，以明確控制藍色色素合成的基因，即4 Ag染色體是否成功導(dǎo)入。結(jié)果可為該優(yōu)良種質(zhì)在小麥遺傳育種中的合理應(yīng)用及深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用的材料為藍粒小麥(普通小麥(TriticumaestivumL.，6x=42)×長穗偃麥草(AgropyronelongatumL.，10x=70))衍生后代的種子，11個株系共94個單株，由貴州省農(nóng)科院旱糧研究所引進并重組獲得。

1.2 方 法

本研究采用的酶解滴片法參照Gill等[9]的方法改良C-帶技術(shù)。

1.2.1 酶解滴片

1) 前期處理：選取籽粒飽滿的種子放在潔凈的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫箱中發(fā)芽，待胚根長到3～4 cm時，剪取胚根，放入管蓋打孔且噴有ddH2O的離心管中，將離心管放入笑氣罐中處理2 h后，將胚根取出用濾紙吸干表面水分后，置于90%乙酸溶液中固定5 min，取出胚根用濾紙吸干表面水分后，再用蒸餾水洗滌2～3次。

2) 酶解：用刀片切取1～2 mm根尖放入裝有纖維素果膠酶的離心管中，離心20 s后放入37 ℃恒溫水浴鍋中水浴50 min，將酶解好的根尖用70%乙醇溶液反復(fù)清洗2次，離心管留約1/4乙醇，針尖搗碎，直至無懸浮顆粒。

3)滴片：將搗碎的溶液2 000 r/min離心15 s，棄上清，晾干，再加入30μL無水乙酸，用移液槍輕輕吹打。吸取8μL液體滴于載玻片上(載玻片放于25 ℃保濕盒中備用)，放于保濕盒中保濕約5 min后取出，顯微鏡下觀察，記錄，將符合要求的載玻片置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 C-帶分析

將載玻片置于交聯(lián)儀中1.25 MHz交聯(lián)2次，放入60 ℃的0.2 mmol/L HCl中處理1.5 min，用dH2O洗凈吹干；轉(zhuǎn)移至飽和Ba(OH)2溶液中，室溫處理6.5 min，再用dH2O洗凈吹干，置于60 ℃的2×SSC溶液中處理60 min；最后將載玻片轉(zhuǎn)移到pH=6.8的2.5% Giemsa染液中，染色至符合試驗要求，用dH2O洗凈吹干。將載玻片置于OLMPUS BX 60顯微鏡下觀察，用Cellsens Standard攝像系統(tǒng)記錄分裂相好的細胞[10]。

C-帶染色體區(qū)分參考P.P.Jauhar[11]的長穗偃麥草小麥4 Ag染色體C-帶帶型。

圖1 長穗偃麥草4 Ag染色體C-帶標準帶型

表1 供試藍粒小麥衍生材料染色體C-帶檢測結(jié)果

株系名稱供試單株數(shù)量含有4Ag單株數(shù)量導(dǎo)入率(%) 黔09197F694 黔09203F683 黔09206F610 黔9504/0147F661 黔0147/MY2002F671 黔0147/05中27F620 B?6228 B?11208 B?37111 B?35530 B?44250 總計942526．60

2 結(jié)果與分析

本研究所檢測的是代換了普通小麥4 D染色體的長穗偃麥草4 Ag染色體，圖1為其標準帶型。從圖1可以看出，含有4條帶，分別為2條端帶(T)，1條著絲點帶(C)和1條中間帶(I)。

圖2 供試藍粒小麥衍生材料染色體C-帶帶型

通過對50個根尖細胞染色體的觀察發(fā)現(xiàn)，藍粒小麥衍生材料的染色體數(shù)目為2x=6n=42。與標準帶型作對比，可以看到，圖2(A)中箭頭所標注的就是代換的長穗偃麥草4 Ag染色體，而圖2(B)中沒有找到與之相符的染色體。供試材料中，有11個株系，共94個單株，其中有25個單株檢測到了長穗偃麥草的4 Ag染色體，導(dǎo)入率為26.60%(表1)。

3 討 論

通過染色體C-帶技術(shù)，在供試的94個單株中，25個單株檢測到了長穗偃麥草的4 Ag染色體，為藍粒小麥育種后代的篩選提供了參考，也為藍粒小麥育種材料的深入研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。目前由于絕大多數(shù)異代換系的外源染色體補償能力差或帶有不良基因等諸多不足，使其在小麥生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了限制。為了提高異代換系的利用價值，選育異代換系的受體材料應(yīng)選用遺傳基礎(chǔ)豐富、綜合性狀優(yōu)良的小麥品種[12]。此外，通過建立更為經(jīng)濟、高效鑒定異代換系的技術(shù)規(guī)范，可以大大提高異代換系選育效率。

由于藍色籽粒小麥屬異代換系，育種世代常單體、缺體出現(xiàn)的頻率較高，且早代單體與二體代換系的粒色很難區(qū)分，選擇時二體代換系極容易丟失，要選育出一個綜合性狀好與穩(wěn)定二體代換系非常不容易，花費的時間太長，對加快藍粒小麥的應(yīng)用非常不利。染色體的C-帶技術(shù)，由于它快速、精確及經(jīng)濟的特點，是一種被普遍采用的鑒定外源染色體附加系、代換系或易位系的有效方法[7]。C-帶技術(shù)也有自身的局限性，雖然本研究采用的改良C-帶技術(shù)大大縮短了制片時間，但是仍沒有克服分帶的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和制片成功率都很低的缺點。因此，對于帶紋特征不明顯的染色體，還需結(jié)合熒光原位雜交等其它技術(shù)方法進一步研究鑒定。

隨著染色體分帶、原位雜交和分子標記等檢測技術(shù)的發(fā)展，更多、更好、更準確的分析手段，將運用到作物育種中，改變傳統(tǒng)育種方式，使人們從中受益。

[1]李振聲.小麥遠緣雜交[M].北京:科學(xué)出版社,1985.

[2]穆素梅,李振聲,周漢平,等.藍粒小麥的細胞學(xué)鑒定[J].遺傳學(xué)報,1986,3(4):259-261.

[3]Li Z S,Mu S M,Jiang L X,et al.cytogenetic study of blue-grained wheat[J].Zeitschrift fur Pflanzenzuchtung=Journal of plant breeding,1983,90:265-272.

[4]Pardue M L,Gall J G.Chromosomal localization of mouse satellite DNA.[J].Science,1970,168(3 937):1 356-1 358.

[5]Arrighi F E,Hsu T C.Localization of heterochromatin in human chromosomes.[J].Cytogenetics,1971,10(2):81-6.

[6]溫海霞,陶瀾,戴秀梅.植物染色C-顯帶技術(shù)及其在小麥育種中的應(yīng)用研究進展[J].種子,2002,21(6):40-42.

[7]趙燕麗,王占斌,李集臨,等.染色體C-帶在小麥-黑麥易位系和代換系鑒定中的作用[J].植物研究,2006,26(3):333-336.

[8]亓增軍,劉大鈞.利用染色體C-分帶和雙色熒光原位雜交技術(shù)鑒定普通小麥-黑麥-簇毛麥雙重易位系1 RS·1 BL，6 VS·6 AL[J].Journal of Genetics s amp; s genomics,2001,28(3):267-273.

[9]B.S.Gill,B.Friebe,T.R.Endo.Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosome bands.Genome,1991,34:830-839.

[10]胡梅,安洪周,李鵬飛,等.提莫菲維小麥染色體的C-帶分析[J].種子,2015,34(1):1-5.

[11]P.P.Jauhar.Multidisciplinary approach to genome analysis in the diploid species,ThinopyrumbessarabicumandTh.Elongatum(Lophopyrumelongatum),of the Triticeae[J].Theor Appl Genet,1990,80:523-536.

[12]李萍,王黎明,李本,等.小麥異代換系的選育及其應(yīng)用研究進展[J].Journal of Anhui Agriculturalences,2007,35(13):3 824-3 825.

Detecting the Chromosomes of Blue Grained Wheat Breeding Lines with C-banding

SUIJianshu1,YAOYuekun2,HUMei3,ZHANGSuqin3，XINZhihai2,WANGWei1,CHENTianqing1,HEQingcai4
(1.Guizhou Institute of Upland Crops,Guiyang 550006,China;2.College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Institute of Triticeae Crops,Guizhou University,Guiyang 550025,China；4.Guizhou Institute of Plant Protection,Guiyang 550006,China)

In this study,the blue wheat derived materials of 11 lines (94 individual plants) were analyzed by using the improvement of C-banding.The results showed that the 25 individuals in 94 plants were detected with Elytrigia elongata 4 Ag Chromosome.The import rate was 26.60%.The results of this study can provide a theoretical reference for the breeding of blue grain wheat.

Blue-grained wheat; breeding lines; C-banding

2016-10-19

貴州省科技計劃“藍色籽粒小麥育種素材創(chuàng)新與新品種選育研究”(黔科合NY[2013]3012號)；貴州省農(nóng)科院人才啟動項目“小麥藍粒基因庫基礎(chǔ)群體的構(gòu)建研究”[黔農(nóng)科合(人才)08025號]；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點項目“藍粒小麥豐產(chǎn)群體與抗條銹病群體的組建研究”(黔農(nóng)科合(重點)08003號)；國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貴陽綜合試驗站(CARS-3-2-43)。

隋建樞(1986—)，男，助理研究員，主要從事小麥分子遺傳育種研究；E-mail:suijianshu@126.com。

何慶才(1963—)，男，研究員，主要從事小麥遺傳育種研究；E-mail:gznkykqc@yeah.net。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.038

S 512.1

A

1001-4705(2017)02-0038-03