， ， ， ， ， ， (吉林大學(xué) .生命科學(xué)學(xué)院； .分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室， 長春 130012)

光照對黑豆種子萌發(fā)進(jìn)程的影響研究

王亞文a，袁俊杰a，馬沐青a，吳家安b，辛鑫a，周毓麟a，周杰a
(吉林大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院； b.分子酶學(xué)工程教育部重點實驗室， 長春 130012)

植物種子的萌發(fā)過程涉及一系列生理生化反應(yīng)，為研究不同波長光線對種子萌發(fā)進(jìn)程的影響以及在萌發(fā)過程中種子中物質(zhì)與能量代謝的變化，對黑豆種子萌發(fā)前后呼吸代謝、蛋白質(zhì)含量、糖含量以及核酸含量的變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在黑豆種子萌發(fā)過程中，種子呼吸速率的變化符合“S”形曲線，存在明顯的呼吸滯緩期；萌發(fā)前后，種子內(nèi)蛋白質(zhì)總量下降47%；可溶性糖含量下降47%；DNA含量增加171%，RNA含量未見明顯變化。經(jīng)不同波長光線照射后，種子萌發(fā)強(qiáng)度變化明顯，其中可見光區(qū)域內(nèi)，長波長光線較短波長光線對種子萌發(fā)有更加明顯的促進(jìn)作用，而280 nm的紫外光也顯著提高種子萌發(fā)強(qiáng)度。研究結(jié)果可為適當(dāng)調(diào)整種子萌發(fā)外界條件，提高種子萌發(fā)率提供理論參考。

種子萌發(fā)； 呼吸代謝； 蛋白質(zhì)； 糖； 核酸

植物種子的萌發(fā)是植物生長發(fā)育過程中的最早階段, 也是其個體發(fā)育中最為關(guān)鍵的時期。種子萌發(fā)過程涉及到一系列基因表達(dá)以及復(fù)雜的生理生化代謝反應(yīng)。在此期間，植物種子細(xì)胞內(nèi)光合作用與呼吸作用等生理活動相互調(diào)節(jié)，能量與物質(zhì)代謝十分活躍。針對植物種子萌發(fā)過程中發(fā)生的分子事件的研究和探討，是現(xiàn)代植物分子生物學(xué)與生物化學(xué)研究的重要課題[1-5]。目前對于種子萌發(fā)這一復(fù)雜過程的研究主要集中在單一方面，如蛋白質(zhì)[6]、核酸[7]等，鮮有全面研究種子萌發(fā)前后物質(zhì)與能量代謝的報道，而關(guān)于環(huán)境光的波長對種子萌發(fā)的影響未見報道。本研究選擇黑豆種子為試材，利用瓦氏呼吸儀，研究種子萌發(fā)早期光與呼吸代謝的強(qiáng)度關(guān)系，探索種子萌發(fā)早期能量與物質(zhì)代謝的調(diào)控方式。通過測定蛋白質(zhì)、核酸、糖類在黑豆種子萌發(fā)前后的含量變化以及不同代謝相關(guān)酶在種子萌發(fā)早期的活性變化，分析種子萌發(fā)早期發(fā)生的分子事件，旨在為進(jìn)一步研究萌發(fā)種子發(fā)育的生理狀態(tài)、營養(yǎng)成分變化，為適當(dāng)調(diào)整種子萌發(fā)外界條件、提高種子萌發(fā)率提供理論參考。

注：圖中A，A′指示暗反應(yīng)；B，B′指示光反應(yīng)。圖1 黑豆種子的呼吸代謝變化

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

黑豆(Glycinemax(L.)Merr)種子，購自黑龍江黑尚烏農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。實驗前挑取形狀、大小相近的飽滿黑豆種子，經(jīng)過去離子水洗滌，室溫下去離子水浸泡12 h作為萌發(fā)種子樣品(G)；未浸泡種子為萌發(fā)前種子樣品(pG)，除呼吸代謝研究所需種子外，其它實驗中萌發(fā)前種子及萌發(fā)種子均用恒溫鼓風(fēng)干燥箱105 ℃脫水，種子經(jīng)充分脫水后研磨成粉末待用。

1.2 呼吸代謝變化測定

采用Warburg法[8]，取1粒黑豆種子，用濾紙吸干水，稱重，記錄(WB)，用排水法測體積(VB)。將黑豆種子放入反應(yīng)瓶中，加水，使水與黑豆種子總體積為5 mL；在中央小管中加入0.3 mL KOH(2 mol/L)溶液，在KOH溶液中放入一小片濾紙，增加CO2吸收面積。將壓力計固定在振蕩板上，反應(yīng)瓶浸入水中2/3。打開壓力計活塞，振蕩30 min，以使反應(yīng)瓶內(nèi)外溫度達(dá)到平衡。調(diào)節(jié)壓力計右側(cè)的液面達(dá)到150 mm處，準(zhǔn)確記下壓力計左側(cè)液面的高度，記為初始數(shù)據(jù)(V0)。關(guān)閉三通活塞，每隔10 min記錄1次雙側(cè)的數(shù)據(jù)(VL 1、VR 1，VL 2、VR 2，……)。

1.3 蛋白質(zhì)含量測定

采用雙縮脲法[9]，取0.3 g黑豆種子干粉，加入1 mL四氯化碳和10 mL 0.05 mol/L的KOH，再加入40 mL雙縮脲試劑，在振蕩器上劇烈振蕩10 min后室溫下放置1 h。離心(8 000 r/min×10 min)，取上清液，測OD540，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.4 糖含量測定

采用硫酸-蒽酮法[10]，取2 g黑豆種子干粉，加入90 mL水，60 ℃回流2 h后冷卻到室溫，離心8 000 r/min×8 min，取上清定容至100 mL，從中取出10 mL，加入150 mL無水乙醇，4 ℃靜置過夜，然后離心8 000 r/min×15 min取沉淀，用去離子水溶解后定容至100 mL，制備成可溶性碳水化合物檢測液。取2 mL樣品檢測液，加入6 mL硫酸蒽酮溶液，100 ℃反應(yīng)15 min，冷卻后，測上清OD625，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)可溶性碳水化合物含量。

1.5 核酸含量測定

取2 g黑豆種子干粉，加入10 mL預(yù)冷的核酸分離緩沖液(3%CTAB；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA，pH=8.0)，搖勻0 ℃放置10 min后離心。上清液用于提取RNA，沉淀用于提取DNA。將提取的RNA沉淀用去離子水溶解，測量樣品的OD260， RNA濃度=40×OD260×稀釋倍數(shù)。將提取的DNA沉淀用TE buffer溶解，測量樣品的OD260， DNA濃度=50×(OD260-OD280)×稀釋倍數(shù)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)過程中呼吸代謝的變化

暗反應(yīng)階段將Warburg呼吸儀罩住，使種子萌發(fā)過程在無光照條件下進(jìn)行。結(jié)果如圖1所示，在暗反應(yīng)無KOH條件下，種子萌發(fā)時，迅速釋放CO2，50 min內(nèi)反應(yīng)器內(nèi)氣體變化量由0 mL升至2 mL，隨著種子萌發(fā)進(jìn)行，封閉體系中O2不斷被消耗，60 min后，體系內(nèi)的CO2產(chǎn)生速率下降，80 min時氣體變化量為3.2 mL。在暗反應(yīng)有KOH條件下，種子萌發(fā)釋放的CO2大部分被KOH吸收，50 min時氣體變化量為0.4 mL，60 min以后O2消耗速率大于CO2釋放的速率，體積差為-0.1 mL。在光反應(yīng)無KOH條件下，種子萌發(fā)時，CO2的釋放與O2利用同時進(jìn)行， 50 min內(nèi)反應(yīng)器內(nèi)氣體變化量由0 mL升至1.2 mL，80 min時氣體變化量為2.1 mL。在光反應(yīng)有KOH條件下，釋放的CO2全部被KOH吸收，只有O2消耗，50 min時氣體變化量為-0.8 mL，80 min時氣體變化量為-1.8 mL。

圖2 光與種子萌發(fā)活性的關(guān)系

2.2 種子萌發(fā)前后蛋白質(zhì)含量的變化

采用雙縮脲法測定，黑豆種子萌發(fā)后蛋白質(zhì)含量較萌發(fā)前減少了46.77%，也就是說種子萌發(fā)進(jìn)程中大幅度地消耗了種子內(nèi)貯存的蛋白質(zhì)，這部分蛋白質(zhì)的含量變化包含種子中貯存的蛋白消耗和萌發(fā)進(jìn)程中新產(chǎn)生蛋白之間的差值。

2.3 種子萌發(fā)前后糖含量的變化

黑豆種子萌發(fā)前，樣品OD625為0.192，在糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出樣品中糖含量為0.039 mg/mL。種子萌發(fā)后，樣品OD625為0.118，糖含量為0.020 mg/mL，通過計算可知，種子萌發(fā)進(jìn)程中可溶性碳水化合物的含量從萌發(fā)前的0.48%轉(zhuǎn)變?yōu)槊劝l(fā)后的0.25%，這表明黑豆，萌發(fā)過程中主要的能量來源不是碳水化合物。

2.4 種子萌發(fā)前后核酸含量的變化

黑豆種子萌發(fā)前后，種子內(nèi)的DNA含量出現(xiàn)了明顯的變化，萌發(fā)前黑豆種子內(nèi)DNA占干重的1.21%，萌發(fā)后黑豆種子內(nèi)的DNA含量占干重的3.28%，變化幅度為171.0%；黑豆種子萌發(fā)前后，種子內(nèi)的RNA含量變化相對較不明顯，RNA占干重的質(zhì)量百分比從萌發(fā)前的0.031%變化為萌發(fā)后的0.022%，變化幅度僅為29%。

2.5 光與種子萌發(fā)活性的關(guān)系

在Warburg氏呼吸計的恒溫槽中加入不同顏色染料，使允許透過波長產(chǎn)生不同變化，觀察經(jīng)不同波長照射后，種子萌發(fā)活性的變化(結(jié)果如圖2)。

3 討論與結(jié)論

呼吸代謝是一切生物所共有的生理功能，其重要作用是釋放能量供各種代謝的需要。種子萌發(fā)過程中糖氧化降解是通過呼吸代謝途徑進(jìn)行的，胚乳中的糖需經(jīng)氧化分解才能為胚的生長提供可利用的能量，并為新器官、新組織的形成提供重要原料。種子萌發(fā)過程中，不同的呼吸代謝途徑為胚的生長提供不同的能荷和還原力，呼吸代謝途徑及強(qiáng)度的轉(zhuǎn)變影響種子萌發(fā)的正常進(jìn)行，因此研究種子萌發(fā)過程中的呼吸代謝具有重要的意義[12-14]。在本實驗中，通過采用Warburg氏呼吸計測定暗反應(yīng)和光反應(yīng)條件下，黑豆種子萌發(fā)時釋放的二氧化碳與利用的氧氣量之間的變化關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)早期在暗反應(yīng)無KOH條件下，種子萌發(fā)時，迅速釋放二氧化碳，隨著種子萌發(fā)進(jìn)行，封閉體系中氧不斷被消耗，體系內(nèi)的二氧化碳產(chǎn)生速率下降。在暗反應(yīng)有KOH條件下，種子萌發(fā)釋放的二氧化碳大部分被KOH吸收，60 min以后氧消耗速率大于二氧化碳釋放的速率。在光反應(yīng)無KOH條件下，種子萌發(fā)時，二氧化碳的釋放與氧的利用同時進(jìn)行，氣體變化量小于暗反應(yīng)。在光反應(yīng)有KOH條件下，釋放的二氧化碳全部被KOH吸收，只有氧氣的消耗。總體來說，黑豆種子呼吸速率的變化符合“S”形曲線，存在明顯的呼吸滯緩期。

為了向胚提供形成新組織的材料和發(fā)芽的能量, 種子中貯藏了富含化學(xué)能的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)為種子萌發(fā)以及萌發(fā)之后的幼苗生長提供營養(yǎng)，與種子活力的形成和保持有密切關(guān)系。一般認(rèn)為，種子活力與蛋白質(zhì)合成能力有關(guān)，當(dāng)種子活力下降時，蛋白質(zhì)合成量減少，酶結(jié)構(gòu)遭到破壞[15]。種子中蛋白質(zhì)的含量還與多種環(huán)境脅迫因素相關(guān)：如脫水脅迫[16]、貯藏溫度改變[17]、滲透脅迫[18]、人工老化[19]等。在本實驗中，采用雙縮脲法測定黑豆種子內(nèi)蛋白質(zhì)含量在種子萌發(fā)前后的變化，發(fā)現(xiàn)隨時間的推移，種子內(nèi)蛋白質(zhì)含量逐漸減少，可能是由于受外界環(huán)境的影響，種子內(nèi)酶的活力下降，蛋白質(zhì)合成減少。

糖類是種子萌發(fā)至轉(zhuǎn)入光合自養(yǎng)前的主要呼吸底物，主要包括蔗糖、果糖、鼠李糖、木糖、肌醇、氨基葡糖等[20]。在本實驗中，采用硫酸蒽酮法測定黑豆種子萌發(fā)前后糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)后，由于呼吸代謝對糖的分解作用，種子內(nèi)糖的含量明顯降低，進(jìn)一步證明了糖是種子萌發(fā)最主要的能量供應(yīng)物質(zhì)。

種子的萌發(fā)活力與DNA合成能力密切相關(guān)[21-26]，其中染色體斷裂是種子萌發(fā)過程中最易發(fā)生的致命缺陷之一，在本實驗中，測得黑豆種子萌發(fā)后，種子內(nèi)DNA與RNA的含量均有所下降，就極有可能與染色體斷裂有關(guān)。

經(jīng)不同波長光線照射后，種子萌發(fā)強(qiáng)度變化明顯，其中可見光區(qū)域內(nèi)，長波長光線較短波長光線對種子萌發(fā)有更加明顯的促進(jìn)作用，而280 nm的紫外光也顯著提高種子萌發(fā)強(qiáng)度。研究結(jié)果可為適當(dāng)調(diào)整種子萌發(fā)外界條件，提高種子萌發(fā)率提供理論參考。

綜上所述, 在黑豆種子的萌發(fā)過程中，能量與營養(yǎng)物質(zhì)呈現(xiàn)動態(tài)變化，呼吸代謝和各種營養(yǎng)物質(zhì)包括糖、蛋白質(zhì)和核酸都發(fā)生了復(fù)雜的變化，其中呼吸代謝和糖的變化更為復(fù)雜，除了受到種子自身因素影響外，還受到諸如光照條件等多種外界因素的影響，而不同波長以及不同光強(qiáng)照射對于不同植物種子萌發(fā)進(jìn)程的影響，還有待進(jìn)一步研究。

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The Effect of Illumination on the Germination Process of Black Soybean Seed

WANGYawena,YUANJunjiea,MAMuqinga,WUJiaanb,XINXina,ZHOUYulina,ZHOUJiea

2016-10-25

王亞文(1991—)，女，山西省人；碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

周 杰(1976—)，女，遼寧省人；博士，主要從事天然產(chǎn)物分離及性質(zhì)研究；E-mail：jzhou@jlu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.099

S 529

A

1001-4705(2017)02-0099-04