徐永建， 雷 鳳， 徐 洋， 李莎莎

(陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心， 陜西 西安 710021)

纖維素酶預(yù)處理對纖維素-Ag復(fù)合抗菌材料制備的影響

徐永建， 雷 鳳， 徐 洋， 李莎莎

(陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心， 陜西 西安 710021)

采用原位還原法，以竹漿纖維為基體，纖維素為還原劑，在纖維素纖維表面還原銀離子得到纖維素-Ag復(fù)合抗菌材料.通過纖維素酶預(yù)處理提高纖維素的還原性，以期更多的Ag+被還原在纖維表面.使用偏振塞曼原子吸收光譜檢測纖維素纖維中Ag含量，采用抑菌圈法評價復(fù)合材料的抗菌性能.結(jié)果表明：利用纖維素酶預(yù)處理對于提高纖維素的還原性有一定的效果，纖維素酶用量50 u/g，溫度50 ℃，pH5左右時，纖維素還原銀離子的效果最佳，纖維素-Ag復(fù)合抗菌材料纖維表面銀負(fù)載量最高，抗菌性最優(yōu).

原位還原； 纖維素酶； 銀負(fù)載量； 抗菌性

0 引言

纖維素是一種天然多羥基的生物大分子，具有優(yōu)良的金屬離子吸附特性，是自然界中最豐富的自然資源，廣泛應(yīng)用于紡織品及醫(yī)療衛(wèi)生等與人體接觸密切的產(chǎn)品中[1].纖維素本身不具有抗菌性，在應(yīng)用纖維素產(chǎn)品時難免會產(chǎn)生細(xì)菌污染的問題，因此對纖維素進行抗菌改性是目前研究的熱點[2,3].銀及其化合物具有優(yōu)異的抗菌性能，對650多種細(xì)菌都有很好的抗菌作用，因而可以作為良好的抗菌材料應(yīng)用于抗菌領(lǐng)域[4].將銀離子還原并負(fù)載于纖維素纖維表面，可以賦予纖維素優(yōu)異的抗菌性能，使纖維素產(chǎn)品在使用過程中抑制細(xì)菌的大量生長繁殖，有利于減少人體受到外界細(xì)菌的侵害.

與普通的銀相比，納米銀顆粒粒徑較小，銀原子趨向于粒子的外層，因此表現(xiàn)出一些優(yōu)異的特性[5,6].近年來的研究與發(fā)展表明,納米銀粒子由于具有較大的比表面積和表面能、獨特的電化學(xué)性能、光學(xué)性能、催化活性等優(yōu)良特性而使其具有廣譜抗菌性[7].若能將納米銀顆粒負(fù)載在纖維表面，則纖維素材料能夠獲得優(yōu)異的抗菌性能[8-10].

纖維素大分子的兩個末端基性質(zhì)不同，在一端的葡萄糖基第一個碳原子上存在一個苷羥基，當(dāng)葡萄糖環(huán)型結(jié)構(gòu)變?yōu)殚_鏈?zhǔn)綍r，此苷羥基變?yōu)槿┗哂羞€原性[11].因此對于纖維素整個大分子來說，其具有一定的還原性，能還原Ag+并使其負(fù)載在纖維表面.但由于纖維素中末端還原基少，使得纖維素還原性較弱.因此，通過纖維素酶降解纖維素使其暴露出更多的末端還原基,使更多的Ag+被還原并負(fù)載在纖維表面.纖維素的結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1 纖維素的結(jié)構(gòu)式

纖維素酶是一種復(fù)合酶系，主要包括：(1)內(nèi)切葡聚糖酶，也稱Cx酶，其作用是隨機地進攻無定形區(qū)纖維素的骨架，使β-1,4-糖苷鍵斷裂，內(nèi)切酶分子每切斷一個β-1,4-糖苷鍵，就會在纖維素大分子鏈上產(chǎn)生一個新的潛在的醛基，該醛基是較活潑的還原性基團[12]；(2)外切葡聚糖酶，也稱C1酶，該酶可以從纖維素糖鏈的還原端或非還原端逐步降解纖維素，釋放出纖維二糖或葡萄糖；(3)β-葡萄糖苷酶，也稱纖維二糖水解酶，其可以將纖維素內(nèi)二糖或低分子的纖維糊精水解生成葡萄糖，纖維素酶降解纖維素的過程是以上三種酶的協(xié)同作用[13-15].圖2為纖維素酶的作用機理.顯然，纖維素經(jīng)纖維素酶處理后，能夠暴露出更多的末端還原基，有利于Ag+的原位還原.

圖2 纖維素酶的作用機理

基于纖維素酶對于纖維素的降解作用可以提高其還原性，本論文采用原位還原法，以竹漿纖維為基體，纖維素為還原劑，在纖維素纖維表面還原銀離子得到纖維素-Ag復(fù)合抗菌材料.并通過纖維素酶預(yù)處理提高纖維素的還原性，研究其對原位還原效果的影響.通過偏振賽曼原子吸收光譜法測定復(fù)合材料中的Ag含量，并使用抑菌圈法檢測復(fù)合材料對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抗菌性能.

1 實驗部分

1.1 主要原料

竹漿板，購于貴州赤天化紙業(yè)有限公司；纖維素酶，上海寶曼生物科技有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，南京便診生物科技有限公司；硝酸銀、硫酸、氫氧化鈉，國藥試劑有限公司.

1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋，HH-2，北京科偉永興儀器有限公司；pH計，pHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器公司；紙樣抄取器，ZQJ1-B-Ⅱ，陜西科技大學(xué)造紙機械廠；偏振塞曼原子吸收光譜，Z-2000，日本HITACHI公司；SEM，S4800，日本HITACHI公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 載納米銀纖維素纖維的制備

將竹漿板浸泡水中24 h，疏解，擠壓，撕漿，平衡水分后置于塑封袋中備用.稱取適量絕干漿，并加入稀硫酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶溶液，置于一定溫度的水浴鍋中反應(yīng)一定時間，反應(yīng)完成后高溫使得纖維素酶失活，酶處理反應(yīng)終止.

取適量纖維素酶處理過的漿料，加入0.1 mol/L AgNO3溶液一定量，放于特定溫度的水浴鍋中反應(yīng)，完成后，將漿料取出，疏解，抄片，干燥保存?zhèn)溆?

1.3.2 紙漿還原性能的檢測

測定紙漿的還原性能通常采用測定銅價[16]的方法.銅價是指100 g絕干紙漿纖維，在堿性介質(zhì)中，于100 ℃時將硫酸銅還原為氧化亞銅的克數(shù).

實驗參照GB/T5400-1998紙漿銅價的測定方法進行.

1.3.3 纖維銀負(fù)載量的檢測

實驗采用偏振塞曼原子吸收光譜儀檢測銀負(fù)載量.

首先配制銀標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取0.157 4 g硝酸銀于燒杯中，加入去離子水適量，移入1 000 mL容量瓶中，定容，得到銀負(fù)載量為100 mg/L的硝酸銀溶液. 用移液管分別移取1 mL,2 mL,3 mL,4 mL此溶液于4個100 mL容量瓶中，定容至100 mL，得到銀負(fù)載量分別為1 mg/L,2 mg/L,3 mg/L,4 mg/L的銀標(biāo)準(zhǔn)溶液，純蒸餾水作為空白樣.采用AAS制作銀離子標(biāo)準(zhǔn)曲線.

取0.1 g制備的復(fù)合材料于燒杯中，加入50～100 mL 50%硝酸，用電爐使其完全溶解，待冷卻后，移入100 mL容量瓶中，定容.檢測制備的復(fù)合材料中銀負(fù)載量.注意配置好溶液后，過濾，保證溶液澄清.

1.3.4 紙漿抗菌性能的檢測

參照GB/T 20944《紡織品抗菌性能的評價》中瓊脂平皿擴散法和振蕩法檢測樣品的抗菌性能.本實驗采用瓊脂平皿擴散法[17].

向無菌平皿中傾入10 mL高壓滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，加入0.1 mL實驗菌液，用玻璃棒涂布均勻，然后將制備的復(fù)合材料剪成直徑為14 mm圓片并貼于培養(yǎng)基表面，在37 ℃下培養(yǎng)24 h并測定抑菌圈寬度.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同纖維素酶添加量處理效果評價

加入20 g絕干漿，pH為5，50 ℃下進行酶處理反應(yīng)，完成后再加入4 mL，0.1 mol/L的AgNO3溶液,90 ℃下水浴1 h，纖維素酶添加量對纖維素還原性能和纖維上的銀負(fù)載量的影響如圖3所示.

圖3 纖維素酶用量對銅價和銀負(fù)載量的影響

圖3表明，隨著纖維素酶用量的增加，銅價和銀負(fù)載量都隨之增大.纖維素酶對纖維素有一定的切斷作用，增加酶用量，纖維素暴露出更多的末端醛基，銅價增加；同時，更多的銀離子被還原在纖維上，銀負(fù)載量增加.

2.2 不同溫度下酶處理效果評價

加入20 g絕干漿，pH為5，纖維素酶添加量50 u/g下進行酶處理反應(yīng)，完成后再加入4 mL，0.1 mo/L AgNO3溶液,90 ℃下水浴1 h，溫度對纖維素還原性能和纖維上的銀負(fù)載量的影響如圖4所示.

圖4 溫度與銅價和銀負(fù)載量的關(guān)系

圖4表明，隨著溫度的升高，銅價和銀負(fù)載量先增高后降低，溫度為50 ℃左右時兩者都達(dá)到最大值.原因是纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃～50 ℃，此時酶活力最大，酶對纖維素的切斷作用最強裂，纖維素暴露出最多的末端醛基，表現(xiàn)出最強的還原性，銅價最高；同時，最多的銀離子被還原在纖維上，銀負(fù)載量最多.

2.3 不同pH下酶處理效果評價

加入20 g絕干漿，溫度為50 ℃，纖維素酶添加量50 u/g下進行酶處理反應(yīng)，完成后再加4 mL，0.1 mol/L AgNO3溶液，90 ℃下水浴1 h，pH對纖維素還原性能和纖維上的銀負(fù)載量的影響如圖5所示.

圖5 pH與銅價和銀負(fù)載量的關(guān)系

圖5表明，隨著pH增大，銅價和銀負(fù)載量先增加后減小，pH在5左右時，銅價和銀負(fù)載量最大，原因是纖維素酶的最適pH一般為4.5～5.5，此時酶活力最大，酶對纖維素的切斷作用最強裂，纖維素暴露出最多的末端醛基，表現(xiàn)出最強的還原性，銅價最高；同時，最多的銀離子被還原在纖維上，銀負(fù)載量最多.

2.4 纖維形貌學(xué)表征

原料纖維和復(fù)合材料的表面形貌差別很大，如圖6(a)、(b)所示.原料纖維(圖6(a))表面光滑，微細(xì)纖維趨向明顯，無顆粒狀的物質(zhì)；復(fù)合材料(圖6(b))微細(xì)纖維趨向減弱，纖維表面被破壞，有大小形狀不一的白色晶體.由復(fù)合材料的能譜分析結(jié)果(圖6(c)、表1)可發(fā)現(xiàn)，C和O是復(fù)合材料的主要組成元素，此外還有Ag元素的存在，說明Ag+被還原在纖維上，達(dá)到了預(yù)期效果.

(a)原料纖維的SEM圖

(b)復(fù)合材料的SEM圖

(c)復(fù)合材料的能譜圖

元素質(zhì)量百分?jǐn)?shù)/Wt%原子百分?jǐn)?shù)/At%C43．3050．67O56．0749．25Ag00．6400．08

2.5 抗菌效力表征

采用抑菌圈法評價復(fù)合材料的抗菌性能，本研究選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為實驗細(xì)菌.復(fù)合材料對于這兩種細(xì)菌的抗菌效果見圖7所示.

圖7表明，空白樣無抑菌圈，而復(fù)合材料有明顯的抑菌圈，說明復(fù)合材料對革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌都有優(yōu)異的抗菌性能，這與預(yù)期的效果一致.而且復(fù)合材料在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基上產(chǎn)生的抑菌圈大于在大腸桿菌培養(yǎng)基上產(chǎn)生的抑菌圈，說明復(fù)合材料對于金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于對于大腸桿菌的抑菌效果.

(a)A1 、A2、A3對大腸桿菌的抗菌效果圖 (b)A4、A5對大腸桿菌的抗菌效果圖

(c)A1、A3對金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖 (d)A2、A4、A5對金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖

3 結(jié)論

(1)纖維素酶預(yù)處理纖維素是一種操作簡單，比較合理的提高其還原性的方法.

(2)負(fù)載銀的纖維具有優(yōu)異的抗菌性.

(3)當(dāng)纖維素酶添加量為50 u/g，溫度為50 ℃，pH為5時，纖維素酶的活力最大，此時使得纖維素暴露出來的還原性基團最多，還原在纖維上銀離子的含量最多，取得最優(yōu)異的抗菌效果.

[1] 羅成成,王 暉,陳 勇,等.纖維素的改性及應(yīng)用研究進展[J].化工進展,2015,22(1):26-27.

[2] 徐永建,左磊剛.抗菌纖維素/纖維素纖維的研究進展[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,32(1):10-15.

[3] 馬 潔,張瑞寅.含銅抗菌纖維[J].合成纖維, 2016,45(12):6-8.

[4] 韓秀秀,何 文,田修營,等.銀系無機抗菌材料抗菌機理及應(yīng)用[J].化工新型材料,2010,24(1):25-27.

[5] 汪 菲,徐維平,楊金敏,等.納米銀的制備進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2012,8(2):184-186.

[6] 司華艷,毛晨憬.PVP輔助制備單分散納米銀顆粒研究[J].石家莊學(xué)院學(xué)報,2017,19(3):5-10.

[7] 張文鉦,王廣文.納米銀抗菌材料研發(fā)現(xiàn)狀[J].化工新型材料,2003,31(2):42-44.

[8] 徐永建,徐 洋.堿/酶處理對載銀纖維素纖維復(fù)合材料制備的影響[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,34(3):6-11.

[9] Sosenkova L S,Egorova E M.The effect of particle size on the toxic action of silver nanoparticles[J].Journal of Physics:Conference Series,2011,291(1):12-27.

[10] Cho K H,Park J E O,Saka T,et al.The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient[J].Electrochimica Acta,2005,51(5):956-960.

[11] 楊淑慧.植物纖維化學(xué)[M].4版.北京:中國輕工業(yè)出版社,2012.

[12] 呂家華.纖維素酶對纖維素纖維的作用[D].上海:東華大學(xué),2003.

[13] 邵學(xué)良,劉志偉.纖維素酶的性質(zhì)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國食物與營養(yǎng),2009(8):34-36.

[14] 邵震宇,謝益民.纖維素酶在制漿造紙工業(yè)中的應(yīng)用[J].江蘇造紙,2008(2):38-42.

[15] 姚文潤.纖維素酶制備納米纖維素及其在制漿造紙中的應(yīng)用[D].濟南:齊魯工業(yè)大學(xué),2015.

[16] 石淑蘭,何福望.制漿造紙分析與檢測[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2009.

[17] GB/T 20944.1-2007，紡織品抗菌性能的評價:第1部分瓊脂平皿擴散法[S].

【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Effectofcellulasepretreatmentonpreparationofcellulose-Agantibacterialcompositematerials

XU Yong-jian， LEI Feng， XU Yang， LI Sha-sha

(College of Bioresources Chemical and Materials Engineering， Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper， National Demonstration Center for Experimental Light Chemistry Engineering Education， Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021， China)

Cellulose-Ag composites were obtained by reducing Ag+on the surface of cellulose with in-situ method. Cellulase was used to improve the reducibility of cellulose which was important for the amount of reduced Ag on the surface of fiber.Polarized Zeeman atomic absorption spectrum was used to detect Ag amount of composites.The anti-bacterial properties of composite materials were evaluated by inhibition zone method.Result shown that,cellulase was benefit for the elevation of cellulose reducibility.The optimum conditions of cellulase per-treatment were 50 u/g cellulase addition,50 ℃,pH=5.Moreover,the anti-bacterial properties of composite were increasing with the augment of Ag amount.

in-situ reduce; cellulase; silver loading; antibacterial activity

2017-08-27

國家自然科學(xué)基金項目(31170559); 華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點實驗室開放基金項目(202101704); 陜西科技大學(xué)學(xué)科學(xué)術(shù)團隊培育計劃項目(2013SXD25)

徐永建(1970-)，男，陜西西安人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物纖維資源高值化利用、清潔生產(chǎn)及堿回收除硅技術(shù)

2096-398X(2017)06-0015-05

TS721

A