， ， ， ， ， ， (.貴州省種子管理站， 貴陽 55000； .貴州大學， 貴陽 55005；.貴州省生物技術(shù)研究所， 貴陽 550006)

貴州馬鈴薯引進品種SSR分子標記及遺傳多樣性分析

李恩宏1，賈長城2，楊麗娜1，滕安平1，馮浪1，朱英3，李飛3
(1.貴州省種子管理站， 貴陽 550001； 2.貴州大學， 貴陽 550025；3.貴州省生物技術(shù)研究所， 貴陽 550006)

為了鑒定馬鈴薯品種間的親緣關(guān)系，采用5對SSR分子標記引物，對18個貴州馬鈴薯生產(chǎn)品種進行SSR分子標記及遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：5對SSR引物共擴增出77個多態(tài)性條帶，每個組合的多態(tài)性條帶數(shù)為10～24不等，平均每個引物組合產(chǎn)生15.4個多態(tài)性條帶。18個馬鈴薯材料之間的遺傳距離范圍在0.376 6～0.909 0之間，平均為0.701 1。經(jīng)聚類分析，18個馬鈴薯材料在遺傳距離0.57水平上全部聚為一類，以遺傳距離0.60為基準，可明顯聚為4個類群。第Ⅰ類包括5個材料；第Ⅱ類僅1個材料；第Ⅲ類包括4個材料；第Ⅳ類包括8個材料。

馬鈴薯； 品種； 標記； 遺傳多樣性

貴州是馬鈴薯生產(chǎn)大省，馬鈴薯種植面積已經(jīng)突破“1 000萬畝”大關(guān)，種植面積常年穩(wěn)居全國前三甲，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)也被列入貴州特色優(yōu)勢扶貧產(chǎn)業(yè)。近年來，馬鈴薯品種更新?lián)Q代的步伐加快，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的馬鈴薯品種需求量大，選擇優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種迫在眉睫，快速準確的選擇品種成為今后推廣優(yōu)質(zhì)品種的主要途徑。傳統(tǒng)的馬鈴薯品種鑒別采用生物形態(tài)學的方法，所需周期較長，品種間較小的差異不易區(qū)別，誤差也較大。因此，為了了解馬鈴薯品種間的親緣關(guān)系和遺傳背景，規(guī)范馬鈴薯質(zhì)量管理，保證馬鈴薯質(zhì)量，助推馬鈴薯產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展，必須對馬鈴薯引進品種進行分子標記指紋圖譜分析，同時為今后馬鈴薯品種引種推廣、親本選擇、品種選育預測提供理論依據(jù)。

SSR分子標記具有多態(tài)性高、多等位基因信息量高、遺傳共顯性、檢測效率高等特點，目前被廣泛用于馬鈴薯品種指紋圖譜構(gòu)建、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定、多態(tài)性檢測等[1]。在SSR分子標記與遺傳多樣性分析方面，國內(nèi)已經(jīng)有許多的研究和報道，段艷鳳等[2]利用10對SSR引物構(gòu)建了中國88個馬鈴薯審定品種的指紋與遺傳多樣性分析；李先平等[3]利用SSR分子標記對30份彩色馬鈴薯種質(zhì)材料遺傳關(guān)系進行了分析，可作為極好的遺傳資源在雜交上予以利用，擴大和豐富彩色馬鈴薯種質(zhì)遺傳背景；黃先群等[4]利用9對SSR引物對12個引進品種、12個費烏瑞它自然和輻射變異材料進行了遺傳多樣性分析；李飛等[5]利用SSR分子標記對8個馬鈴薯新品種進行了遺傳分子和指紋圖譜構(gòu)建；謝春梅等[6]應用SSR分子標記技術(shù)鑒定了馬鈴薯實生種子的純度；唐銘霞等[7]利用SSR標記對四川省現(xiàn)有及引進的馬鈴薯品系(種)42份進行了遺傳多樣性分析；王紹鵬等[8]采用SDS提取液提取的馬鈴薯DNA，質(zhì)量好、無降解，滿足SSR分子標記的要求。利用4對引物對黑龍江省7個主栽品種進行了分析標記。劉建霞等[9]利用SSR對山西省12份馬鈴薯主栽品種進行了遺傳多樣性分析。上述研究表明，SSR分子標記已經(jīng)成為馬鈴薯遺傳多樣性、馬鈴薯純度鑒定、馬鈴薯親緣關(guān)系分析的主要技術(shù)手段。因此，為了鑒定貴州省種子管理站提供的18個馬鈴薯引進品種之間的遺傳多樣性，本研究利用段艷鳳等[2]從138對SSR引物中篩選的5對多太性高、條帶清晰的引物對參試材料進行遺傳多樣性分析，從而為馬鈴薯品種選育、種質(zhì)資源利用、品種權(quán)保護等方面提供一定的理論依據(jù)。

表1 參試馬鈴薯品種信息匯總

序號樣品編號品種名稱級別被抽查單位來源1WJC2016?09001337常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社雪山合作社2WJC2016?09002宣薯2號二級種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社3WJC2016?09003威芋5號二級種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社威寧縣高原農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)民專業(yè)合作社4WJC2016?09004威芋3號原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社盤縣農(nóng)科所5WJC2016?09005盤薯4號原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社盤縣農(nóng)科所6WJC2016?09006云薯505常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社雪山合作社7WJC2016?09007麗薯6號常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社威寧縣高原農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)民專業(yè)合作社8WJC2016?09008青薯9號一級種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社威寧縣高原農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)民專業(yè)合作社9WJC2016?09009麗薯107原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社貴州百谷豐薯業(yè)有限公司10WJC2016?090010云薯401原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社貴州百谷豐薯業(yè)有限公司11WJC2016?090011東北洋芋常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社自繁12WJC2016?090012中薯3號常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社自繁13WJC2016?090013荷蘭薯7號原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社威寧泰豐科技實業(yè)有限公司14WJC2016?090014荷蘭薯15原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社貴州百谷豐薯業(yè)有限公司15WJC2016?09015鄂薯5號原種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社貴州百谷豐薯業(yè)有限公司16WJC2016?090016新大坪常規(guī)種威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社自繁17WJC2016?09017恒薯1號原原種貴州恒豐科技有限公司自繁18WJC2016?09018滕育1號原種威寧縣新街農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社山東騰州

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年抽取馬鈴薯樣品18份，每份4粒馬鈴薯(詳見表1)，利用馬鈴薯薯塊提取DNA。

1.2 DNA提取

每份試驗材料取少量馬鈴薯薯塊，利用CTAB法提取樣本DNA。樣品稀釋到25 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 分子標記引物

試驗選用引物是段艷鳳等[2]從中國88個馬鈴薯審定品種中的138對SSR引物中篩選的5對多態(tài)性高、條帶清晰的引物(表2)。

表2 試驗SSR引物名稱和序列

引物名稱上游引物(5’?3’)下游引物(5’?3’)S118AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTS170CGCAAATCTTCATCCGATTCTCCGGCGGATAATACTTGTTS180ACTGCTGTGGTTGGCGTCACGGCATAGATTTGGAAGCATCS184TCATCACAACGTGACCCCAGGGCTTGAATGATGTGAAGCTCS192ACTTCTGCATCTGGTGAAGCGGTCTGGATTCCCAGGTTG

1.4 SSR-PCR擴增

PCR擴增體系20μL，含25 ng/μL DNA模板2.0μg/μL、10 pmol/μL上游primer 0.8μL、10 pmol/μL下游primer 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6μL、10×PCR buffer 2.0μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4μL、ddH2O 12.4μL。TaqDNA聚合酶為Tiangen公司產(chǎn)品。反應程序為94 ℃模板預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度范圍為53～64 ℃)，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10%的變性PAGE電泳檢測。電泳結(jié)束后用硝酸銀染色觀察結(jié)果。

注：M為Marker，由下到上分別是100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、700 bp、1 000 bp。泳道1～18分別代表：WJC 2016-09001、WJC 2016-09002、WJC 2016-09003、WJC 2016-09004、WJC 2016-09005、WJC 2016-09006、WJC 2016-09007、WJC 2016-09008、WJC 2016-09009、WJC 2016-090010、WJC 2016-090011、WJC 2016-090012、WJC 2016-090013、WJC 2016-090014、WJC 2016-090015、WJC 2016-090016、WJC 2016-09017、WJC 2016-09018。下同。圖1 引物S 170、S 184對18個馬鈴薯材料DNA的SSR擴增帶型

圖2 引物S 118、S 180對18個馬鈴薯材料DNA的SSR擴增帶型

圖3 引物S 192對18個馬鈴薯材料DNA的SSR擴增帶型

1.5 數(shù)據(jù)分析

SSR擴增譜帶在相同遷移率位置上有帶記為1、無帶記為0，組成原始矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

采用5對擴增多態(tài)性較好較好的SSR對18個馬鈴薯材料進行擴增，結(jié)果表明，共擴增出77個多態(tài)性條帶(圖1～圖3)，每個組合的多態(tài)性條帶數(shù)為10～24不等，平均每個引物組合產(chǎn)生15.4個多態(tài)性條帶。

2.2 參試品種的遺傳相似性

根據(jù)5對SSR引物擴增得到的條帶，建立1和0型數(shù)據(jù)，計算獲得18份馬鈴薯材料之間的遺傳距離(表3)，范圍在0.376 6～0.909 0之間，平均為0.701 1。其中，材料“WJC 2016-09002(宣薯2號)”和“WJC 2016-09007(麗薯6號)”之間的遺傳距離最小(為0.376 6)，說明其遺傳關(guān)系最近，而材料“WJC 2016-090014(荷蘭薯15)”和“WJC 2016-09018(滕育1號)”之間的遺傳距離最大(為0.909 0)，說明其遺傳關(guān)系最遠。

2.3 參試品種的遺傳聚類圖

由圖4可以看出，18份馬鈴薯材料在遺傳距離0.57水平上全部聚為一類。以遺傳距離0.60為基準，可分為四大類。第Ⅰ類包括WJC 2016-09001(337)、WJC 2016-09003(威芋5號)、WJC 2016-09009(麗薯107)、WJC 2016-090010(云薯401)、WJC 2016-090011(東北洋芋)等5個材料；第Ⅱ類僅WJC 2016-09007(麗薯6號)1個材料；第Ⅲ類包括WJC 2016-09002(宣薯2號)、WJC 2016-09004(威芋3號)、WJC 2016-09005(盤薯4號)、WJC 2016-09008(青薯9號)等4個材料；第Ⅳ類包括WJC 2016-09006(云薯505)、WJC 2016-009012(中薯3號)、WJC 2016-090013(荷蘭薯7號)、WJC 2016-090014(荷蘭薯15)、WJC 2016-090015(鄂薯5號)、WJC 2016-090016(新大坪)、WJC 2016-09017(恒薯1號)、WJC 2016-09018(滕育1號)等8個材料。

表3 18份馬鈴薯材料間的遺傳距離

WJC2016?09001WJC2016?09002WJC2016?09003WJC2016?09004WJC2016?09005WJC2016?09006WJC2016?09007WJC2016?09008WJC2016?09009WJC2016?090010WJC2016?090011WJC2016?090012WJC2016?090013WJC2016?090014WJC2016?090015WJC2016?090016WJC2016?09017WJC2016?09018WJC2016?090011．0000WJC2016?090020．50651．0000WJC2016?090030．68830．50651．0000WJC2016?090040．66230．58440．63641．0000WJC2016?090050．44160．70130．54550．67531．0000WJC2016?090060．66230．58440．66230．58440．57141．0000WJC2016?090070．66230．37660．61040．58440．46750．61041．0000WJC2016?090080．72730．67530．54550．70130．61040．64940．54551．0000WJC2016?090090．88310．44160．67530．59740．42860．64940．67530．66231．0000WJC2016?0900100．71430．58440．71430．63640．51950．61040．45450．67530．72731．0000WJC2016?0900110．63640．48050．66230．58440．54550．55840．58440．51950．67530．61041．0000WJC2016?0900120．58440．66230．61040．71430．64940．66230．45450．57140．51950．63640．66231．0000WJC2016?0900130．62340．62340．54550．64940．63640．70130．51950．55840．61040．67530．54550．80521．0000WJC2016?0900140．59740．59740．57140．67530．63640．70130．51950．55840．58440．67530．57140．80520．89611．0000WJC2016?0900150．50650．58440．58440．55840．64940．61040．40260．49350．46750．55840．63640．76620．62340．67531．0000WJC2016?0900160．53250．61040．61040．50650．62340．71430．50650．54550．54550．63640．58440．68830．70130．75320．66231．0000WJC2016?090170．61040．50650．68830．66230．64940．61040．50650．54550．54550．61040．55840．68830．62340．59740．61040．66231．0000WJC2016?090180．53250．58440．53250．61040．59740．66230．45450．51950．51950．61040．55840．79220．83120．90910．71430．79220．61041．0000

圖4 18份馬鈴薯材料聚類圖

3 結(jié) 論

李麗等[10]利用10對SSR引物構(gòu)建了38份參試材料的指紋圖譜，并進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明:共檢測到113個等位位點，其中64個為多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為57%。每對SSR引物擴增的多態(tài)性位點數(shù)為4～12個，平均6.4個，多態(tài)性信息量變化為0.144 5～0.937 0，平均0.509 8；經(jīng)聚類分析，,在遺傳相似系數(shù)0.61處，所有參試材料可明顯分為3個類群。貴州馬鈴薯不同品種間的遺傳基礎較狹窄，同一單位提供的品種遺傳關(guān)系相近。本次試驗采用段艷鳳等[2]的方法從138對SSR引物中篩選出的5對多態(tài)性高、條帶清晰的引物，所有參試品種均可分開，說明采用SSR標記構(gòu)建馬鈴薯品種DNA指紋圖譜是可行的，DNA指紋圖譜的建立，有助于馬鈴薯種薯質(zhì)量管理，打擊假冒侵權(quán)品種。

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SSR Molecular Markers and Genetic Diversity Analysis of Potato Introduced Varieties in Guizhou

LIEnhong1,JIAChangcheng2,YANGLina1,TENGAnping1,FENGLang1,ZHUYing3,LIFei3
(1.Seed Management Station of Guizhou Province,Guiyang 550001,China；2.Guizhou University,Guiyang 550025; 3.Guizhou Institute of Biotechnology,Guiyang 550006，China)

In order to identify the genetic relationship among potato cultivars,genetic diversity of 18 Potato Cultivars in Guizhou were analyzed by 5 pairs of SSR molecular marker primers.The results showed that 77 polymorphic bands were amplified by 5 pairs of SSR primers,and the number of polymorphic bands in each combination was 10-24.There were 15.4 polymorphic bands in each primer combination.The genetic distances between 18 potato materials ranged from 0.376 6 to 0.909 0,with an average of 0.701 1.By cluster analysis,18 potato samples were clustered into 4 groups at the 0.57 level of genetic distance.Based on the genetic distance of 0.60,they could be clustered into two groups.Category Ⅰ consists of 5 cultivars;Category Ⅱ only has 1 cultivar;Category Ⅲ consists of 4 cultivars;Category Ⅳ includes 8 cultivars.

potato； variety； marker； genetic diversity

2017-03-17

本研究由抗晚疫病馬鈴薯品種選育(黔科合NZ字[2012]3034)和馬鈴薯高產(chǎn)多抗新品種選育(黔農(nóng)科院院專項[2014]033號)項目資助。

李恩宏(1982—)，男，貴州盤縣人；學士，助理農(nóng)藝師，主要從事馬鈴薯種薯質(zhì)量管理、品種資源收集與分析研究；E-mail：31370487@qq.com。

李 飛，E-mail:gzlfei@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.025

S 532

A

1001-4705(2017)07-0025-05