夏立平 秦 陽 葉文琴

1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院護理學院,江蘇鹽城 224005;2.海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院,上海 200433

口腔定植菌檢測技術(shù)的系統(tǒng)評價

夏立平1秦 陽1葉文琴2▲

1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院護理學院,江蘇鹽城 224005;2.海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院,上海 200433

目的尋找適合機械通氣(MV)患者口腔定植菌的檢測方法,完善MV患者口腔護理評估方法.方法使用計算機檢索2005年1月～2015年4月的文獻,對納入研究的文獻的進行閱讀,并遵循quot;系統(tǒng)綜述和薈萃分析優(yōu)先報告條目quot;聲明對研究內(nèi)容進行系統(tǒng)評價.結(jié)果最終納入7篇文獻,其中4篇中文文獻,3篇英文文獻.口腔定植菌檢測方法有涂片鏡檢法、細菌培養(yǎng)法、菌落形成單位法,以及DNA探針和PCR技術(shù).結(jié)論16SrDNA/16SrRNA檢測技術(shù)能夠大大提高口腔微生物的鑒定成功率,具有廣闊的應用前景.

機械通氣;口腔定植菌;檢驗技術(shù);文獻檢索;16SrDNA/16SrRNA

機械通氣(mechanical ventilation,MV)是利用機械裝置來控制、代替或改變自主呼吸運動的一種通氣方式[1].在呼吸機的幫助下,通過機械通氣維持氣道通暢、改善通氣和氧合、防止機體缺氧和二氧化碳蓄積,幫助機體度過基礎疾病所致的呼吸功能衰竭,為治療基礎疾病創(chuàng)造條件[2-3].有研究顯示,口咽部定植菌的誤吸和移位是MV患者發(fā)生VAP的獨立危險因素,根據(jù)口咽部微生物的種類,有針對性地進行口腔護理干預,可以顯著降低VAP的發(fā)生率[4-6].之前本研究組對于MV患者口腔護理的指南和系統(tǒng)評價進行循證研究,均未發(fā)現(xiàn)有關口腔定植菌檢測技術(shù)的相關證據(jù),為尋找適合MV患者口腔定植菌的檢測方法,完善MV患者口腔護理評估方法,本研究針對口腔定植菌檢測技術(shù)進行系統(tǒng)評價,分析現(xiàn)有的口腔定植菌檢測方法的準確性及應用效果,以總結(jié)出文獻報道中的不同檢測手段,并對其檢測效果進行分析,為構(gòu)建MV患者口腔護理方案提供理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 評價標準

遵循quot;系統(tǒng)綜述和薈萃分析優(yōu)先報告條目quot;(Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses,PRISMA)聲明來制定該系統(tǒng)評價的研究內(nèi)容.該聲明是對系統(tǒng)評價或薈萃分析報道內(nèi)容的主要條目進行界定和介紹,旨在幫助改進此類文章的撰寫,提升系統(tǒng)評價或薈萃分析的質(zhì)量[7].

1.2 納入與排除標準

本系統(tǒng)評價針對口腔定植菌的檢測技術(shù)展開,納入文獻特征包括:(1)使用檢測方法調(diào)查口腔定植菌的種類或數(shù)量的相關實驗性和觀察性研究;(2)研究對象為人類,限定范圍為口腔細菌,其種族、國籍不限;③同時納入中英文文獻.主要的檢測方法包括:細菌培養(yǎng)法、細菌酶檢測法、免疫學檢查技術(shù)、DNA探針雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應技術(shù)(PCR技術(shù))等.排除標準為:(1)細菌檢測對象為動物;(2)未說明檢測結(jié)果指標,如檢出率或特異度等.

1.3 檢索策略

使 用 計 算 機 檢 索 Cochrane Library、Pubmed、EMbase、CBM、萬方數(shù)據(jù)庫,所有數(shù)據(jù)庫均為近十年,即2005年1月1日～2015年4月.對納入研究文獻的參考文獻進行閱讀,保留與本系統(tǒng)評價相關的研究,并對其中不明確或無法獲得原文的文獻與作者進行聯(lián)系.英文檢索詞包括:(oral colonized bacteria / oral colonization)amp;(testing method/bacterial culture/bacterial enzyme test/immunology examination/DNA probe hybridization/polymerase chain reaction/16SrRNA/denaturing gradient gel electrophoresis/gene chip/16SrDNA)amp;(detection rate/sensitivity/specificity/accuracy);中文檢索詞包括:口腔定植菌、檢測方法/細菌培養(yǎng)法/細菌酶檢測法/免疫學檢查技術(shù)/DNA探針雜交技術(shù)/聚合酶連反應技術(shù)(其中包括傳統(tǒng)PCR、半定量和定量PCR)/16S rRNA基因/變性梯度凝膠電泳技術(shù)/基因芯片技術(shù)、檢出率/敏感度/特異度/精確性.以Pubmed為例,說明檢索過程,見圖1.

圖1 檢索過程

1.4 文獻篩選

由兩位接受過循證護理培訓的研究人員分別獨立進行篩選,首先閱讀文題,若符合納入標準則進一步閱讀摘要、全文,并在此基礎上交叉核對.對存在分歧的點由第三位人員協(xié)助判斷.

1.5 內(nèi)容提取

設計信息提取表,對納入的文獻提取以下內(nèi)容:(1)文獻基本特征,包括作者、發(fā)表時間、研究類型、研究對象特征;(2)定植菌檢測相關特征,如檢測方法、定植菌種類、檢測的結(jié)局指標(包括檢出率、特異度等).

1.6 文獻質(zhì)量評價

兩位研究人員分別對篩選后保留的文獻進行質(zhì)量評價,采用由參與上一步的兩名研究人員按照QUADAS-2(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies)質(zhì)量評價標準對納入文獻進行評價[7].該工具主要用于診斷試驗準確性的評價,是Cochrane協(xié)作網(wǎng)推薦的診斷試驗系統(tǒng)評價方法學組采用的工具,并在2012年被納入Cochrane協(xié)作網(wǎng)專用軟件RevMan5.2中[8-9].QUADAS-2工具分為四個步驟:(1)研究者報道所要進行的系統(tǒng)評價問題;(2)根據(jù)系統(tǒng)評價的問題適當刪增,使其能夠適用于該問題;(3)評價已發(fā)表的原始研究的流程圖或為未報道的原始研究構(gòu)建流程圖;(4)判斷研究的偏倚和適用性.在對偏倚風險和臨床適用性進行評價時,包含以下4個部分內(nèi)容:患者的選擇、待評價的試驗、參考的標準、病例流程及進展,每個部分包含若干個評價問題,具體見結(jié)果中相關報道[10].

1.7 資料分析

采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)中的RevMan 5.3軟件進行數(shù)據(jù)處理,選擇其中的診斷試驗準確性回顧的模式,完成質(zhì)量評價部分工作.由于Revman中無法對不同診斷試驗的準確度指標進行合并分析[11],因此僅對各檢測方法的結(jié)果進行描述性分析.

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

經(jīng)過初檢,得到相關文獻177篇,對以上文獻標題進行閱讀,剔除97篇文獻,對保留的80篇文獻進行摘要和全文篩選,最終納入7篇文獻,其中中文文獻4篇,英文文獻3篇.文獻篩選的過程見圖2.

2.2 文獻基本特征及質(zhì)量評價

圖2 文獻篩選流程及結(jié)果

圖3 納入文獻質(zhì)量評價(總體)

圖4 納入文獻質(zhì)量評價(納入的每項研究)

納入研究中的基本特征主要包括:作者及年限、研究類型、研究對象、研究方法、樣本量、檢出的微生物種類以及結(jié)局指標,其中由于各文獻中報道的結(jié)果統(tǒng)計指標各不相同,故未統(tǒng)一分類列出,結(jié)局指標以檢出率為主.表格中總結(jié)了對口腔定植菌的10種檢測技術(shù),共計474例研究對象,具體見表1.

納入文獻的方法學質(zhì)量評價總體結(jié)果見圖3和圖4,其中包含了兩部分評價結(jié)果,圖3是對7篇納入文獻的總體質(zhì)量評估結(jié)果,主要從偏倚和適用性進行評價;圖4是分別對7篇文獻的每一個評估條目進行具體評分的結(jié)果.

表1 納入文獻一般特征

3 討論

3.1 文獻檢索

在確定關鍵檢索詞的過程中,研究者首先嘗試使用quot;口腔定植菌quot;及quot;檢測方法quot;兩個相關檢索詞,但在最初的粗略查找文獻過程中發(fā)現(xiàn),這一檢索方法導致檢索范圍過大,納入了一些并非對檢測方法進行研究的文獻,如對某種細菌的特性進行研究.而加入quot;氣管插管quot;這一關鍵檢索詞進行限定時,又導致檢出結(jié)果過少.因此,為增強對檢測方法研究的檢出率,故將結(jié)局指標(如quot;檢出率quot;quot;特異性quot;quot;靈敏性quot;quot;準確性quot;)等加入檢索詞.在此基礎上進行檢索的結(jié)果針對性較好,經(jīng)過嚴格的篩選過程,最終保留了7篇中英文文獻.

3.1.1 文獻質(zhì)量 在文獻質(zhì)量評價的過程中,由于Kishi的研究[18]中采用了新的口腔中硫化物濃度測定方法來判斷口腔細菌種類,但其結(jié)果分析過程中主要針對硫化物濃度對吸煙人群的相關性進行分析,而未報道硫化物測定結(jié)果與口腔細菌種類的關系,因此對該研究的質(zhì)量評價結(jié)果,兩位評價員存在分歧,經(jīng)第三位具有一定循證護理研究經(jīng)驗的人員進行協(xié)助評判,最終給予適用性欠佳的評價結(jié)果.對于另外一篇Aas的研究文獻[16],其使用了16SrRNA測序法來進行細菌檢測,文章中僅提到了對照方法為不依賴培養(yǎng)分子分析技術(shù),但其對照組報道的結(jié)果在以往發(fā)表的文章中進行了說明.由于在檢索時將時間范圍限定在2005年1月1日～2015年4月,因此沒有包含對照組文獻,故對不依賴培養(yǎng)分子分析技術(shù)的報道追溯參考文獻,重新閱讀其研究方法與結(jié)果,在進行質(zhì)量評價時將其作為參照檢測方法,從而得出評價結(jié)果.

納入的研究均詳細說明了研究對象的基本特征、口腔樣本采集方法、細菌培養(yǎng)方法等,采用DNA探針或PCR引物技術(shù)的還詳述了模板DNA制備、PCR引物選擇與擴增方法等,文章質(zhì)量尚可.各研究中的研究對象均不同,因此納入研究中不同的檢測方法對特定人群的適應性差異較大.

3.1.2 納入文獻的基本特征 由于本系統(tǒng)評價針對的是檢測技術(shù),因此并未規(guī)定檢測細菌的種類,因此文獻在菌種的報道上較為豐富,除了口腔中常見的伴放線桿菌、福塞氏桿菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌,還包括用于診斷其他疾病的細菌,如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等.由于口腔中的各種微生物種類繁多,因此受不同疾病影響導致口腔中的主要菌群差異明顯.Aas的研究[16]結(jié)果顯示,使用16SrRNA技術(shù)可以測出141種口腔細菌,實際上人類口腔中細菌種類還要豐富.王忠朝等人的研究[14]直接采用了三種菌種的標準株來進行實驗,而并未在特定人群中進行菌株采集,但由于以上三種菌種均為口腔常見細菌,對本系統(tǒng)評價的結(jié)果沒有影響,故該文獻同樣予以保留.現(xiàn)有的關于口腔定植菌或微生物檢測方法中,大多數(shù)是針對口腔疾病進行的研究,如牙周炎、口腔正畸治療等;同時納入的7篇文獻中研究對象同時包括正常人群與異常人群,但其中異常人群并未包含需經(jīng)氣管插管或機械通氣的危重患者,因此該類患者常見的定植菌種類亦有待進一步研究.

3.2 口腔定植菌檢測方法

以上7篇文獻中基本包括了當前主要應用的幾種口腔定植菌檢測方法,如傳統(tǒng)的涂片鏡檢法、細菌培養(yǎng)法、菌落形成單位法,以及應用越來越廣泛的DNA探針和PCR技術(shù).

張曉娟研究[12]發(fā)現(xiàn),涂片法對結(jié)核桿菌的陽性檢出率僅為DNA探針雜交法的一半,其差異具有統(tǒng)計學意義;同時涂片法的檢測周期較長,常需要2～3個月完成.相比之下,使用DNA探針的方法不僅提高了檢出率,還大大縮短了檢測時間,能夠滿足臨床需要.DNA探針能夠與樣本中經(jīng)過處理的微生物DNA單鏈雜交配對[19],其特異性能夠大大增加檢測的敏感程度,使檢出菌種遠高于常規(guī)的涂片法.

黃香娥等[13]使用了多重PCR方法與細菌培養(yǎng)法,對口腔中四種常見細菌進行檢測.傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法雖然是標準檢測方法,但由于不同細菌所需的培養(yǎng)條件迥異,因此盡管該研究中使用的擴增細菌DNA方法的檢出效果與標準方法結(jié)果類似[20],作者仍推薦將前者應用于臨床檢測口腔細菌.該研究中使用的多重PCR能夠通過設計多個引物,擴增多種細菌,大大提高了PCR檢出的效率.

王忠朝等[14]在對三種常見的口腔細菌進行檢測時使用了噻唑藍(Magnetic Tape Terminal ,MTT)法,同時選擇菌落形成單位法作為參照標準.MTT法除了用于檢測細胞增殖和細胞活性,還可以對體外培養(yǎng)的細菌測量其毒性.其原理是通過活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶還原MTT,使其形成結(jié)晶;使用酶標儀測定其光吸收值,吸光度越大,形成的結(jié)晶越多,意味著細胞活性越強.該方法在最佳波長時誤差最小,測定的結(jié)果最為準確[21].但由于其對細菌濃度有要求,因此在符合要求的濃度范圍內(nèi)檢測效果較好,而達不到要求濃度時該方法也存在一定的缺陷.

張澤等[15-18]均在其使用了16SrRNA片段擴增方法,該方法實際上也是PCR技術(shù)中的一種,由于這一段基因序列高度保守,因此其一般用作細菌分類的金標準.據(jù)估計,人類口腔中存在的微生物有接近700種[22],在Aas的研究[16]中,使用16SrRNA檢出了141種口腔微生物,具有極高的靈敏度.另外,該方法還避免了傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)與分離過程中耗時、多種微生物混雜難以分離的缺點,大大方便了臨床應用.實際上,在文獻檢索過程中也有一些報道使用了本課題中采用的16SrDNA作為引物片段進行細菌檢測,但由于其未符合本研究的納入標準,故以上進行質(zhì)量評價的文章中并未有對該方法的介紹和研究.這兩種方法均具有較強的檢出率,并且相比之下應用16SrDNA片段序列分析能夠大大提高少見菌種的鑒定成功率,比16SrRNA有著更為廣闊的應用前景.

除了以上文獻中采用的檢測方法,其他的常用的方法還包括:酶學方法(針對一組致病菌產(chǎn)生的酶,無法到具體的某個細菌)、免疫學技術(shù)(如熒光標記或酶聯(lián)免疫反應,該方法很大程度上依賴于試劑盒的質(zhì)量)、細菌基因芯片技術(shù)等[23].

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R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616(2017)22-23-05

江蘇省鹽城市醫(yī)學科技發(fā)展計劃項目(YK2016051);江蘇省高校quot;青藍工程quot;(蘇教師[2016]15號);江蘇省青年醫(yī)學人才(QNRC2016805).

▲通訊作者

2017-09-21)