申炳俊， 劉占偉, 劉榮娟, 張佳佳, 林曉倩, 田 堅(jiān), 金麗虹*

(1. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 清潔能源技術(shù)研究所， 吉林 長(zhǎng)春 130022; 2. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130022)

柯里拉京與DNA相互作用的光譜研究

申炳俊1， 劉占偉2, 劉榮娟2, 張佳佳2, 林曉倩2, 田 堅(jiān)1, 金麗虹2*

(1. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 清潔能源技術(shù)研究所， 吉林 長(zhǎng)春 130022; 2. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130022)

在pH 7.4的生理?xiàng)l件下，以溴化乙錠(EB)作為熒光探針，利用熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、共振散射光譜法結(jié)合鹽效應(yīng)和DNA熔點(diǎn)(Tm)實(shí)驗(yàn)研究了柯里拉京(Cor)與小牛胸腺DNA分子之間的相互作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cor靜態(tài)猝滅DNA-EB體系的熒光。Cor與DNA作用后，其特征吸收峰強(qiáng)度發(fā)生減色效應(yīng)；與DNA作用導(dǎo)致Cor在480.5 nm處的共振散射峰增強(qiáng)，并在330.2 nm處出現(xiàn)新共振散射峰。鹽效應(yīng)對(duì)Cor與DNA分子相互作用的影響較小。與Cor作用引起DNA的Tm值升高5.5 ℃。由此推斷，Cor與DNA相互作用的主要方式為嵌插，兩者間形成了超分子體系。通過計(jì)算獲得Cor與DNA間結(jié)合常數(shù)(KA)為5.82×103L/mol (298 K)、2.47×104L/mol (310 K)，它們之間的作用為熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)、吸熱過程，疏水作用力是主要的非共價(jià)作用方式。

柯里拉京； 小牛胸腺DNA； 光譜學(xué)； 嵌插； 反應(yīng)機(jī)理

1 引 言

柯里拉京(Corilagin，Cor)又名鞣云實(shí)精(或柯子次鞣素)，屬于一種天然的多酚單寧酸類化合物，是葉下珠、老鸛草、蜜柑草、白三草等多種植物的有效成分。1951年，Schmidt等[1]率先從植物薄葉云實(shí)中分離得到Cor，但在隨后的30多年里，人們并沒有注意到Cor的藥理活性。直到1985年，Kakiuchi等[2]偶然發(fā)現(xiàn)Cor對(duì)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用，進(jìn)而引發(fā)了人們對(duì)Cor藥理活性的研究。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，Cor具有護(hù)肝、抗炎、抑制病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，尤其在抗腫瘤、抗氧化方面藥效良好[3-5]。研究表明，Cor對(duì)肝癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、胃腺癌、喉癌、鼻腔癌等多種人源或鼠源癌細(xì)胞具有很好的抑制作用[6-8]。Cor表現(xiàn)出的多種生物活性及優(yōu)異的抗癌活性，使其具有重要藥用價(jià)值和廣闊市場(chǎng)前景。

DNA是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，亦是多種具有抗癌、抗病毒等活性的藥物小分子在生物體內(nèi)的主要靶點(diǎn)，藥物小分子與DNA插入方式可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[9]。因此，研究藥物小分子與DNA間的作用機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步了解其藥物作用機(jī)制，還可為尋求新型高效低毒抗腫瘤藥物提供導(dǎo)向。目前，有關(guān)Cor抗腫瘤分子機(jī)理研究，主要從誘導(dǎo)凋亡[7,10]、阻斷細(xì)胞周期[6]、抑制腫瘤發(fā)生[2]及增強(qiáng)腫瘤化療藥物的藥效等[11]方面開展。而從Cor與DNA相互作用機(jī)制方面研究Cor抗腫瘤機(jī)理還鮮見報(bào)道。

基于此，本文以Cor為研究對(duì)象，在生理?xiàng)l件(pH7.4，離子強(qiáng)度0.1mol/L)下，采用紫外-可見光譜法、熒光光譜法和共振散射光譜法等技術(shù)，結(jié)合離子強(qiáng)度和DNA熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，從分子水平上探索Cor與DNA作用機(jī)理，揭示Cor對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的作用強(qiáng)度和影響程度，為在單分子水平上研究Cor抗腫瘤機(jī)理提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的儀器主要有UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)、F-280熒光分光光度計(jì)(天津港東公司)、320pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器公司)、DC-4006高精度恒溫水浴(上海菁海儀器公司)和QL-901振蕩器(江蘇其林貝爾儀器公司)等。小牛胸腺DNA(Sigma公司)用pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液配成濃度為4.9×10-4mol/L DNA儲(chǔ)備液?？吕锢?Cor，成都普菲德公司)用無水乙醇配成濃度為1.0×10-4mol/L溶液。溴化乙錠(EB，Sigma公司)用二次蒸餾水配成濃度為3.0×10-5mol/L溶液。儲(chǔ)備液置于4℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，其他試劑均為分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1吸收光譜

取6支7mL比色管，分別加入600μL Cor溶液和不同體積的DNA溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至3mL，漩渦充分混合，在室溫下作用30min后分析。以相應(yīng)濃度的DNA溶液為參比液，掃描200～550nm范圍內(nèi)的Cor-DNA體系吸收光譜。以緩沖溶液為參比液，獲得1.5×10-5mol/L DNA溶液吸收光譜。

2.2.2熒光光譜

在7mL比色管中加入DNA-EB(濃度比1∶8.3)溶液，充分混合后，在恒溫水浴(298K,310K)中作用30min，完成EB與DNA的結(jié)合作用。向DNA-EB體系中依次加入不同體積的Cor溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容，獲得Cor-DNA-EB三元體系。旋渦振蕩后，繼續(xù)在恒溫水浴中作用30min，掃描熒光發(fā)射光譜。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為488nm，激發(fā)(Eex)/發(fā)射狹縫(Eem)為10nm/5nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為570～640nm。

2.2.3共振散射光譜測(cè)定

在同步掃描模式下，記錄Cor和Cor-DNA體系共振散射光譜。設(shè)定Δλ=0(λem=λex)，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)均為200～700nm，狹縫設(shè)定同熒光發(fā)射光譜。

2.2.4離子強(qiáng)度影響

向DNA-EB、Cor-DNA-EB兩體系中分別加入不同體積的1.0mol/L的NaCl溶液，記錄NaCl不同濃度時(shí)的熒光發(fā)射光譜，參數(shù)同前。

2.2.5DNA熔點(diǎn)影響

將DNA和DNA-Cor(濃度比1∶2.4)兩體系放置于20～95℃下10min，迅速取出測(cè)量260nm處的吸光度。兩體系參比液分別為緩沖溶液和相應(yīng)濃度的Cor溶液，溫度間隔為5℃。

3 結(jié)果與討論

3.1紫外-可見吸收光譜法研究Cor與DNA的作用

1～6:cDNA=(0,2.9,5.1,11.0,16.0,22.0)×10-6mol/L,cCor=2.0×10-5mol/L,7:cDNA=1.5×10-5mol/L

圖1DNA濃度對(duì)Cor的紫外-可見吸收光譜的影響

Fig.1Effect of the concentration of DNA on UV-Vis spectra of Cor

3.2熒光光譜法研究Cor與DNA的作用

Cor無熒光特性，而DNA的熒光很弱，因此無法通過測(cè)定Cor或DNA的內(nèi)源熒光來獲得它們之間的相互作用信息。溴化乙錠(EB)是一種熒光染色劑，在水中熒光很弱。當(dāng)EB菲錠環(huán)平行地插入到DNA雙螺旋堿基對(duì)之間區(qū)域后，其熒光強(qiáng)度大大增加，因而EB是DNA嵌入結(jié)合常用的熒光探劑[14]。以488nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)得DNA-EB體系熒光發(fā)射峰位于601nm處，如圖2所示。濃度逐漸增加的Cor引起DNA-EB體系熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，而對(duì)峰位和峰形幾乎沒有影響。這說明Cor能夠猝滅DNA-EB體系的熒光，Cor與EB競(jìng)爭(zhēng)和DNA結(jié)合，嵌入到DNA中的EB逐漸被Cor置換出來，進(jìn)而導(dǎo)致DNA-EB體系熒光減弱。因此，可以推斷Cor以嵌入方式與DNA發(fā)生結(jié)合。

cDNA=1.5×10-5mol/L,cEB=1.8×10-6mol/L,1～10:cCor=(0,1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,14.0,18.0,23.0)×10-6mol/L

圖2Cor對(duì)DNA-EB體系的熒光光譜的影響

Fig.2Effects of Cor on the fluorescence spectra of EB-ctDNA(T=298K,λex=488nm)

3.2.1熒光猝滅方式及結(jié)合常數(shù)確定

Cor引起DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度降低的原因主要有：(1) Cor與EB間發(fā)生了結(jié)合作用；(2) 嵌入到DNA中EB被Cor競(jìng)爭(zhēng)從雙螺旋結(jié)構(gòu)中擠出，Cor與DNA間形成了復(fù)合物，產(chǎn)生靜態(tài)猝滅；(3) Cor以動(dòng)態(tài)猝滅方式引起DNA-EB體系熒光強(qiáng)度下降。為了明確Cor與EB間是否存在相互作用，文中進(jìn)行了Cor猝滅EB熒光光譜實(shí)驗(yàn)，Cor的加入對(duì)EB熒光強(qiáng)度和發(fā)射峰位幾乎沒有影響，說明Cor與EB間沒有結(jié)合作用。

無論是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，其熒光強(qiáng)度均遵循Stern-Volmer方程[15]：

(1)

式中，F(xiàn)0、F分別為Cor加入前后DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子碰撞過程的速率常數(shù)；τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命(τ0≈1×10-8s)；[Q]為猝滅劑平衡濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。結(jié)果列于表1中。由表1可知，KSV值隨溫度的升高而降低，且Kq的數(shù)量級(jí)為1012，遠(yuǎn)大于2×1010L/ (mol·s)[16](最大碰撞速率常數(shù))，說明Cor對(duì)DNA-EB熒光強(qiáng)度的猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

由Lineweacer-Burk雙對(duì)數(shù)方程 (lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q])[17]求得結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果列于表1。Cor與DNA-EB的KA數(shù)量級(jí)為103～104，說明結(jié)合力適中。另外，KA隨溫度升高而增大，表明Cor與DNA的結(jié)合過程為吸熱反應(yīng)。

表1 Cor與DNA-EB作用的猝滅常數(shù)KSV、結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和熱力學(xué)參數(shù)

3.2.2 熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

小分子與生物大分子間作用力屬于分子間的弱相互作用，主要包括氫鍵作用力、范德華力、靜電作用力和疏水作用等非共價(jià)鍵。根據(jù)結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)(ΔH、ΔS和ΔG)大小和符號(hào)，可以判斷小分子與生物大分子間的主要作用力類型[18]。

(2)

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS,

(3)

Cor與DNA-EB體系反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。ΔH>0和ΔS>0表明Cor與DNA間非共價(jià)作用方式以疏水作用力為主，而ΔG<0和ΔH>0說明它們之間的相互過程為熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)、吸熱過程。

3.3 共振散射光譜法研究Cor與DNA的作用

在利用共振散射光譜(RLS)研究Cor-DNA體系共振光譜特性之前，先對(duì)Cor和DNA的RLS特征進(jìn)行表征。不同濃度Cor的RLS見圖3(a)?？梢钥闯?，Cor在372.1～400.0 nm范圍內(nèi)都存在RLS譜帶，兩個(gè)尖銳的RLS峰位于450 nm和481 nm。RLS強(qiáng)度均隨Cor濃度的增加而逐漸變大，說明Cor濃度效應(yīng)引起自聚集作用[19]。DNA溶液的RLS光譜見圖3(b)中的曲線6。可以看出，DNA在364.7 nm處有RLS峰，其強(qiáng)度低于Cor，曲線較平緩。當(dāng)Cor與DNA反應(yīng)形成結(jié)合產(chǎn)物后，其RLS見圖3(b)中曲線1～4。由圖可知，Cor-DNA體系RLS強(qiáng)度隨Cor濃度增加呈現(xiàn)出增大趨勢(shì)，同時(shí)體系的RLS形狀發(fā)生改變，在330 nm處出現(xiàn)了新的共振散射峰。當(dāng)Cor濃度為4.0×10-6mol/L時(shí)，位于481 nm處的共振散射峰銳增。這是由于Cor以苯環(huán)結(jié)構(gòu)嵌插到DNA堿基對(duì)后，由于Cor有不同程度的自聚集能力，可在DNA插入處表面完成自身聚集，成為超分子體系，使體系出現(xiàn)新的共振散射峰。另外，超分子體系的形成導(dǎo)致Cor-DNA體系體積變大，從而引起共振光散射增強(qiáng)。

(a) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L. (b) 1～4:cCor=(1.0, 2.0, 3.0, 4.0)×10-6mol/L,cDNA=4.2×10-6mol/L; 5:cCor=1.0×10-6mol/L, 6:cDNA=4.2×10-6mol/L.

圖3 Cor(a)和Cor-DNA(b)體系的共振散射強(qiáng)度

Fig.3 RLS intensity in different complex concentration of Cor(a) and Cor-DNA(b) (T=310 K,λex=λem)

3.4 鹽效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

DNA的磷酸基骨架帶有負(fù)電荷，很容易和帶正電荷的離子產(chǎn)生靜電作用。對(duì)于EB等嵌入到DNA內(nèi)相鄰的堿基對(duì)之間的小分子而言，由于受到相鄰堿基對(duì)的保護(hù)，它對(duì)周圍環(huán)境的改變并不敏感[12]。若小分子以靜電作用模式與DNA結(jié)合，則增加的Na+勢(shì)必會(huì)競(jìng)爭(zhēng)與DNA結(jié)合，導(dǎo)致DNA磷酸骨架周圍包裹Na+，進(jìn)而阻止DNA與小分子的結(jié)合。不同濃度NaCl對(duì)DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光強(qiáng)度的影響結(jié)果見圖4。由圖可知，當(dāng)Na+濃度為1.5×10-3mol/L時(shí)，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的F0/F分別為1.030和1.034。即Na+增加導(dǎo)致DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光強(qiáng)度微弱降低(0.30%和0.34%)，但趨勢(shì)相同。其原因在于，Na+等鹽類陽(yáng)離子能以靜電方式與DNA的磷酸根作用，進(jìn)而導(dǎo)致DNA磷酸骨架的靜電斥力減小，DNA鏈結(jié)構(gòu)緊縮。相對(duì)于緊縮DNA結(jié)構(gòu)而言，生理?xiàng)l件下DNA結(jié)構(gòu)則更有利于堿基堆積的形成。因此，嵌入到DNA相鄰堿基對(duì)之間的EB和Cor，盡管受到上、下堿基對(duì)的保護(hù)對(duì)周圍環(huán)境中的Na+改變不敏感，但逐漸增加的Na+仍導(dǎo)致DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系熒光猝滅。由此可知，Cor與DNA間的結(jié)合不是靜電結(jié)合或溝槽結(jié)合模式，而應(yīng)該為嵌插結(jié)合。另外，當(dāng)Na+濃度為1.0～1.5×10-3mol/L范圍內(nèi)時(shí)，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的熒光強(qiáng)度趨于平衡。這是由于在該條件下，DNA磷酸根幾乎完全被Na+中和，其DNA結(jié)構(gòu)緊縮程度具有相似性。而在Na+濃度相同條件下，DNA-EB和Cor-DNA-EB兩體系的熒光強(qiáng)度有所差別。這是由于EB三環(huán)平面基團(tuán)和Cor苯環(huán)結(jié)構(gòu)均以嵌入方式插入到DNA堿基對(duì)中，并形成有效堆積力，但其作用強(qiáng)度有所差別，Cor與DNA的堿基堆積力較EB略強(qiáng)。

圖4 NaCl對(duì)DNA-EB和Cor-DNA-EB熒光強(qiáng)度的影響

Fig.4 Effects of NaCl on the fluorescence intensity of DNA-EB and Cor-DNA-EB system

3.5 熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

小分子與DNA的相互作用能夠影響DNA熔點(diǎn) (Tm)。其中，嵌入式結(jié)合能夠提高DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，使Tm增加5～8 ℃，而非嵌入式結(jié)合一般對(duì)DNA的Tm影響不大[20]。以溫度T為函數(shù)，繪制fss關(guān)于T的曲線(fss=ΔA′/ΔA=(A-A0)/(Af-A0))(A為表觀吸光度，A0為起始吸光度，Af為最終吸光度)。fss=0.5時(shí)，熔點(diǎn)曲線對(duì)應(yīng)的溫度即為Tm。DNA和Cor-DNA熔解曲線見圖5。由圖可知，DNA的熔點(diǎn)為77 ℃，與Cor作用后DNA的Tm為82.5 ℃，即Tm增加了5.5 ℃。這再次表明，Cor與DNA發(fā)生了嵌插作用，該作用增加了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

cDNA=3.7×10-5 mol/L, cCor=9.0×10-5 mol/L

Fig.5 Thermal melting curves for DNA in the absence and presence of corilagin

4 結(jié) 論

采用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和共振散射光譜手段結(jié)合鹽效應(yīng)和熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)研究了Cor與小牛胸腺DNA的作用機(jī)制。在熵驅(qū)動(dòng)下，Cor苯環(huán)結(jié)構(gòu)能自發(fā)地嵌入到DNA堿基對(duì)中，堿基堆積是兩者間結(jié)合的非共價(jià)作用方式，其作用強(qiáng)度適中。另外，Cor在DNA嵌入處聚集形成超分子體系，該過程為吸熱反應(yīng)。

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StudyonMechanismofInteractionsBetweenDNAandCorilaginbySpectroscopy

SHENBing-jun1,LIUZhan-wei2,LIURong-juan2,ZHANGJia-jia2,LINXiao-qian2,TIANJian1,JINLi-hong2*

(1.LaboratoryofCleanEnergyTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

Under the physiological condition of pH7.4, using ethidium bromide (EB) as the fluorescent probe, the interaction mechanism between coriolis (Cor) and calf thymus DNA was studied by UV-Vis absorption spectroscopy, resonance scattering spectroscopy combined with salt effect and DNA melting point. Cor can quench the fluorescence of EB-DNA system through a static process. The subtractive effect of the characteristic absorption peak occurrs after Cor interacts with DNA. The interaction leads to the enhancement of Cor resonance at481nm and a new resonance scattering peak at330nm. The salt effect has a little influence on the interaction between Cor and DNA. The interaction leads to the increase of theTmof DNA by5.5℃. It is deduced that the main way of the interaction between Cor and DNA is intercalation, and a supramolecular system is formed between them. The binding constant (KA) between Cor and DNA is5.82×103L/mol (298K) and2.47×104L/mol (310K). The interaction between Cor and DNA is entropy-driven spontaneous, endothermic. Hydrophobic forces are the main non-covalent mode of action.

corilagin; calf thymus DNA; spectra method; intercalation; reaction mechanism

2017-04-24；

2017-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(21153003)； 吉林省教育廳項(xiàng)目(201574)； 長(zhǎng)春理工大學(xué)博士后基金(2014年,889)資助項(xiàng)目

Supported by National Natural Science Foundation of China (21153003); Project of Jilin Provincial Department of Education (201574); Postdoctoral Fund of Changchun University of Science and Technology (2014,889)

1000-7032(2017)12-1681-07

O657.3

A

10.3788/fgxb20173812.1681

*CorrespondingAuthor,E-mail:jinlh@cust.edu.cn

申炳俊(1977-)，男，吉林通化人，博士，助理研究員，2017年于長(zhǎng)春理工大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事光譜分析理論與應(yīng)用的研究。E-mail : bjshen@cust.edu.cn

金麗虹(1978-)，女，黑龍江富錦人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，2011年于長(zhǎng)春理工大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事物質(zhì)相互作用、生物檢測(cè)等的研究。E-mail : jinlh@cust.edu.cn