付小瓊，葉武威，彭軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000）

利用SSR標(biāo)記檢測(cè)棉鈴種仁DNA鑒定雜交種純度

付小瓊*，葉武威，彭軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000）

利用棉鈴種皮DNA和種仁DNA的差異，通過Simple sequence repeats(SSR)分子鑒定技術(shù)在棉花制種后期快速檢測(cè)制種質(zhì)量。篩選雜交種親本間的多態(tài)性SSR引物，應(yīng)用多態(tài)性引物鑒定棉鈴種仁的指紋圖譜，指紋圖譜與種皮一致，表明該棉鈴為自交鈴；種仁圖譜為共顯性譜帶，則該棉鈴為雜交鈴，計(jì)算雜交鈴的比例得出雜交種的制種純度。F2的圖譜分離驗(yàn)證了遺傳的分離規(guī)律，F(xiàn)2的個(gè)體間具有不同的指紋圖譜，育種過程中的雜交后代的分子檢測(cè)能加速育種進(jìn)程。

棉花；棉鈴；親本；雜交種；純度；DNA；SSR

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，雜交種通常具有豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。棉花雜交種長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，早發(fā)性好，產(chǎn)量高，也得到了廣大棉農(nóng)的認(rèn)可。近年來，由于農(nóng)村勞動(dòng)力向城市轉(zhuǎn)移，棉花制種用工越來越緊缺，用工價(jià)格也越來越高，雜交棉制種的質(zhì)量問題突出，存在剝大花、漏制種等現(xiàn)象，雜交種純度難以保證。由于雜交種F1制種成本太高，種業(yè)公司開始推廣應(yīng)用F2，一些雜交組合F2代仍有較大的雜種優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)上有一定的利用價(jià)值。如果要利用F2，那么必須保證F1較高的純度，對(duì)制種質(zhì)量要求高。在常規(guī)的制種純度檢測(cè)中，制種公司只能在種子收獲后抽樣去海南加代檢測(cè)純度（田間檢測(cè)），檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且異地種植受環(huán)境條件影響大，效果不理想，在時(shí)間上也影響種子的銷售[1]。

近年來，有制種公司采用SSR(Simple sequence repeats)分子標(biāo)記來檢測(cè)種子純度[2]，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，并且避免異地種植環(huán)境對(duì)植株表型的影響。制種公司先要以農(nóng)戶為單位收集種子，在播種期前完成種子純度檢測(cè)和銷售，工作量大、批次多、時(shí)間緊。因此，作者探索了1種通過檢測(cè)棉鈴的種皮DNA和種仁DNA的SSR分子標(biāo)記圖譜確定雜交種純度的方法。采用該方法，在收獲前就能了解農(nóng)戶的制種質(zhì)量，且能減少監(jiān)管工作，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

鄂雜棉10號(hào)購(gòu)自湖北惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司，種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)試驗(yàn)基地（河南省安陽縣），自然授粉。成鈴期取葉片和棉鈴。瑞雜816的父本、母本及雜交種來自濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司，種植于東場(chǎng)試驗(yàn)基地，生長(zhǎng)期取葉片。瑞雜816棉鈴取自濟(jì)南鑫瑞種業(yè)科技有限公司的制種田。

1.2 方法

1.2.1 引物合成與試劑來源。SSR引物由上海生工合成，Taq酶、dNTPs等購(gòu)自安陽科睿生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 棉花基因組DNA的提取。葉片單株取樣，種皮、種仁單粒取樣，用萊馳MM301震蕩研磨儀（德國(guó)）進(jìn)行冷凍研磨。DNA提取參考付小瓊等[2]的方法。

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增。PCR （Polymerase chain reaction）擴(kuò)增體系：模板 DNA 1 μL，Buffer（含 MgCl2）1 μL，dNTPs（10 mmol·L－1）0.3 μL，正、反向引物（10 μmol·L－1）各 0.5 μL， Taq 酶（2.5 U·μL－1） 0.2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94 ℃變性 30 s、56 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 45 s，共30個(gè)循環(huán)；94℃變性 1min、56℃退火 45 s、72℃延伸2min；擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。每個(gè)孔點(diǎn)樣品 2 μL，200 V 電壓 10 h。 固定 10min， 滲透 12min，顯色 5min，倒入終止液，終止反應(yīng)[3]。

1.2.5 SSR擴(kuò)增譜帶的定義。在2個(gè)親本間存在多態(tài)性的引物 （表1），擴(kuò)增親本和雜交種后譜帶分為3種。一般在同一引物擴(kuò)增圖譜中依最小擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量大小來分類，當(dāng)最小產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量相同時(shí)以次小產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分類，依此類推。相對(duì)分子質(zhì)量低的譜帶類型記為1，相對(duì)分子質(zhì)量高的譜帶類型記為2，雜合共顯帶類型記為3[4]。

1.2.6 雜交棉制種純度的計(jì)算。檢測(cè)棉鈴的種仁DNA指紋圖譜與種皮DNA指紋圖譜一致，該棉鈴為自交鈴；種仁DNA指紋圖譜為共顯帶型且與種皮DNA指紋圖譜不一致，該棉鈴為雜交鈴。

表1 10對(duì)SSR引物的核苷酸序列

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴種子種皮和種仁DNA的提取及F2代遺傳分離的分子驗(yàn)證

鄂雜棉10號(hào)結(jié)鈴后，從代表植株上隨機(jī)取2個(gè)葉片和1個(gè)鈴期大于30 d的棉鈴。從該棉鈴中隨機(jī)取24個(gè)棉籽。分別剝?nèi)∶總€(gè)棉籽的種仁和其中的6個(gè)種皮，分別提取葉片、種皮和種仁的DNA，用表1中前8對(duì)SSR引物擴(kuò)增。

鄂雜棉10號(hào)的棉鈴種皮DNA擴(kuò)增圖譜與葉片DNA的圖譜相同，而F2種仁DNA擴(kuò)增圖譜出現(xiàn)分離且不同種仁的指紋圖譜不一致（圖1），印證了雜交后代的遺傳分離。

圖1 鄂雜棉10號(hào)F1棉葉、F2種皮和種仁DNA的SSR擴(kuò)增圖譜

葉片DNA和種皮DNA均為帶型3即表現(xiàn)共顯帶，是雜交F1的指紋圖譜。24個(gè)種仁在8對(duì)引物擴(kuò)增圖譜中有3種帶型，均表現(xiàn)分離。部分引物的擴(kuò)增圖譜見圖1，各材料的圖譜類型見表2。

表2 各樣本的帶型編碼

24個(gè)種仁的指紋圖譜均不相同，表明了F2的基因分離。F2不存在常識(shí)中的50%的雜交純度，只是對(duì)于某一性狀而言有50%雜合概率出現(xiàn)，對(duì)于多性狀觀察則幾乎沒有相同的植株。通過分子水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)棉仁樣品11、15和20在8對(duì)引物的擴(kuò)增下，僅有1對(duì)引物表現(xiàn)雜合，其余均為純合位點(diǎn)?？梢?，利用后代的分子檢測(cè)結(jié)合田間表現(xiàn)，選擇純合個(gè)體，能夠加快新品種育成。

2.2 瑞雜816田間制種質(zhì)量的檢測(cè)

2.2.1 親本和雜交種引物篩選。用34對(duì)核心引物在瑞雜816的兩親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到6對(duì)多態(tài)性引物，分別為NAU1186、NAU2026、NAU2274、CS62、NAU1103、NAU1233。利用 這 6對(duì)引物在父本、母本和F1中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增圖譜見圖2，父本和母本讀帶為1或2，F(xiàn)1為共顯帶型，讀為3。

圖2 6對(duì)SSR引物在瑞雜816和親本間的擴(kuò)增圖譜

2.2.2 田間取棉鈴檢測(cè)雜交種純度。從瑞雜816的制種田中隨機(jī)取20個(gè)鈴期大于30 d的棉鈴，每個(gè)棉鈴中隨機(jī)取4個(gè)種子，分別提取4個(gè)種仁和1個(gè)種皮的DNA，用上述的6對(duì)核心引物進(jìn)行擴(kuò)增。

從圖3和表3可以看出，17個(gè)棉鈴種皮與種仁帶型均不相同，為雜交種，另外3個(gè)種子的種皮和種仁帶型完全一致，為自交鈴。此制種田中棉花自交鈴的比例為15%，即制種純度為85%。而一般要求制種純度為90%以上，所以此制種田的制種質(zhì)量不理想。

圖3 引物NAU2026對(duì)瑞雜816制種田20個(gè)棉鈴的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究中鄂雜棉10號(hào)的F2種仁指紋圖譜的分離，反映了F2棉株個(gè)體的不同。另外，父母本差異大的雜交種須慎用F2。與目前常用的田間和室內(nèi)雜交種純度檢測(cè)方法相比，本方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）可以提前2個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，為種子的銷售贏得時(shí)間；（2）棉鈴殼厚，不易散失水分，且比葉片易于保存，異地取樣時(shí)氧化變質(zhì)速率慢，便于攜帶，不需特殊的設(shè)備，可以在棉花制種后期到制種田間隨機(jī)取棉鈴，帶回實(shí)驗(yàn)室后統(tǒng)一檢測(cè)，快速方便；（3）對(duì)檢測(cè)不合格的農(nóng)戶所制雜交種提前淘汰，省去采收、加工和運(yùn)輸?shù)馁M(fèi)用。這不僅可以約束制種商的作假行為，降低棉種公司的經(jīng)營(yíng)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可以省去部分監(jiān)管環(huán)節(jié)，樹立“誰制種誰負(fù)責(zé)”的理念，減少制種成本。

應(yīng)用本方法的建議：①有親本的指紋圖譜時(shí)，只鑒定種仁的圖譜就能鑒定雜交種的純度。②無親本的指紋圖譜時(shí)，須同時(shí)提取種皮與種仁DNA，以種皮的圖譜為參考，先少量檢測(cè)，篩選多態(tài)性引物；然后用篩選到的多態(tài)性引物檢測(cè)待測(cè)種仁的DNA。

表3 6對(duì)引物在瑞雜816棉鈴種子的種皮和種仁DNA的擴(kuò)增帶型統(tǒng)計(jì)

[1]周大云，楊偉華，魏守軍，等.棉種純度和真實(shí)性3種鑒定方法簡(jiǎn)介[J].中國(guó)棉花，2015，42(8):5-7.

[2]付小瓊，楊付新.利用SSR分子標(biāo)記鑒定中棉所63的真實(shí)性和純度[J].中國(guó)棉花，2016，43(2):17-20.

[3]張軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測(cè)[J].棉花學(xué)報(bào)，2000，12(5):267-269.

[4]付小瓊.2011年黃河流域棉花區(qū)試對(duì)照種的SSR指紋圖譜[J].中國(guó)棉花，2011，38(12):29-32. ●

Rapid Detection of Cotton Hybrid Purity by SSR Markers with Kernel DNA

Fu Xiaoqiong*,Ye Wuwei,Peng Jun

S562.03

A

1000-632X(2017)11-0028-05

10.11963/1000-632X.fxqfxq.20171103

2017-05-17

*通信作者：m13663726262@163.com

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)基金（1610162016018）