何麗針,夏 駿，姜文娟，徐國(guó)茂，李 勇，吳金剛

(1.江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,江西上饒 334000；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定三葉青塊根中槲皮素和β-谷甾醇的含量

何麗針1,夏 駿2，姜文娟2，徐國(guó)茂2，李 勇2，吳金剛2

(1.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,江西上饒 334000；2.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

為了準(zhǔn)確測(cè)定三葉青塊根中槲皮素和β-谷甾醇的含量，本實(shí)驗(yàn)以甲醇-鹽酸水為提取溶劑，利用回流法對(duì)不同產(chǎn)地的三葉青塊根中有效成份進(jìn)行了提取，建立并采用高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法對(duì)提取物中槲皮素和β-谷甾醇含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：槲皮素和β-谷甾醇之間分離度大于1.5，兩者的線性范圍為0.5～50μg/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。槲皮素、β-谷甾醇的檢測(cè)限分別為0.2mg/kg和0.5mg/kg，回收率分別為88.3-108.3%及80.1-103.3%，RSD分別為2.8～4.3%和5.5～7.2%。該方法具有良好的回收率和重復(fù)性，能夠?qū)θ~青塊根中的槲皮素和β-谷甾醇實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速的測(cè)定。

高效液相色譜法；內(nèi)標(biāo)法；三葉青；槲皮素；β-谷甾醇

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤的塊根或全草，其具有抗腫瘤、清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛作用，可用于治療小兒高熱驚厥、肺炎及各類腫瘤的輔助治療[1]三葉青的主要活性成份包括黃酮類、甾體類化合物和氨基酸[2]等，其中有實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素和β-谷甾醇在三葉青中含量較高，且具有特定藥理作用[3]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于三葉青中該兩種活性成份的含量測(cè)定方法有一定的研究，許文[4[5]利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三葉青中槲皮素和β-谷甾醇的方法未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用了高效液相色譜結(jié)合內(nèi)標(biāo)物定量方法應(yīng)用于三葉青塊根中槲皮素和β-谷甾醇的同時(shí)測(cè)定，并對(duì)不同產(chǎn)地的三葉青含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

三葉青塊根，人工栽培品種，于2015年4月分別購(gòu)自于湖南省長(zhǎng)沙市，湖北省武漢市及浙江省杭州市。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.0%）、大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)物（純度大于99.0%）和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度不低于99.1%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸（分析純）、三氯甲烷（分析純），西隴化工股份有限公司；甲醇（色譜純），霍尼韋爾試劑有限公司（韓國(guó)）；

1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE52CS1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)，法國(guó)威立雅有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素、β-谷甾醇及內(nèi)標(biāo)大黃素甲醚各10.00mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成1000.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取槲皮素、β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成10.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 提取

取三葉青塊根，粉碎，過(guò)三號(hào)篩。取本品約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，加大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05mL，混勻。加甲醇-25%鹽酸（1∶4,v/v）溶液 25mL，回流提取 1 h，濾過(guò)。將濾紙上殘?jiān)慈雸A底燒瓶后，重復(fù)上述步驟提取2次。合并提取液，55℃下旋轉(zhuǎn)蒸干。用三氯甲烷20mL復(fù)溶，旋轉(zhuǎn)蒸干。用甲醇5mL復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Paroshell EC-C18(4.6×50 mm,2.7μm)；流動(dòng)相A為純水，B為甲醇；梯度洗脫程度見(jiàn)表1；柱溫25℃，流速0.7ml/min，進(jìn)樣量5μl，波長(zhǎng)210 nm；內(nèi)標(biāo)法定量。

表1 梯度洗脫程序

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確量取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中大黃素甲醚內(nèi)標(biāo)濃度均為10.0μg/mL。按照1.4中的色譜條件測(cè)定峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值。以峰面積比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制槲皮素和β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)和內(nèi)標(biāo)的選擇結(jié)果

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素有三組紫外吸收峰，波長(zhǎng)分別為 210，250，360 nm[7]，為了能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?duì)兩種物質(zhì)的紫外光譜進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm處兩種物質(zhì)均有吸收，故采用210 nm波長(zhǎng)。紫外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

由于槲皮素和β-谷甾醇的分子極性差異較大，經(jīng)試驗(yàn)大黃素甲醚的極性介于兩者之間[8]，不會(huì)對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾，在波長(zhǎng)210 nm處有較大吸收，且三葉青中不含有該成份[9,10]，因此選擇大黃素甲醚作為該實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

圖1 槲皮素與β-谷甾醇紫外光譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制槲皮素和β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出槲皮素的回歸方程為y=1.7385x-0.2742，R2=0.9994；β-谷甾醇的回歸方程為 y=0.1649x-0.0012，R2=0.9996。

2.3 靈敏度和精密度

以2～5倍基線噪音響應(yīng)對(duì)應(yīng)的濃度測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)樣，以3倍信噪比（S/N）折算前處理方法估算方法檢出限，槲皮素的檢出限為0.2mg/kg，β-谷甾醇的檢出限為0.5mg/kg?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)樣及樣品色譜圖如圖2所示。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定槲皮素和β-谷甾醇的峰面積比。結(jié)果測(cè)得，槲皮素峰面積比RSD為0.68%，β-谷甾醇峰面積比RSD為0.98%。表明儀器及色譜方法和精密度良好。

圖2 三葉青提取物色譜圖

2.4 重復(fù)性

隨機(jī)選取相同三葉青樣品5份，按照1.3步驟提取后測(cè)定槲皮素和β-谷甾醇的峰面積比。結(jié)果顯示，槲皮素的峰面積比RSD為2.28%，β-谷甾醇峰面積比RSD為4.32%。

表2 添加回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 樣品測(cè)定及回收試驗(yàn)結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)工作液、不同產(chǎn)地的三葉青樣品及添加回收樣品按照1.3步驟提取后分別進(jìn)樣分析。三個(gè)不同產(chǎn)地的三葉青測(cè)定結(jié)果如表2所示。

選取已知含量的三葉青塊根樣品0.5g（浙江樣品：槲皮素 1.570 mg/kg，β-谷甾醇 1.051 mg/kg），添加一定量的槲皮素及β-谷甾醇對(duì)照品，按照1.3步驟提取后進(jìn)樣分析，結(jié)果如表3所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素在添加量為2.0～6.0 mg/kg范圍時(shí)，回收率為88.3-108.3%，RSD為2.8～4.3%；β-谷甾醇在添加量為 0.5～2.0mg/kg時(shí)，回收率在80.1-103.3%，RSD為5.5～7.2%。

表3 三葉青提取物含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論與小結(jié)

3.1 提取條件的選擇

在樣品提取過(guò)程中，由于槲皮素極性較強(qiáng)，三葉青中與其極性相近的成份較多，會(huì)對(duì)色譜分離產(chǎn)生干擾[11,12]，因此本實(shí)驗(yàn)依次利用甲醇-強(qiáng)酸溶液和三氯甲烷溶液兩步液液萃取對(duì)三葉青塊根進(jìn)行梯度萃取[13,14]，可以有效的去除三葉青中其它雜質(zhì)的干擾，達(dá)到理想的分離效果。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

由于槲皮素與β-谷甾醇的極性差異較大，因此必須采用梯度洗脫方式進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)比較了不同比例的乙腈-水、乙腈-磷酸鹽、甲醇-水和甲醇-磷酸鹽流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相采用100%乙腈時(shí)，60min內(nèi)未觀察到β-谷甾醇，只有使用濃度大于90%甲醇的洗脫系統(tǒng)，β-谷甾醇才能夠被檢測(cè)到。同時(shí)當(dāng)甲醇比例大于50%時(shí)，樣品中槲皮素受其它組份干擾較為嚴(yán)重，無(wú)法達(dá)到有效分離。因此本實(shí)驗(yàn)采用了甲醇-水作為流用相，用梯度洗脫方式進(jìn)行分離。結(jié)果表明其中槲皮素的保留時(shí)間約為7.95min，內(nèi)標(biāo)大黃素甲醚約為11.90min，β-谷甾醇的保留時(shí)間約為16.90min。分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于20000。

但是由于甲醇在210 nm波長(zhǎng)處有末端吸收，因此會(huì)對(duì)其靈敏度產(chǎn)生一定影響，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖表明的10min后基線平臺(tái)上升的現(xiàn)象也與該因素有關(guān)，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步改進(jìn)。另外，由于目前對(duì)三葉青中黃酮類藥物的測(cè)定技術(shù)較為成熟，因此可在今后的研究中，可對(duì)建立三葉青中黃酮類藥物和植物甾醇類藥物高通量的檢測(cè)方法進(jìn)行摸索，并進(jìn)一步完善三葉青指紋圖譜，最終建立三葉青藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)建立了利用高效液相色譜儀對(duì)三葉青塊根中槲皮素和β-谷甾醇含量測(cè)定的方法。該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，可有效的消除誤差，尤其是提取步驟的偶然誤差，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的線性、靈敏度、精密度、重復(fù)性和回收率等進(jìn)行了考察，并對(duì)不同產(chǎn)地的三葉青塊根進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，該方法相對(duì)準(zhǔn)確，穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)三葉青塊根中槲皮素和β-谷甾醇含量的測(cè)定。

[1]楊雄志.中藥三葉青的藥理作用與臨床應(yīng)用.吉林中醫(yī)藥,2009,29(6)∶517-518.

[2]黃真,毛慶秋,魏佳平.三葉青提取物抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)新藥雜志,2005,14(7)∶861-864.

[3]陳麗蕓.三葉青化學(xué)成分及抗腫瘤活性研究[D].福建中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[4]許文,傅志勤,林婧,等.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定三葉青中10種黃酮類成分[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,12∶1711-1717.

[5]劉洋,錢麗華.HPLC法測(cè)定三葉青中槲皮素和山奈酚含量研究[J].安微農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,21∶26-27

[6]浦錦寶,梁衛(wèi)青,鄭軍獻(xiàn),等.HPLC測(cè)定三葉青中槲皮素、山奈酚的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2011,2∶134-136

[7]王雅瓊,邵強(qiáng),沙鷗.β-谷甾醇酯化反應(yīng)過(guò)程中的反相高效液相色譜分析[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào),2005,8∶31-33

[8]聞?dòng)琅e,梁愛(ài)軍.聚酰胺對(duì)大黃素和大黃素甲醚分離研究[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào),2009,06∶53-54.

[9]陳麗蕓,郭素華.三葉青的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,12∶1368-1370.

[10]林婧,紀(jì)明妹,黃澤豪,等.三葉青的化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2015,08∶658-663.

[11]許文,傅志勤,林婧,等.HPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QqQ-MS的三葉青主要成分定性與定量研究[J].中國(guó)中藥雜志,2014,22∶4365-4372

[12]Xu CJ,DingGQ,Fu JY,etal.Immunoregulatory effects ofethylacetate fraction ofextracts From tetrastigma hemsleyanum dielset.Gilg on immune function of ICR mice[J]．Biomed Environ Sci,2008,21∶325-331．

[13]霍昕,楊迺嘉,劉文煒,等.三葉青塊根乙醚提取物成分研究[J].藥物分析雜志,2008,10∶1651-1653.

[14]程林,胡軼娟,浦錦寶,等.三葉青的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2013,4,297-298

S853.7

B

1003-8655（2017）05-0003-03

該項(xiàng)目為2014年高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ14794）。

2017-08-07

何麗針（1965—），女，副教授。研究方向?yàn)樗幬锓治龌瘜W(xué)。