王宇晴，孫雅北，矯佳陳琦，鄭春英

(黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

微生物轉(zhuǎn)化法提高甘草中甘草次酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王宇晴，孫雅北，矯佳陳琦，鄭春英

(黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

開發(fā)一種微生物轉(zhuǎn)化法提高甘草中甘草次酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的制備工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)甘草次酸提供新方法.以甘草內(nèi)生真菌RE4及甘草內(nèi)生真菌RE11混合液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理甘草后，甘草次酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，經(jīng)工藝優(yōu)化后甘草次酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到3.892 9 mg/g，是未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理時(shí)0.128 3 mg/g的30.34倍，采用超聲提取，大孔樹脂及硅膠柱分離轉(zhuǎn)化后的甘草樣品，經(jīng)分離后甘草次酸單體的產(chǎn)率可達(dá)2.03 mg/g，約為生藥中甘草次酸的30倍.微生物轉(zhuǎn)化甘草可以提高甘草次酸產(chǎn)率，具有工藝簡(jiǎn)單，能消耗少，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn).

甘草；微生物轉(zhuǎn)化；甘草次酸；提取

甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)，藥用植物甘草的主要活性成分[1]，為五環(huán)三萜類化合物[2]，具有明顯的抗菌[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6-7]、抗紫外線損傷[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]等多方面的藥理活性，是食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)的重要生產(chǎn)原料.當(dāng)前，甘草次酸原料主要采用傳統(tǒng)的酸化裂解法[10]從甘草生藥中提取，但此方法存在著生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、費(fèi)用高等缺點(diǎn).

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶系對(duì)外源性化合物進(jìn)行催化反應(yīng)的過程，反應(yīng)條件溫和、可提高食品、藥品中的某些活性成分含量[11]、可避免某些活性成分被分解破壞[12]、反應(yīng)產(chǎn)物立體選擇性好、較易獲得結(jié)構(gòu)新穎的化合物等特點(diǎn)；同時(shí)符合生物體代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)具有生理活性的代謝產(chǎn)物幾率高[13]，可為食品、藥品活性成分原料的獲得提供新方法.本文采用甘草內(nèi)生真菌RE4及內(nèi)生真菌RE11混合轉(zhuǎn)化烏拉爾甘草以提高甘草次酸的得率；同時(shí)對(duì)發(fā)酵樣品中的甘草次酸進(jìn)行提取分離，為甘草次酸原料的生產(chǎn)提供新方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

HZQ-C 空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；HPS-160電熱恒溫培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；高效液相色譜儀(FL2200，浙江溫嶺)；Venusil XBP C18色譜柱(Agela Technologies lnc).

實(shí)驗(yàn)用健康烏拉爾甘草樣品分別于2014年7～9月采自黑龍江省大慶地區(qū)，經(jīng)黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄭春英教授鑒定為烏拉爾甘草(GlycrrhizauralensisFisch).

甘草內(nèi)生真菌RE4(Aspergillus versicolor，CCTCC，No：M 2012045)及RE11(Penicillium chrysogenum，CCTCC，No：M 2012047)現(xiàn)保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心.

甘草次酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所110723-200612)；甲醇、冰醋酸為色譜純，其他試劑均為分析純.

PDA培養(yǎng)基：同文獻(xiàn)[14].

1.2方法

1.2.1 內(nèi)生真菌RE4及RE11菌懸液的制備

分別取已活化的甘草內(nèi)生真菌RE4及RE11(PDA培養(yǎng)基)，加入一定量無菌水，各制成1×106CFU/mL的菌懸液，備用.

1.2.2 甘草的生物轉(zhuǎn)化

精密稱取不同時(shí)間采集的6批甘草生藥樣品的根莖粉(40目)6g(每批樣品6份)，置于100 mL錐形瓶中，加入2倍量PDA(m/V)，密封，于121℃滅菌30 min，取出，作為底物備用；取“1.2.1”中的菌懸液各3 mL混勻后加入到底物中；另外，取底物加入 6 mL 無菌水作為空白對(duì)照樣品，將所有樣品放入轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床，于28 ℃培養(yǎng)5 d取出，凍干，凍干條件為：-20 ℃預(yù)凍6 h，設(shè)置冷肼溫度為-85 ℃，真空度0.5 MPa，加熱板溫度設(shè)置為10 ℃.樣品凍干至恒重后，將凍干樣品及時(shí)轉(zhuǎn)移至干燥器中保存，備用.

1.2.3 甘草次酸的質(zhì)量比變化

分別精密稱取甘草根莖、“1.2.2”項(xiàng)下甘草凍干樣品及空白對(duì)照樣品各1 g，準(zhǔn)確加入10 mL 甲醇，稱重，超聲 60 min，冷卻，取出，放冷，以甲醇補(bǔ)足減失的重量后過濾，取續(xù)濾液 4 mL于10 mL 容量瓶，定容后即為供試品溶液；采用HPLC法，參見文獻(xiàn)[15]分析計(jì)算甘草經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化前后其甘草次酸的質(zhì)量比變化.

1.2. 4 微生物轉(zhuǎn)化樣品中甘草次酸的提取分離

將RE4-RE11轉(zhuǎn)化后的甘草凍干樣品200 g，以70%乙醇浸泡90 min 后，超聲提取60 min，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得清膏，清膏用水溶解后通過D101型大孔樹脂柱，并以乙醇梯度洗脫(乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，95%).收集30%的乙醇餾分2 L，回收溶劑后進(jìn)行硅膠柱分離，并以石油醚∶乙酸乙酯(15∶5)洗脫后，再用石油醚∶乙酸乙酯(10∶10)洗脫，收集洗脫液，重結(jié)晶，得單體化合物；以甘草次酸為對(duì)照，利用薄層鑒別(硅膠GF254板，展開劑：石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(15∶5∶1))及HPLC/MS法確定所得單體化合物為甘草次酸.

2 結(jié)果討論

2.1轉(zhuǎn)化菌株的篩選

選取8株甘草內(nèi)生真菌：RP4，RP5，RE2，RE4，RE5，RE9，RE11，RE13為轉(zhuǎn)化菌株，利用這些菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘草，甘草次酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見表1.

組別菌株編號(hào)甘草次酸質(zhì)量比/(mg·g-1)1RP40.3080±0.0048**△△2RP50.3233±0.0026**△△3RE20.5228±0.0013**△△4RE40.6210±0.0025**△△5RE50.3847±0.0007**△△6RE90.5181±0.0019**△△7RE110.5266±0.0051**△△8RE130.1793±0.0039**△△9甘草生藥0.1283±0.001110空白樣品0.1236±0.000811PDA對(duì)照———

注：同甘草生藥組相比*P<0.05，**P<0.01；同空白對(duì)照組相比△P<0.05，△△P<0.01；PDA培養(yǎng)基中未檢測(cè)到甘草次酸產(chǎn)生.

由表1可以看出，甘草內(nèi)生真菌RE4、RE11轉(zhuǎn)化甘草的效率最高，為了實(shí)現(xiàn)甘草次酸的高效率轉(zhuǎn)化，將甘草內(nèi)生真菌RE4及RE11作為轉(zhuǎn)化菌株，并等量混合后發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘草，結(jié)果甘草次酸的質(zhì)量比可達(dá)3.274 3±0.003 1**△△，結(jié)果見圖1.

圖1 不同菌株轉(zhuǎn)化甘草樣品的HPLC 色譜圖A—甘草生藥；B—RE4-RE11轉(zhuǎn)化甘草樣品；C—RE11轉(zhuǎn)化甘草樣品；D—RE4轉(zhuǎn)化甘草樣品；E—甘草次酸對(duì)照品，1—甘草次酸

分析表1及圖1的結(jié)果，采用甘草內(nèi)生真菌RE4、RE11分別轉(zhuǎn)化甘草及RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草后，甘草次酸質(zhì)量比明顯提高，RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草產(chǎn)生的甘草次酸與RE4和RE11分別發(fā)酵甘草樣品相比，甘草次酸的質(zhì)量比提高約7.5倍，同生藥相比提高約30倍，說明甘草內(nèi)生真菌 RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草能顯著提高甘草次酸的產(chǎn)量；同時(shí)也說明，甘草內(nèi)生真菌RE4及RE11混合后再轉(zhuǎn)化甘草時(shí)，2株菌株之間也存在著相互的影響，甘草內(nèi)生真菌RE4及RE11混合轉(zhuǎn)化甘草顯著提高甘草次酸質(zhì)量比的機(jī)理還在進(jìn)一步研究中.

2.2轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出甘草粉(底物)投料質(zhì)量和培養(yǎng)基體積比(料液比)、內(nèi)生真菌RE4及RE11混合接種比例、搖床轉(zhuǎn)速及轉(zhuǎn)化時(shí)間為主要考察因素，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選轉(zhuǎn)化工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3.

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

組別A投料質(zhì)量與培養(yǎng)基的體積比/(g·mL-1)BRE4-RE11接種比例C搖床轉(zhuǎn)速/(r·min-1)D轉(zhuǎn)化時(shí)間/d甘草次酸質(zhì)量比/(mg·g-1)13∶101∶116043.742823∶102∶118053.561933∶101∶220063.081442∶51∶118063.882952∶52∶120043.163962∶51∶216053.568371∶21∶120053.731681∶22∶116063.528191∶21∶218043.8635K110.38611.35810.83910.770K210.61410.25411.30710.863ΣY=32.124K311.12410.5129.97810.491CT=114.66R0.2460.3680.4430.124

表3方差分析

方差來源離差平方和自由度均方F值顯著性A0.09520.04831.7*B0.22220.11174*C0.30420.152101.3**D0.02520.0138.3誤e0.003

注：F0.01(2, 2) = 99，F(xiàn)0.05( 2, 2) = 19.00，*表示差異顯著，**表示差異極顯著

由表2、3直觀分析及方差分析可知，影響內(nèi)生真菌RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草生產(chǎn)甘草次酸的因素順序?yàn)椋篊>B>A>D，即搖床轉(zhuǎn)速>內(nèi)生真菌RE4-RE11接種比例>投料質(zhì)量與培養(yǎng)基體積比>轉(zhuǎn)化時(shí)間；最終確定最佳轉(zhuǎn)化工藝為：A3B1C2D2，即投料質(zhì)量與培養(yǎng)基體積比1∶2，內(nèi)生真菌RE4-RE11接種比例1∶1，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5 d.

2.3轉(zhuǎn)化樣品中甘草次酸的提取分離結(jié)果

從RE4-RE11轉(zhuǎn)化甘草樣品中得到白色結(jié)晶406 mg，以甘草次酸對(duì)照品為對(duì)照，通過TLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該結(jié)晶在與甘草次酸相應(yīng)的位置顯同樣顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2；同時(shí)，以甘草次酸對(duì)照品為對(duì)照，對(duì)所得白色結(jié)晶進(jìn)行HPLC/MS 分析，結(jié)果見圖3，由圖3可知，樣品經(jīng)HPLC/MS分離并進(jìn)行負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜掃描后，得到m/z為469.6的準(zhǔn)分子離子峰，且該峰與甘草次酸(M=470.7)失去一個(gè)氫(M-1=469.7)基本一致，并與甘草次酸對(duì)照品HPLC/MS完全一致，從而確定該單體物質(zhì)即為目標(biāo)產(chǎn)物甘草次酸.

圖2 TLC 檢測(cè)結(jié)果a：甘草次酸對(duì)照品，b：結(jié)晶物質(zhì)

圖3 HPLC/MS檢測(cè)結(jié)果

甘草經(jīng)內(nèi)生真菌RE4及RE11轉(zhuǎn)化后，樣品中甘草次酸得率為2.03 mg/g；同法處理甘草生藥200 g，得到甘草次酸13.5 mg，與甘草生藥相比，甘草內(nèi)生真菌RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草后甘草次酸的產(chǎn)量提高約30倍.

3 結(jié) 語

以甘草內(nèi)生真菌RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草后，與甘草生藥相比，甘草經(jīng)轉(zhuǎn)化后甘草次酸產(chǎn)量顯著提高，說明采用微生物轉(zhuǎn)化法提高甘草次酸質(zhì)量比是可行的；同時(shí)甘草經(jīng)菌株轉(zhuǎn)化前后也存在各種活性成分質(zhì)量比的增減變化，采用微生物轉(zhuǎn)化法提高食品、藥品中活性成分質(zhì)量比是目前研究的熱點(diǎn)之一，本文研究結(jié)果也再次說明微生物轉(zhuǎn)化法的使用對(duì)新型保健食品、新藥的研發(fā)起到推動(dòng)作用.甘草內(nèi)生真菌RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草提高甘草次酸質(zhì)量比的機(jī)理正在進(jìn)一步研究.

對(duì)甘草內(nèi)生真菌RE4-RE11混合轉(zhuǎn)化甘草樣品，采用超聲提取后進(jìn)行D101大孔樹脂分離，再經(jīng)過一次硅膠柱層析，得到單體物質(zhì)，通過TLC 檢測(cè)和HPLC/MS 檢測(cè)，確定該單體物質(zhì)即為目標(biāo)產(chǎn)物甘草次酸，與甘草生藥相比，甘草次酸的得率提高約30倍.該提取分離路線切實(shí)可行，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，為甘草次酸原料的生產(chǎn)提供新方法.

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Improvementofglycyrrhetinicacidyieldinglycyrrhizauralensisbymicrobialtransformation

WANG Yu-qing, SUN Ya-bei, JIAO Jia-chen-qi, ZHENG Chun-ying

(Key Laboratory of Microbiology, School of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

A microbial transformation process was intended to be developed for improving the content of glycyrrhetinic acid from glycyrrhiza uralensis in order to provide a new method for the industrial production of glycyrrhetinic acid. Strains RE4 and RE11were selected to convert glycyrrhiza uralensis and the contents of glycyrrhetinic acid were improved specifically, After optimization of the process，the content of glycyrrhetinic acid in glycyrrhiza uralensis was increased to from 0.1283 mg/g in the untreated one to 3.892 9 mg/g，that was the 30.34 times higher than non-conversed samples. Meanwhile, glycyrrhetinic acid was extracted by ultrasonic extraction, and then it was isolated by the macroporous resin and silica gel colomn chromatography. It indicated that microbial transformation of glycyrrhiza uralensis was efficient, less the energy consumption and reduce the production cost and no noise pollution and so on.

glycyrrhiza uralensis; microbial transformation; glycyrrhetinic acid; extraction

2017-03-28.

哈爾濱市科技局優(yōu)秀學(xué)科帶頭人項(xiàng)目(2014RFXXJ094)；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H2015003)

王宇晴(1995-)，女，碩士，研究方向：微生物制藥研究.

鄭春英(1968-)，女，博士，教授，研究方向：微生物制藥研究.

R931

A

1672-0946(2017)05-0537-04