辛國松，李 鑫，薛沁冰，魏 馳，朱洪劍，厲增毅，趙 賀，季宇彬

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱 150076；2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

朱頂紅中黃烷類化學成分的研究

辛國松1,2，李 鑫1,2，薛沁冰1,2，魏 馳1，朱洪劍1，厲增毅1，趙 賀1，季宇彬1,2

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱 150076；2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

對朱頂紅進行成分的粗提取，經分離純化獲得單體化合物，進行Hepg-2細胞的活性試驗.用回流法對朱頂紅中有效成分進行粗提，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通過HPLC法獲得二氯甲烷部分的單體化合物.最終制得化合物1為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)；化合物2為7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).朱頂紅中的化學成分對腫瘤細胞Hepg-2細胞具有抑制作用.

分離純化；HPLC；抑制作用；單體化合物；腫瘤細胞

朱頂紅(Hippeastrum vittatum)是單子葉亞綱石蒜科(Amaryllidaceae)植物，為朱頂紅屬所有種類總稱，原產于墨西哥加勒比海以及阿根廷的北部[1].朱頂紅花形優(yōu)美、色澤艷麗.朱頂紅除了具有觀賞價值外也兼具有藥用價值[2].通過查閱文獻了解到，朱頂紅中各成分含量豐富并具有多種藥理活性，具有抗菌，抗氧化，抗腫瘤，促透等功效[3].本課題通過粗提朱頂紅中各化學成分后萃取粗分.通過查閱文獻了解到朱頂紅二氯甲烷提取部分活性較好[4-5].繼續(xù)對二氯甲烷提取部分分離純化得到單體化合物[6-7].

1 實驗儀器與藥品

旋轉蒸發(fā)儀(EYELA N-1100，東京理化器械株式會社)、型電子分析天平(BS110S，北京塞多利斯天平有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、倒置顯微鏡(CKX-41-32，日本OLYMPUS公司)；無水乙醇(分析純，批號：20121008)二氯甲烷(分析純，批號：20140516)甲醇(分析純，批號：20140708)石油醚(分析純，批號：20130423)乙酸乙酯(分析純，批號：20131014)正丁醇(分析純，批號：20130301).

2 實驗方法

2.1朱頂紅的粗提

取朱頂紅干燥葉片用70%乙醇以固液比1∶12回流提取，旋蒸除去試劑得總浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次得粗提產物[8].

2.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結構鑒定

2.2.1 二氯甲烷部分的粗分

硅膠柱分離取二氯甲烷部位浸膏作為拌樣硅膠置于合適研缽中，將樣品溶于二氯甲烷中，將拌有樣品的硅膠放入通風廚中直至拌樣硅膠呈細沙狀，在拌樣硅膠柱面上加一層脫脂棉，再向其加入流動相梯度洗脫.將梯度洗脫的餾分以半個保留體積570 mL為一餾分收集，薄層層析隨時跟蹤檢測.再將安瓿瓶中的樣品分別用少量二氯甲烷、甲醇溶解后薄層層析檢測，將Rf值等同的流分收集在一個安瓿瓶中.

2.2.2 HPLC法對樣品進行純度分析

分析型色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長210 nm；流速：0.8 mL/min；流動相：甲醇-水(梯度洗脫)，進樣量：20 μL；進樣方式為自動進樣.合并ODS色譜柱洗脫部分，經TLC薄層色譜分析，將已純化的樣品進行純度分析.將樣品用甲醇溶解，采用0.45 μm的為空濾膜過濾到自動進樣瓶中，以甲醇-水為流動相梯度洗脫，進行高效液相色譜分析并通過光譜學分析和文獻對照對結構進行鑒定.

2.2.3 HPLC法對樣品進行單體制備

制備型色譜柱：Eclipse XDB-C18(10 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長210 nm；流速：2.0 mL/min；流動相：甲醇-水(比例選用分析色譜儀分析的峰型較好的達到基線分離的比例)；進樣量100 μL；手動進樣，手動收集.

2.2.4 純度測定和結構分析

按制備液相的色譜條件，分別將上述得到的化合物溶液注入分析型HPLC中檢測.最后對單體化合物結構進行分析.

3 實驗結果

3.1朱頂紅的粗提

濃縮回收試劑得石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部分17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.

3.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結構鑒定

3.2.1 二氯甲烷部分的粗分

硅膠柱分離硅膠吸附色譜法中采用二氯甲烷-甲醇洗脫體系，比例依次為200∶0、200∶1、100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，最后選用0∶100進行沖柱，總共收集到324個餾分，經TLC檢測相同Rf值得合瓶后得到14個餾分.

3.2.2 HPLC法對樣品進行純度分析

對已純化的樣品進行純度分析，根據樣品中各組分的峰面積及分離程度，分析的到三個分離較好的樣品.色譜條件為起始流動相甲醇∶水(40∶60)至35 min甲醇∶水(20∶80)至40min甲醇水(40∶60)梯度洗脫，運行時間45 min.三個樣品的分析結果如圖1～3所示.

圖1 樣品1分析液相圖

圖2 樣品2分析液相圖

圖3 樣品3分析液相圖

3.2.3 HPLC法對樣品進行單體制備

從樣品1中分離出3個化合物，化合物A(25.6 mg)、化合物B(12.3 mg)、化合物C(4.9 mg)，從樣品2中分離出4個化合物，化合物D(6.6 mg)、化合物E(4.5 mg)、化合物F(8.6 mg)、化合物G(10.9 mg)，從樣品3中分離出1個化合物，化合物H(12.7 mg).制備液相色譜圖如圖4～6所示.

圖4 樣品1制備液相色譜圖

圖5 樣品2制備液相色譜圖

圖6 樣品3制備液相色譜圖

3.2.4 純度測定和結構分析

按制備液相的色譜條件，分別將上述得到的8個化合物溶液注入分析型HPLC中檢測，其中有3個組分為單一色譜峰圖.其他組分為單一峰但是峰型不好或有雜峰，顯然不是單體化合物，且樣品純度不足80%.色譜圖如圖7、8、9所示.

圖7 化合物Ⅰ的分析液相圖

圖8 化合物Ⅱ的分析液相圖

圖9 化合物Ⅲ的分析液相圖

3.2.5 分離純化結果

利用光譜學分析對化合物的結構進行解析，化合物1：黃色棒狀結晶(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中，δH6.89(d，J = 8.2 Hz,1H)，6.83(m，2H)，6.77 (d，J=8.1 Hz，1H)，6.27 (dd，J=8.1，1.7 Hz，1H)，6.19 (s，1H)推測為苯環(huán)上的氫信號；δH4.88(d，J=9.2 Hz，1H)推測為羥基上的氫；δH3.75 (s，3H)推測為甲氧基上面的氫；δH3.38 (s，3H)推測為甲氧基上面的氫；δH2.78 (m，1H)，2.57 (m，1H)，2.37 (s，1H)，2.03 (d，J=13.3 Hz，1H)推測為飽和碳上的氫.13C NMR (151 MHz，DMSO)譜中，δC156.84推測為二氫苯并哌喃與甲氧基相連的碳；δC155.75推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)與氧相連的碳；δC147.52推測為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳；δC146.76推測為苯環(huán)上與羥基相連的碳；δC134.71推測為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳；130.22推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC117.25推測為苯環(huán)上的碳；δC113.81推測為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳；δC112.59，112.41推測為苯環(huán)上的碳；δC108.33，103.12推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC76.97推測為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳；δC56.05，56.05推測為甲氧基上的碳；δC29.80推測為二氫苯并哌喃上的碳；δC24.07推測二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)，分子式為C17H18O4，分子質量為286.12，結構式見圖10，1H-NMR見圖11，13C-NMR見圖12.

圖10 化合物1結構圖

圖11 化合物1的碳譜圖

圖12 化合物1的氫譜圖

化合物2：透明油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR 中，δH6.98 (s，1H)，6.92(t，J=8.7 Hz，2H)，6.81(d，J=8.4 Hz，1H)，6.26(dd，J=8.2，2.1 Hz，1H)，6.18(d，J=2.1 Hz，1H)推測為苯環(huán)上氫；δH4.93(dd，J=9.9,，1.3 Hz，1H)推測羥基氫.δH3.74(d，J=4.7 Hz，3H)推測甲氧基氫.δH2.88(m，1H)，2.79(m，1H)，2.05(m，1H)，1.91(m，1H)推測為飽和碳上氫.13C NMR(151 MHz, DMSO)譜中，δC157.68推測為二氫苯并哌喃與氧相連的碳；δC155.76推測為二氫苯并哌喃上與羥基相連的碳；δC148.68推測為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳；δC149.03推測為苯環(huán)上與羥基相連的碳；δC134.63推測為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳；δC130.11推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC118.69推測為苯環(huán)上上的碳；δC111.99推測為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳；δC111.89，110.39推測為苯環(huán)上的碳；δC108.69推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC103.30推測為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC77.16推測為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳；δC55.92，55.85推測為甲氧基上的碳；δC29.90推測為二氫苯并哌喃上的碳；δC24.262推測為二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為7,4'-二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan)，分子式為C16H16O4，分子質量為272.10，結構式見圖13，1H-NMR見圖14，13C-NMR見圖15.

圖13 化合物2結構圖

圖14 化合物2的碳譜圖

圖15 化合物2的氫譜圖

化合物3：綠色油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中含有氫信號δH7.43(t，J=7.9 Hz，1H)，7.27(m，2H)，7.16(d，J=8.3 Hz，1H)，3.33(s，5H)，2.50(dt，J=3.3，1.7 Hz，1H)，1.62(s，3H)，1.23(s，1H)，0.85(t，J=6.9 Hz，1H).13C NMR(151 MHz，DMSO)譜中，δC150.24，150.19，148.14，148.09，147.97，130.63，128.64，126.32，120.30，120.27，119.85，119.83推測表明至少含有有兩個苯環(huán).其中δC120.30，120.27推測表明含有苯環(huán)的對位取代的羥基，δC128.64推測表明連有雙鍵或甲基.通過以上數據推測化合物結構中至少有兩個對羥基取代的苯環(huán)，一個連在雙鍵或芳環(huán)上的甲基，有可能是二聚體，可能為黃酮類化合物.1H-NMR見圖16，13C-NMR見圖17.

圖16 化合物3 的碳譜圖

圖17 化合物3的氫譜圖

以上數據結合相關文獻[9]確定了其中的2個化合物的結構[10]，分別為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)，7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).

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StudyonflavanechemicalcompositionofHippeastrumVittatum

XIN Guo-song1,2, LI Xin1,2, XUE Qin-bing1,2, WEI Chi1, ZHU Hong-jian1, LI Zeng-yi1, ZHAO He1, JI Yu-bin1,2

(1. Life Science and Environmental Science Research Center,Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. National Ministry of Education Anti-tumor Natural Drug Engineering Research Center, Harbin 150076, China)

Preextraction of Hippeastrum Vittatum was performed to obtained monomeric compounds by separation and purification, and then the activity test for Hepg-2 cells was conducted. The reflux method was used to coarse extract active ingredient in Hippeastrum Vittatum. The extraction solvents are petroleum ether, methylene dichloride, ethyl acetate and n-butanol. HPLC method was applied to obtaine parts of monomeric compounds of dichloromethane. We obtained the No.1 compound 4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan and the No.2 compound 7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan finally. The chemical components in Hippeastrum Vittatum had inhibiting effects for cancer cells of Hepg-2.

separation and purification; HPLC; inhibiting effects; monomericcompounds; cancer cells

2016-10-10.

哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目(2016RQQXJ124,2016RAXXJ064)；黑龍江省教育廳高校創(chuàng)新人才項目(UNPYSCT-2016181)

辛國松(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥理學.

R284

A

1672-0946(2017)05-0513-06