李春穎，李曉燕

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 能源建筑與工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

一種基于多底物混合共代謝定向產(chǎn)酸發(fā)酵研究

李春穎，李曉燕

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 能源建筑與工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

以牛糞、水稻秸稈、糖蜜廢水的三種底物混合共代謝發(fā)酵作為CSTR的產(chǎn)酸相，聯(lián)合IC產(chǎn)甲烷相進(jìn)行兩相厭氧發(fā)酵，其中研究的重點(diǎn)是提高產(chǎn)酸相的產(chǎn)酸量.通過pH值、ORP值、VFAs、TOC、TN、可溶性COD質(zhì)量濃度的測(cè)定以及紅外光譜(FTIR)觀察水稻秸稈的降解情況.通過PCR-DGGE來觀察產(chǎn)酸相優(yōu)勢(shì)種群的變化，來調(diào)節(jié)最適共代謝發(fā)酵底物，以進(jìn)入產(chǎn)甲烷相來提高產(chǎn)甲烷量.結(jié)果表明，厭氧CSTR反應(yīng)器發(fā)酵前30 d，反應(yīng)器內(nèi)pH值、ORP值均呈下降趨勢(shì)，此后，反應(yīng)器內(nèi)pH值比較穩(wěn)定，在6.2～6.5之間上下浮動(dòng)，ORP值在-250～-400 mV之間浮動(dòng).反應(yīng)器運(yùn)行30 d，TOC、TN含量大量增加，可溶COD質(zhì)量濃度上升.反應(yīng)60 d時(shí)，仍能滿足C/N比為27∶1，此時(shí)TOC、TN、可溶COD質(zhì)量濃度含量趨于穩(wěn)定，進(jìn)入共代謝產(chǎn)酸發(fā)酵的穩(wěn)定期.乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的含量均隨著時(shí)間的變化先增加后下降.隨著反應(yīng)進(jìn)行60 d，丙酸迅速下降，沒有出現(xiàn)酸積累現(xiàn)象，反應(yīng)器內(nèi)以乙酸為主.通過FTIR觀察，發(fā)現(xiàn)水稻秸稈得到有效的降解.本文利用PCR-DGGE技術(shù)解析產(chǎn)酸相，以Clostridium bifermentans、Firmicutes bacterium、Pseudomonas aeruginosa為優(yōu)勢(shì)菌群.

多底物；共代謝；混合發(fā)酵；PCR-DGGE

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，目前世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大，每年大約有40多億t，其中畜禽糞便排放量26.1億t，農(nóng)作物秸稈7.0億t[1].雖然我國(guó)擁有大量的農(nóng)業(yè)廢棄物，但卻沒有被充分利用，大部分的秸稈都選擇了直接焚燒處理，畜禽糞便處理直接采用自然堆漚或者作為肥料和飼料使用.然而焚燒秸稈釋放了大量的氣體并且嚴(yán)重污染環(huán)境，造成的資源的嚴(yán)重浪費(fèi).畜禽糞便直接作為肥料使用，會(huì)使寄生蟲、病菌等微生物大量傳播，這就會(huì)導(dǎo)致大量流行病的傳播，給人類帶來危害.糖蜜，作為糖類生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，常用作工藝發(fā)酵生產(chǎn)的原材料，如用于乙醇和酵母生產(chǎn).然而，1 L乙醇的生產(chǎn)需要消耗13～15 L的糖蜜，因此產(chǎn)生了大量的糖蜜廢水[2].目前在國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究中，牛糞作為最主要的混合發(fā)酵底物，將牛糞與秸稈、生活垃圾、餐廚垃圾和各種廢水混合共代謝發(fā)酵已成為厭氧發(fā)酵的新趨勢(shì).這項(xiàng)新技術(shù)不僅可能降低污染率而且還將農(nóng)業(yè)廢棄物合理資源化利用.劉心雨[3]等利用發(fā)酵TS質(zhì)量濃度20%條件下，50%玉米秸稈和50%牛糞配比與純牛糞兩種原料進(jìn)行沼氣發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)表明，混合發(fā)酵原料產(chǎn)沼氣量明顯高于純牛糞，并且恒溫35 ℃發(fā)酵的產(chǎn)氣量明顯高于常溫發(fā)酵.Kanokwan Boe等[4]將糖蜜廢水與牛糞進(jìn)行混合共代謝發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)牛糞與5%糖蜜廢水配比進(jìn)行混合時(shí)，最大產(chǎn)甲烷量為300 mLCH4/gVS.但當(dāng)牛糞與高于15%糖蜜進(jìn)行混合時(shí)，產(chǎn)氣會(huì)受到抑制.

本文選取牛糞、水稻秸稈、糖蜜廢水三種廉價(jià)廢棄物作為共代謝發(fā)酵底物，采用兩相工藝(CSTR-IC)，重要研究CSTR反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行厭氧水解酸化發(fā)酵，考察發(fā)酵過程中pH值、ORP、揮發(fā)性脂肪酸等指標(biāo)，并分析研究產(chǎn)酸相中秸稈降解情況，為產(chǎn)酸相共代謝發(fā)酵液作為發(fā)酵底物進(jìn)入IC產(chǎn)甲烷相提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所用發(fā)酵底物水稻秸稈于2016年9月取自黑龍江省阿城縣，試樣采集后攤放于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自然風(fēng)干，風(fēng)干后的水稻秸稈用粉碎機(jī)粉碎為粉末；牛糞取自黑龍江省肇東市養(yǎng)殖場(chǎng)；糖蜜廢水取自黑龍江省肇源市食品公司利用甜菜糖蜜發(fā)酵進(jìn)行酵母生產(chǎn)時(shí)產(chǎn)生的酵母糖蜜廢水.

1.2底物參數(shù)

產(chǎn)酸發(fā)酵共代謝底物的基本特性見表1.產(chǎn)氣量實(shí)驗(yàn)條件為發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時(shí)間為糞便60 d，秸稈90 d.

表1用于產(chǎn)酸發(fā)酵的共代謝底物的基本特性

底物含水量/%總固體/%揮發(fā)性固體/%C/N粗蛋白/%粗纖維/%粗脂肪/%產(chǎn)氣量/(m3·kg-1)干稻草秸稈17838467∶12314.78.20.4牛糞83177425∶112.736.72.50.3糖蜜廢水4555—7∶1200.20.4—

1.3試驗(yàn)方法和裝置

本試驗(yàn)在中溫35 ℃下采用CSTR-IC兩相厭氧發(fā)酵工藝，左側(cè)CSTR反應(yīng)器總體積為10 L，IC反應(yīng)器總體積為3.4 L，高徑比為5∶1，裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示，本文研究的重點(diǎn)是產(chǎn)酸相.

在CSTR產(chǎn)酸相反應(yīng)器中接入牛糞、水稻秸稈、糖蜜廢水三種發(fā)酵底物，其中加入牛糞3 700 g，水稻秸稈126 g，糖蜜廢水150 mL，加入水混合共8 L，滿足8%的料液質(zhì)量濃度，C∶N=27∶1.穩(wěn)定運(yùn)行4個(gè)月.IC反應(yīng)器中接入取自黑龍江省肇東市中溫批次混合發(fā)酵沼氣池內(nèi)的沼液，富含大量產(chǎn)甲烷菌.本實(shí)驗(yàn)旨在調(diào)控CSTR產(chǎn)酸相中各項(xiàng)工藝參數(shù)，使底物利于IC相高效產(chǎn)甲烷.

圖1 CSTR-IC兩相厭氧發(fā)酵系統(tǒng)1—蠕動(dòng)泵；2—集氣罐；3—攪拌器；4—pH計(jì)；5—預(yù)處理池；6—進(jìn)料泵；7～9—取樣口；10—出氣口；11—二級(jí)三相分離器；12—一級(jí)三相分離器；13～19—取樣口

1.4指標(biāo)測(cè)試和分析

CSTR產(chǎn)酸相反應(yīng)器運(yùn)行后，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)pH值、ORP值、揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、可溶COD值、總有機(jī)碳(TOC)、總氮(TN)等指標(biāo)并定期取樣.同時(shí)，采用紅外技術(shù)(FTIR)觀察不同時(shí)期秸稈的降解程度；運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)產(chǎn)酸相不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)種群進(jìn)行分子鑒定.通過測(cè)定這些指標(biāo)判斷產(chǎn)酸相末端代謝產(chǎn)物，并通過調(diào)節(jié)HRT、OLR等工藝運(yùn)行參數(shù)，對(duì)產(chǎn)酸相進(jìn)行生理生態(tài)因子調(diào)控，使底物利于定向高效產(chǎn)甲烷轉(zhuǎn)化.

pH值、ORP值使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可溶COD值使用快速COD測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、總有機(jī)碳(TOC)、總氮(TN)采用下述方法測(cè)定.

1)揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)的測(cè)定

取一定體積發(fā)酵液樣品，于12 000 rad/s條件下離心10 min，取液體樣品1 mL，加入內(nèi)標(biāo)物乙酸丁酯，用帶自動(dòng)進(jìn)樣器的Agilent 7890GC-FID氣相色譜儀測(cè)定揮發(fā)酸的含量及成分.

操作條件：前進(jìn)樣器尺寸10 μL，進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣壓力3.7683 psi；色譜柱：Agilent INWax: 250 ℃，30 m ×530 μm ×1 μm； 程序升溫70 ℃ 保持0.646 67 min，然后以25 ℃/min升至170 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃，H2流速45 mL/min，空氣流速 450 mL/min，載氣為N2，流速40 mL/min.

2)總有機(jī)碳(TOC)、總氮(TN)的測(cè)定

取一定體積發(fā)酵液樣品稀釋250倍，于12 000 rad/s條件下離心10 min，采用日本島津總有機(jī)碳/總氮分析儀TOC-VCPN進(jìn)行分析.

3)傅里葉紅外(FTIR)觀察水稻秸稈組分變化

取各時(shí)期厭氧干發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)水稻秸稈固形物，研磨后放入瑪瑙研缽中，加入KBr晶體，混勻磨細(xì)，取少許混合樣品壓片后在FTIR 光譜儀上進(jìn)行測(cè)定.

4)PCR-DGGE觀察產(chǎn)酸相不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)種群的變化

取不同預(yù)處理時(shí)期的溶液離心，取沉淀物提取細(xì)菌總基因組DNA，運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，再通過變性梯度濃膠電泳(DGGE)對(duì)各優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行區(qū)分，通過序列分析與繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)共代謝混合發(fā)酵后產(chǎn)酸相菌群特性進(jìn)行比對(duì)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 CSTR產(chǎn)酸相反應(yīng)器內(nèi)pH、ORP值的變化

厭氧CSTR反應(yīng)器內(nèi)pH值、ORP值的變化將會(huì)直接厭氧反應(yīng)器內(nèi)微生物種群變化及反應(yīng)器的運(yùn)行效能.本實(shí)驗(yàn)中對(duì)反應(yīng)器不同時(shí)期CSTR產(chǎn)酸相中pH、ORP值進(jìn)行測(cè)定. 如圖2所示，在厭氧發(fā)酵前30 d，反應(yīng)器內(nèi)pH、ORP值均呈下降趨勢(shì).這是因?yàn)榻?jīng)過一段時(shí)間的水解酸化，在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的作用下，發(fā)酵原料中部分高分子化合物被分解為低分子化合物，反應(yīng)產(chǎn)生了一些有機(jī)酸及揮發(fā)性脂肪酸所致.

圖2 不同時(shí)期CSTR產(chǎn)酸相pH、ORP值變化

在經(jīng)過大約30d的厭氧發(fā)酵后，產(chǎn)酸相反應(yīng)器內(nèi)pH比較穩(wěn)定，在6.2～6.5之間上下浮動(dòng)，ORP值在-250～-400 mV之間浮動(dòng).一般認(rèn)為，產(chǎn)酸細(xì)菌最適pH值為6.0～7.0，兩相厭氧消化系統(tǒng)則將產(chǎn)酸相的ORP值控制在-100～-300 mV 之間[5]，而產(chǎn)甲烷菌的最適氧化還原電位為-150～-400 mV[6]，因此，可見反應(yīng)器內(nèi)為產(chǎn)酸菌提供了合適的生存條件.

2.2 CSTR產(chǎn)酸相反應(yīng)器內(nèi)TOC、TN質(zhì)量濃度及可溶COD質(zhì)量濃度的變化

當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行30 d，TOC、TN大量增加，可溶COD質(zhì)量濃度上升.這說明運(yùn)行初期，水稻秸稈中纖維素類物質(zhì)已經(jīng)開始逐步降解，產(chǎn)酸菌并未得到充分的生長(zhǎng)繁殖，此時(shí)牛糞、糖蜜廢水中大量的有機(jī)質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)類物質(zhì)降解，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，故反應(yīng)器內(nèi)碳源、氮源增多.到40 d左右，TOC、TN、可溶COD又急劇下降，這是因?yàn)檫m宜的環(huán)境條件使得產(chǎn)酸菌大量繁殖，碳源、氮源得到充分利用.到反應(yīng)的60 d，TOC、TN、可溶COD質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，由此可以推斷這一時(shí)期已進(jìn)入共代謝產(chǎn)酸發(fā)酵的穩(wěn)定期.見圖3.

圖3 不同時(shí)期CSTR產(chǎn)酸相TOC、TN質(zhì)量濃度及可溶COD質(zhì)量濃度變化

2.3 CSTR產(chǎn)酸相揮發(fā)酸(VFAs)質(zhì)量濃度的變化

如圖4所示，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙醇的量均隨著時(shí)間的變化先增加后下降.反應(yīng)器運(yùn)行初期，pH值、ORP值降低的階段是揮發(fā)酸升高的階段，前80 d，乙酸、丁酸、戊酸、乙醇均屬于增加階段.后期60 d，丙酸質(zhì)量濃度迅速下降，說明產(chǎn)酸相中沒有酸積累的現(xiàn)象.各類揮發(fā)酸質(zhì)量濃度變化規(guī)律可以看出，隨著混合發(fā)酵過程的進(jìn)行，CSTR產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)以乙酸為主.這為CSTR產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵液進(jìn)入IC產(chǎn)甲烷相提供了重要的參考依據(jù).

圖4 不同時(shí)期CSTR產(chǎn)酸相VFAs質(zhì)量濃度變化

2.4 CSTR產(chǎn)酸相水稻秸稈成分的變化

研究采用紅外光譜(FTIR)在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定水稻秸稈中組分的變化.如圖5所示，在共代謝發(fā)酵90 d后，3 399 cm-1附近的吸收峰明顯減弱，此處為分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)，表明秸稈中以氫鍵連接的纖維素得到降解.底物共代謝發(fā)酵120 d期間，2 920 cm-1和2 851.5 cm-1的吸收峰相對(duì)強(qiáng)度已經(jīng)明顯增強(qiáng).Stark N·M[7]等在利用FITR研究風(fēng)化木塑復(fù)合材料表面時(shí)指出2 920 cm-1的吸收峰為-CH2-官能團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng)，2 851.5 cm-1的吸收峰與-CH3的C-H相關(guān)，此時(shí)，2 920 cm-1和2 851.5 cm-1的吸收峰強(qiáng)度的增加表明共代謝發(fā)酵后木質(zhì)素并沒有得到降解，反而增加.Komilis D·P[8]等同樣在利用固體廢棄物厭氧分解對(duì)木質(zhì)素和糖類的影響中指出木質(zhì)素需要在分子氧存在的條件下才能分解，在厭氧條件下基本上不能達(dá)到分解的目的.897cm-1是纖維素的β-D-葡萄糖苷特征峰，共代謝發(fā)酵60 d后，該峰明顯減弱，表明發(fā)酵處理后纖維素含量減少.832 cm-1為-CO32-的變角振動(dòng)，共代謝發(fā)酵60 d后，該吸收峰相對(duì)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明經(jīng)過共代謝發(fā)酵后，生成了一些碳酸鹽類物質(zhì)，混合共代謝發(fā)酵促使了碳酸鹽類的生成.該階段乙酸、丁酸、戊酸明顯增加.

圖5 不同時(shí)期CSTR產(chǎn)酸相水稻秸稈成分的變化

共代謝混合發(fā)酵不僅可以在幾個(gè)月內(nèi)實(shí)現(xiàn)秸稈的快速降解，促使碳酸鹽的生成，為產(chǎn)甲烷相提供適宜的發(fā)酵底物.同時(shí)也能使水稻秸稈、牛糞和糖蜜廢水這三種廢棄物實(shí)現(xiàn)資源化利用.

2.5 PCR-DGGE觀察產(chǎn)酸相不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)種群的變化

通過對(duì)CSTR產(chǎn)酸相不同階段樣品進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)解析，以確定各階段的優(yōu)勢(shì)菌群.取發(fā)酵原始液樣品為1#，發(fā)酵8 d樣品為2#，發(fā)酵26 d樣品為3#.由圖6所示，產(chǎn)酸相樣品微生物種類比較豐富，1#、2#、3#泳道條帶無明顯差異，可見共代謝發(fā)酵底物為CSTR產(chǎn)酸發(fā)酵提供了適宜的環(huán)境，微生物能夠很好的生長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)菌群穩(wěn)定存在于系統(tǒng)中.

圖6 CSTR產(chǎn)酸相不同時(shí)期DGGE圖譜

對(duì)圖6中優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行擴(kuò)增，通過pMD-18載體與PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行克隆，通過藍(lán)白斑篩選挑取10白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定，隨機(jī)挑選1～3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序[9].將測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性最高的序列運(yùn)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，CSTR產(chǎn)酸相不同階段DGGE圖譜系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖7所示.

如圖6所示，CSTR產(chǎn)酸相中出現(xiàn)了豐富的微生物群落，DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶所指示的菌屬有假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、鹽水球菌屬(Salinicoccus sp.)、雙酶梭狀芽孢桿菌(Clostridium bifermentans)、厚壁菌門(Firmicutes bacterium)以及一些未知菌屬關(guān)系的非培養(yǎng)樣品序列.其中條帶6、12、13、14較強(qiáng)，變化穩(wěn)定，為CSTR產(chǎn)酸相主要優(yōu)勢(shì)菌群.條帶6為非培養(yǎng)的不動(dòng)桿菌屬，條帶12為雙酶梭狀芽孢桿菌，條帶13為非培養(yǎng)厚壁菌門，條帶14為假單胞菌屬.另外，通過BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CSTR產(chǎn)酸相中沒有發(fā)現(xiàn)與梭菌屬具有較高相似性的條帶，這與VFA測(cè)定中沒有丙酸積累相對(duì)應(yīng).Katariina Tolvanen[10]等在研究牛糞與青草貯在CSTR共代謝厭氧發(fā)酵中同樣發(fā)現(xiàn)桿菌屬是反應(yīng)器內(nèi)主要優(yōu)勢(shì)種群.桿菌形成一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育高度多樣化的群體，作為厭氧反應(yīng)中聚合物水解發(fā)酵降解菌.而且，桿菌也是動(dòng)物腸道和糞便中常見菌群，是一種兼性厭氧菌.Hernon[11]指出在中溫條件下，運(yùn)用厭氧發(fā)酵反應(yīng)器降解富含碳水化合物的廢棄物時(shí)，發(fā)現(xiàn)桿菌是最主要的菌群.Shigematsu[12]在研究利用恒化器中降解長(zhǎng)鏈脂肪酸的微生物多樣性中發(fā)現(xiàn)桿菌是在降解長(zhǎng)鏈脂肪酸中最主要的優(yōu)勢(shì)菌群.Clostridium bifermentans是一種在排泄物、污泥及土壤中廣泛存在的物種.C·C·Wang[13]等在利用污泥作為污水厭氧發(fā)酵的接種物時(shí)分離到Clostridium bifermentans，并發(fā)現(xiàn)該菌株明顯提高了反應(yīng)的產(chǎn)氫量.厚壁菌門(Firmicutes)在厭氧反應(yīng)中的廣泛存在，反映了它們代謝如蛋白質(zhì)、脂類、糖類、氨基酸、木質(zhì)素、纖維素的能力[14].Leven[15]等研究表明厚壁菌門(Firmicutes)具有產(chǎn)生纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶和其他外連接酶的能力，這表明它們?cè)谒夂退峄^程中起了重要作用.Salinicoccussp.在厭氧發(fā)酵中顯見報(bào)道，并且在本混合共代謝發(fā)酵反應(yīng)器中，發(fā)現(xiàn)一些無法歸類種屬關(guān)系的非培養(yǎng)樣品.通過以上分析推測(cè)，在混合發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)微生物多樣性豐富，不僅存在富含降解碳水化合物的廢棄物菌群、降解長(zhǎng)鏈脂肪酸菌群以及代謝纖維素的菌群，而且存在一些無法歸類種屬關(guān)系的菌群，故推斷本混合共代謝CSTR產(chǎn)酸反應(yīng)器中存在特殊的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，微生物種類豐富.

圖7 CSTR產(chǎn)酸相不同階段DGGE圖譜系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié) 論

1)以水稻秸稈、牛糞、糖蜜廢水三種底物共代謝發(fā)酵的CSTR產(chǎn)酸相中，在反應(yīng)器初期30 d時(shí)，為反應(yīng)器產(chǎn)酸高峰期，大量VFAs的產(chǎn)生使得pH值迅速下降.pH值緩慢上升，穩(wěn)定在6.2～6.5之間.產(chǎn)酸相ORP值一直在-250～-400 mV之間浮動(dòng)，滿足產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)條件.

2)混合共代謝發(fā)酵具有很強(qiáng)的碳源氮源互相補(bǔ)充的能力，在反應(yīng)60 d時(shí)，仍能滿足C/N比為27∶1，有利于發(fā)酵的進(jìn)行.通過紅外光譜觀察，發(fā)現(xiàn)120 d內(nèi)，水稻秸稈中纖維素得到有效降解，并且促使了碳酸鹽的生成，為產(chǎn)甲烷相提供適宜的發(fā)酵底物.

3)混合共代謝CSTR產(chǎn)酸相中VFAs在反應(yīng)120 d內(nèi)各種類質(zhì)量濃度變化比較明顯，在前80 d，乙酸、丁酸、戊酸質(zhì)量濃度均屬于增加階段.后期60 d，丙酸含量迅速下降，沒有出現(xiàn)酸積累現(xiàn)象.反應(yīng)器內(nèi)主要以乙酸為主.

4)通過對(duì)CSTR產(chǎn)酸相不同階段樣品進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸相中存在豐富的微生物群落，DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶所指示的菌屬有假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)、鹽水球菌屬(Salinicoccussp.)、雙酶梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbifermentans)、厚壁菌門(Firmicutesbacterium)以及一些未知菌屬關(guān)系的非培養(yǎng)樣品序列.

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Researchondirectionalproductionacidfermentationbasedonmanysubstratesmixedmetabolic

LI Chun-ying, LI Xiao-yan

(School of Energy and Civil Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

In this paper, three substrates mixed fermentation included cow dung, rice straw and molasses wastewater were used as acidogenic-phase, combined with IC methane-producing phase to conduct two-phase anaerobic fermentation. The aim is to increase the amount of acidification production. The rice straw degradation situation was observed through pH, ORP value, the VFAs, TOC, TN, the determination of soluble COD concentration and infrared spectrum (FTIR). The changes of dominant population of acidification were observed by PCR and DGGE, which can adjust the optimal metabolic fermentation substrates. The results showed that pH, ORP would decrease before 30 d at anaerobic fermentation of CSTR reactor. The pH value was about 6.2～6.5, and the ORP value was between -250 mv and 250 mv. After 30 d, the content of TOC, TN and soluble COD concentration were increased. After 60 d, C/N ratio still was 27∶1. The TOC, TN, and soluble COD content tend to be stable. The content of acetic acid, propionic acid, butyric acid, pentanoic acid was first increased then fell. After 60 d, propionic acid felled rapidly, with no acid accumulation phenomenon, and the reactor was given priority to acetic acid. The rice straw got effective degradation by FTIR. Clostridium bifermentans, Firmicutes bacterium, Pseudomonas aeruginosa are advantage bacterium group.

substrate; total of metabolism; mixed fermentation; PCR-DGGE

2016-12-10.

黑龍江省自然科學(xué)基金(B201415；QC2015010)

李春穎(1980 -)，女，博士，講師，研究方向：給水及污水處理.

李曉燕(1962-)，女，博士，教授，研究方向：環(huán)境微生物以及制冷工程研究.

X703

A

1672-0946(2017)05-0581-07