吳 濤 ，許 杰 ，謝文軍 ，姚志剛 ，劉俊華 ，楊紅軍 ，孫春龍 ，王書平

耐鹽植物虎尾草內(nèi)生解烴細(xì)菌的篩選及其降解特性

吳 濤1，2，許 杰3，謝文軍1，2，姚志剛1，劉俊華2，楊紅軍2，孫春龍1，2，王書平1

（1.濱州學(xué)院生物工程學(xué)院，山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256600；2.濱州學(xué)院，山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600；3.濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603）

從耐鹽植物中分離具有石油烴降解功能內(nèi)生細(xì)菌并研究其降解特性，為內(nèi)生細(xì)菌協(xié)同宿主植物修復(fù)石油污染鹽漬化土壤提供基礎(chǔ)。以黃河三角洲長期受石油污染重鹽堿地生長的耐鹽植物虎尾草為材料，分離出能以柴油為唯一碳源生長的內(nèi)生細(xì)菌24株。通過柴油降解試驗(yàn)，篩選得到1株高效石油烴降解內(nèi)生細(xì)菌BF04。經(jīng)生理生化特性及16S rDNA同源序列分析，確定BF04為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。通過液體培養(yǎng)試驗(yàn)研究了BF04對不同烴的利用能力和對柴油的降解動力學(xué)特征。結(jié)果表明：BF04能夠利用直鏈烷烴、支鏈烷烴和單環(huán)芳烴，不能利用多環(huán)芳烴和苯酚。BF04能降解柴油中大部分烷烴，其中對短鏈烷烴（nC11～nC23）降解率高于長鏈烷烴（nC24～nC27）。BF04對柴油降解可以用一級反應(yīng)動力學(xué)模型表示。在含有3%NaCl的液體培養(yǎng)基中，BF04具有較強(qiáng)的降解柴油能力，在修復(fù)石油污染高鹽環(huán)境中具有一定的應(yīng)用潛力。

石油污染；鹽漬化土壤；內(nèi)生細(xì)菌；短小芽孢桿菌；耐鹽植物；解烴

土壤鹽漬化導(dǎo)致石油烴類污染物持久性增加，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)加大[1-2]。對石油污染鹽漬化土壤治理，是目前面臨的一項(xiàng)重要任務(wù)。植物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)境友好的污染土壤治理技術(shù)。研究證明，耐鹽植物能加快鹽漬化土壤中石油污染物降解，引入耐鹽植物是加快石油污染鹽漬化土壤修復(fù)進(jìn)程的重要途徑[3]。植物內(nèi)生細(xì)菌（Endophytic bacteria）是指生活在健康植物內(nèi)部組織和器官中，并未使植物的表型特征和功能發(fā)生改變的細(xì)菌[4]。植物內(nèi)生細(xì)菌能提高宿主對環(huán)境污染物的耐受性，促進(jìn)植物生長，并且能在植物組織中降解有機(jī)污染物，減少有毒污染物對食草動物的影響和向大氣中揮發(fā)[5-6]。此外，與根際微生物相比，內(nèi)生細(xì)菌生存競爭壓力小，具有穩(wěn)定的生境，在植物修復(fù)的實(shí)踐中更具有優(yōu)勢[7]。對于內(nèi)生細(xì)菌在耐鹽植物修復(fù)石油污染土壤方面的研究幾乎無人涉足?；⑽膊葑鳛橐环N耐鹽堿草本植物，能在含鹽量0.53%、pH 10.51的土壤環(huán)境中正常生長[8]，對石油污染物耐性強(qiáng)，在植物修復(fù)石油污染鹽漬化土壤中具有較大的應(yīng)用潛力[3]。本研究從黃河三角洲石油污染重鹽堿地土壤上生長的耐鹽植物虎尾草（Chloris virgata SW.）中篩選出1株高效解烴內(nèi)生細(xì)菌，通過形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列比對對其進(jìn)行鑒定，同時(shí)初步研究了該菌降解石油烴特性，以期為內(nèi)生細(xì)菌協(xié)同植物修復(fù)石油污染鹽漬化土壤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試植物虎尾草采自黃河三角洲石油污染重鹽堿地區(qū)（37°51′58.6″N，118°48′56.0″E）。采集的完整植株，放入冷藏式采樣樣品保存箱，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行菌株的分離篩選。

實(shí)驗(yàn)用柴油為0#，購自山東省濱州市濱城區(qū)中石化第三加油站。

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，溶于1000 mL蒸餾水，pH 7.4。

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MSM）：KH2PO41.5 g，Na2HPO41.5 g，MgSO40.2 g，（NH4）2SO41.0 g，微量元素混合液 1 mL，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.4。其中微量元素混合 液 ：CoCl2·6H2O 4.0 g，H3BO30.5 g，ZnCl22.0 g，NaMoO4·2H2O 2.0 g，CuCl2·2H2O 1.0 g，CaCl240.0 g，F(xiàn)eCl3·7H2O 40.0 g，MnCl2·4H2O 8.0 g，AlCl3·6H2O 1.0 g，溶于1000 mL蒸餾水。

無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中按15 g·L-1的量加入瓊脂。

Oil-Ms-agar固體培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上滴加柴油，使培養(yǎng)基表面形成薄層油膜。

1.3 植物內(nèi)生解烴菌的分離、篩選與降解能力

自來水沖洗整株植物30 min，再用蒸餾水沖洗3次，每次3 min。吸干植物表面水分，將植株分為根、莖、葉三部分，各部分用70%乙醇溶液浸泡2 min，無菌水洗3次，再放入1.2%次氯酸鈉溶液中振蕩30 min，無菌水沖洗3次，每次2 min。取最后一次沖洗無菌水100 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，檢驗(yàn)植株表面消毒是否完全。在表面消毒的植物組織中加入10倍體積的磷酸鹽緩沖液，研磨后靜置5 min，將懸液涂布于Oil-Ms-agar固體培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)4 d，挑取不同形態(tài)的單菌落，經(jīng)純化后保存于LB固體培養(yǎng)基斜面[9]。

制備細(xì)胞數(shù)約為1×108CFU·mL-1的菌懸液，按5%接種量接入以柴油為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基。其中，柴油通過0.22 μm有機(jī)濾膜除菌后按3 g·L-1的量加入，以不加菌加柴油培養(yǎng)基作為對照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。調(diào)pH值為7.4，于30℃搖床200 r·min-1培養(yǎng)7 d，柴油殘留量采用紅外測油儀（華夏科創(chuàng)，OIL480）測定。柴油降解率按照式（1）計(jì)算：

式中：D為培養(yǎng)基中柴油降解率，%；C0為未加菌降解后培養(yǎng)基中柴油濃度，g·L-1；Ci為加菌降解后培養(yǎng)基中柴油濃度，g·L-1。

1.4 菌株鑒定

菌株生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，16S rDNA克隆參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。正向引物：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rDNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司測定。將測定的序列在GenBank中用Blast軟件與已知序列進(jìn)行同源性分析，采用Mega 5.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列，以鄰接法（Neighbor-Joining Method）構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株利用不同烴類物質(zhì)的定性分析

取適量菲、萘和苯酚的氯仿溶液，通過0.22 μm有機(jī)濾膜除菌后加入滅菌三角瓶中，待氯仿?lián)]發(fā)完加入無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十六烷、甲苯、二甲苯通過0.22 μm有機(jī)濾膜除菌后直接加入無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，終濃度為500 mg·L-1。制備細(xì)胞數(shù)約為 1×108CFU·mL-1的菌懸液，按5%接種量分別接入以各種烴類為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基。以不加菌加烴培養(yǎng)基處理作為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。調(diào)pH值為7.4，于30℃恒溫?fù)u床200 r·min-1培養(yǎng)5 d，于600 nm處測定吸光度。通過600 nm處吸光度大小反映菌株在各烴類物質(zhì)為唯一碳源無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中的生長情況。

1.6 菌株對柴油中烷烴組分的降解實(shí)驗(yàn)

按照1.3方法進(jìn)行菌株柴油降解實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)液中石油烴組分利用正己烷萃取，無水硫酸鈉脫水，萃取液過硅酸鎂吸附柱，用GC-FID（Agilent，7890A）進(jìn)行分析。用正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)液（nC8～nC40，AccuStandard）進(jìn)行校正，利用外標(biāo)法建立線性5點(diǎn)校正曲線，計(jì)算正構(gòu)烷烴含量。烷烴降解率（R）按照式（2）計(jì)算：

式中：Ri為i碳數(shù)正構(gòu)烷烴的降解率，%；Pci為對照中i碳數(shù)正構(gòu)烷烴含量，mg·L-1；Pi為加菌降解后 i碳數(shù)正構(gòu)烷烴含量，mg·L-1。

色譜分析條件：色譜柱為Agilent HP-5 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；檢測器為 FID 氫火焰離子檢測器；載氣為氦氣（99.999%）；進(jìn)樣口溫度為290℃；檢測器溫度為300℃；升溫程序?yàn)?0℃保持2 min，以每分鐘6℃的速度升到300℃，并在300℃保持16 min，進(jìn)樣量為1 μL，以不分流方式進(jìn)樣，柱流量為1 mL·min-1。

1.7 菌株降解柴油動力學(xué)試驗(yàn)

按5%接種量接入以柴油為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（柴油含量為3 g·L-1）。其中，培養(yǎng)基中NaCl濃度分別設(shè)置為 1%、3%、5%，第 0、1、3、6、10、15 d 取樣，測定培養(yǎng)液中柴油殘留量。培養(yǎng)條件和測定柴油殘留量同1.3所述。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖，使用SPSS 19.0進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎尾草內(nèi)生解烴細(xì)菌的分離與篩選

從虎尾草根、莖和葉中分離得到以柴油為唯一碳源的內(nèi)生細(xì)菌24株，其中根中11株（編號BF01～BF11），莖中 8株（編號 BF12～BF19），葉中 5株（編號BF20～BF24）。菌株在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后的柴油降解率如圖1。由圖可知，各菌株對柴油的降解率在11.3%～69.6%之間，其中根、莖和葉中分離菌株平均降解率分別為38.1%、31.1%和40.7%。差異顯著性分析表明，根和葉中分離的菌株平均降解率顯著高于莖中各菌株平均降解率（P<0.05），根與葉中分離的菌株平均降解率差異不顯著（P>0.05）。BF03、BF04、BF06、BF10、BF20 和 BF22 6 株菌對柴油的降解率高于50%，其中BF04對柴油的降解率極顯著高于BF03、BF06、BF10、BF20 和 BF22（P<0.01），培養(yǎng) 7 d 降解率達(dá)到69.6%。因此，選擇菌株BF04作進(jìn)一步研究。

2.2 菌株鑒定

菌株BF04在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，乳白色，不透明，干燥，中心褶皺。鏡檢菌株為桿狀，大小（0.7～0.9）μm×（1.7～2.5）μm，有運(yùn)動性。產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色呈陽性。生理生化結(jié)果見表1。BF04與Bacillus pumilus的模式種在生理生化指標(biāo)上具有相同的特征。

菌株BF04的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序獲得片段長度為 1507 bp，GenBank登錄號為 MF073272。在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，菌株BF04與已報(bào)道的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）序列相似性為99%。根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列比對，推斷BF04為短小芽孢桿菌。應(yīng)用MEGA5.0軟件、采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其進(jìn)化地位，結(jié)果如圖2所示。

圖1 菌株在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中的柴油降解率Figure 1 Degradation of isolated strains for diesel-oil in the mineral salts（liquid）medium

表1 菌株BF04生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain BF04

2.3 菌株利用不同烴類物質(zhì)的定性分析

分別選取代表直鏈烷烴、支鏈烷烴、低分子量芳香烴、多環(huán)芳烴、環(huán)烷烴等不同石油烴組分物質(zhì)為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，定性考察菌株BF04對石油烴各組分的利用能力。菌株BF04對不同烴類物質(zhì)的利用情況見表2。由表可知，在底物濃度為500 mg·L-1的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，菌株BF04以正辛烷、正十六烷為唯一碳源生長最好，以正己烷、異辛烷為碳源生長較好，能以環(huán)己烷、甲苯、二甲苯為碳源生長，以苯酚、萘和菲為唯一碳源不能生長。表明菌株BF04對直鏈烷烴具有較強(qiáng)的代謝能力，其次是支鏈烷烴，能代謝環(huán)烷烴和單環(huán)芳烴，不能代謝底物濃度為500 mg·L-1的苯酚和多環(huán)芳烴菲、萘。

表2 菌株BF04對不同烴類物質(zhì)的利用Table 2 Growth substrate utilization profile of strain BF04 on selected hydrocarbons

2.4 菌株對柴油中烷烴組分降解的定量分析

為弄清BF04對不同碳數(shù)烷烴的降解情況，采用GC-FID對柴油降解后的烷烴組分進(jìn)行分析，其氣相色譜如圖3所示?？梢钥闯觯囵B(yǎng)7 d后，柴油中不同碳數(shù)正構(gòu)烷烴都有不同程度的降解。利用外標(biāo)法建立線性5點(diǎn)校正曲線，計(jì)算正構(gòu)烷烴降解率，結(jié)果見表3。由表可知，柴油中 nC12、nC13、nC14、nC15、nC16、nC17、nC19、nC20、nC21、nC22、nC23、nC24 和nC25 正構(gòu)烷烴降解率較高，都達(dá)到90%以上。nC11和nC27降解率相對較低，分別為63.9%、74.5%。短鏈烷烴nC11～nC23降解率達(dá)到93.2%，長鏈烷烴nC24～nC27降解率達(dá)到86.9%。差異顯著性分析表明，BF04對短鏈烷烴（nC11～nC23）降解率極顯著高于長鏈烷烴（nC24～nC27）（P<0.01）。

2.5 菌株對柴油降解的動力學(xué)特征

圖2 基于16S rDNA基因序列的菌株BF04系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic analysis based on the 16S rDNA gene sequences of strain BF04

圖3 降解7 d后培養(yǎng)液中殘留柴油的氣相色譜圖Figure 3 GC-FID chromatograms of diesel oil extracted from the aqueous phase of the medium after 7 days of incubation with 3 g·L-1 diesel with and without inoculation with strain BF04

表3 菌株BF04對柴油中正構(gòu)烷烴的降解Table 3 Degradation of diesel-oil n-alkanes by strain BF04 in the mineral salts（liquid）medium after 7 days at 30 ℃ and 200 r·min-1

菌株BF04在不同NaCl含量培養(yǎng)基中對柴油的降解情況如圖4所示?？梢钥闯?，培養(yǎng)15 d后，NaCl含量為5%的培養(yǎng)基中柴油的殘留量極顯著高于NaCl含量為1%和3%的培養(yǎng)基（P<0.01），NaCl含量為1%與3%的培養(yǎng)基中柴油的殘留量差異不顯著（P>0.05），表明3%NaCl濃度沒有抑制BF04對柴油的降解，5%NaCl濃度明顯抑制BF04對柴油的降解。不同NaCl含量對BF04降解柴油速率影響不同。在NaCl含量為1%的培養(yǎng)基中，柴油降解最快速率出現(xiàn)在培養(yǎng)1～3 d；在NaCl含量為3%的培養(yǎng)基中，柴油降解最快速率出現(xiàn)在培養(yǎng)3～6 d；在NaCl含量為5%的培養(yǎng)基中，柴油降解最快速率出現(xiàn)在培養(yǎng)6～10 d。表明隨著鹽度的增加，BF04對柴油最大降解速率逐漸拖后。

圖4 菌株BF04在不同NaCl含量培養(yǎng)基中對柴油的降解曲線Figure 4 Degradation curves of diesel oil by strain BF04 in different NaCl concentration cultures

為定量描述BF04降解柴油過程的速率，對柴油的生物降解反應(yīng)進(jìn)行簡化，建立數(shù)學(xué)模型。石油烴降解過程是一個(gè)酶催化反應(yīng)，其反應(yīng)速率可用米氏方程表示。根據(jù)底物濃度和米氏常數(shù)大小關(guān)系可以將反應(yīng)過程分為零級反應(yīng)和一級反應(yīng)，進(jìn)而推導(dǎo)底物濃度與時(shí)間的關(guān)系式[12]。一級反應(yīng)和零級反應(yīng)關(guān)系式為：

式中：c為底物濃度；k為降解速率常數(shù)。

圖5 菌株BF04降解柴油動力學(xué)擬合曲線Figure 5 Degradation kinetics curves of diesel oil by strain BF04

對圖4的數(shù)據(jù)分別按一級反應(yīng)和零級反應(yīng)方程擬合，結(jié)果表明，在不同NaCl含量培養(yǎng)基中BF04對柴油降解曲線符合一級反應(yīng)（圖5）。由圖5可知，在含1%、3%、5%NaCl的培養(yǎng)基中，BF04降解柴油的降解速率常數(shù)分別為0.104 2、0.101 8、0.028 4 d-1。以得到的動力學(xué)方程預(yù)測，如果培養(yǎng)液中柴油完全降解，BF04在含1%NaCl的培養(yǎng)基中需要76 d，在含3%NaCl的培養(yǎng)基中需要78 d，而在含5%NaCl的培養(yǎng)基中需要284 d。

3 討論

植物修復(fù)有機(jī)污染土壤效率主要取決于協(xié)同功能微生物的數(shù)量和活性，其中細(xì)菌是發(fā)揮最主要作用的微生物類群[13]。從植物中分離、篩選內(nèi)生解烴細(xì)菌并研究其特性，對于揭示植物修復(fù)石油污染環(huán)境過程中微生物所扮演的生態(tài)角色具有重要意義。本研究從黃河三角洲石油污染重鹽堿土上生長的虎尾草中分離得到能降解柴油的內(nèi)生細(xì)菌24株，其中根中最多，莖次之，葉中最少，這與Pawlik等[14]和Fatima等[15]從植物各部位分離降解石油烴內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量趨勢一致。一般認(rèn)為土壤微生物是植物內(nèi)生細(xì)菌的主要來源，在植物體中隨著與根尖等微生物進(jìn)入口距離的增加，內(nèi)生細(xì)菌的種群密度逐漸減少[16]。

不同植物其協(xié)同的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌種類不同。研究者從黑麥草、野黑麥和冰草中分離出可培養(yǎng)的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌分別為Pseudomonasfulgida，Pseudomonasfluorescens和Pseudomonas poae[17]，從夏櫟、大豆、花生、向日葵分離出可培養(yǎng)的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌主要為Actinobacteria sp.，Bacillus sp.和 Pantoea sp.[18-20]?；⑽膊葑鳛橐环N耐鹽堿、耐石油烴污染的草本植物，還未見其內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。目前發(fā)現(xiàn)能降解石油烴類污染物的細(xì)菌主要有 Pseudomonas sp.，Sphingomonas sp.，Acinetobacter sp.，Alcaligenessp.，Micrococcussp.，Bacillussp.，F(xiàn)lavobacteriumsp.，Arthrobactersp.，Alcanivoraxsp.，Mycobacteriumsp.，Rhodococcus sp.和 Actinobacter sp.[21]。菌株BF04通過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定為Bacillus pumilus。關(guān)于Bacillus pumilus降解石油烴已有很多報(bào)道[22-24]，這些能降解石油烴污染物的Bacillus pumilus主要分離自土壤和水環(huán)境，從植物體內(nèi)部分離得到降解石油烴的Bacillus pumilus較少。Fatima等[25]從多年生黑麥草（Lolium perenne）中分離出一株內(nèi)生細(xì)菌Bacillus pumilus LOSI68，該菌能利用原油和萘為唯一碳源正常生長，但不能利用正辛烷、正癸烷、正十二烷和正十六烷。Ho等[26]從蘆葦和水蕹菜中分離出內(nèi)生細(xì)菌Bacillus pumilus C3和Bacillus pumilus E10，菌C3和E10都能利用苯酚、甲苯、二甲苯、乙苯等為唯一碳源生長。BF04能利用正己烷、正辛烷、正十六烷、異辛烷、環(huán)己烷、甲苯、二甲苯為碳源生長，不能利用苯酚、菲和萘，這與菌LOSI68代謝石油烴種類不同，與菌C3和菌E10代謝石油烴種類部分相同。同類微生物代謝石油烴活性受宿主植物代謝特性、石油烴類污染物組成和土壤理化性質(zhì)影響[15]，BF04 與 LOSI68、C3、E10 生存環(huán)境不同，可能是導(dǎo)致這些同種降解菌代謝石油烴種類不同的原因。

柴油主要由中長鏈飽和烴（C10～C29）組成[27]，BF04能降解大部分這類烷烴，其中對nC12～nC17和nC19～nC25正構(gòu)烷烴降解率達(dá)到90%以上，對nC11和nC27降解率較低，分別為63.9%和74.5%。柴油中各組分的生物降解與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，鏈烷烴由于分子結(jié)構(gòu)較其他烴類組分簡單而更容易被微生物降解[28-29]。短鏈烷烴生物可利用性低以及可溶解細(xì)菌細(xì)胞膜而使其不能被完全降解，長鏈烷烴由于降解過程中產(chǎn)生的中間物質(zhì)的毒性也限制細(xì)菌對其完全降解[30]。BF04 對短鏈烷烴（nC11～nC23）降解率高于長鏈烷烴（nC24～nC27），這與 Nkem 等[31]從石油污染海灘中分離出的菌GS和WR1降解柴油各烷烴組分特性一致。一般柴油中簡單的烷烴組分首先被石油烴降解菌降解，這些烴類組分的降解促進(jìn)降解菌不斷生長繁殖，產(chǎn)生更多的水解酶，進(jìn)而促進(jìn)更復(fù)雜烷烴組分的降解，復(fù)雜烷烴在降解過程中產(chǎn)生有毒中間體使降解過程減慢，導(dǎo)致長鏈烷烴（nC24～nC27）降解率降低[31-32]。

高鹽、石油污染物是限制石油污染鹽漬化地區(qū)植物生長發(fā)育的主要因子，但這種生態(tài)條件同時(shí)會賦予植物及其內(nèi)生菌較強(qiáng)的抗逆性。通常隨著鹽度的增加微生物降解石油烴類物質(zhì)能力降低，當(dāng)鹽度>3%時(shí)，一般微生物的代謝會受到抑制，降解石油烴效率明顯降低[33]。3%NaCl濃度沒有抑制BF04降解柴油的降解活性，可能是其在長期高鹽、石油污染環(huán)境脅迫下，經(jīng)過雙重選擇，逐漸適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果。通常海洋環(huán)境鹽度含量為3%～3.5%[27]，BF04在含有3%NaCl液體培養(yǎng)基中具有較強(qiáng)的降解柴油能力，在修復(fù)石油污染海洋環(huán)境中具有一定的應(yīng)用潛力。鹽濃度影響菌株生長率，隨著濃度的增加，菌株生長曲線的適應(yīng)期變長，對數(shù)增長期滯后[34]，進(jìn)而影響菌株對柴油的降解速率，這可能是導(dǎo)致BF04隨著培養(yǎng)基中鹽度的增加，對柴油最大降解速率拖后的原因。微生物代謝石油烴是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過程，石油烴組成復(fù)雜，又難溶于水，生物降解過程的生化反應(yīng)體系具有多相、多組分及非線性的特點(diǎn)。在不同NaCl含量培養(yǎng)基中，BF04對柴油降解曲線符合一級反應(yīng)，這與吳濤[3]從石油污染鹽漬化土壤中分離出的耐鹽菌BM38以及張秀霞等[12]從石油污染土壤中分離出的HJ-1降解石油烴動力學(xué)特性一致。

4 結(jié)論

（1）本研究從黃河三角洲石油污染重鹽堿地生長的虎尾草中分離出24株內(nèi)生解烴細(xì)菌，經(jīng)液體培養(yǎng)柴油降解試驗(yàn)，確定了一株高效降解石油烴植物內(nèi)生細(xì)菌BF04。經(jīng)鑒定BF04為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

（2）菌株BF04能夠利用正辛烷、異辛烷、正十六烷、正己烷、環(huán)己烷等鏈烷烴和甲苯、二甲苯等單環(huán)芳烴，不能利用萘、菲等多環(huán)芳烴和苯酚。BF04能降解柴油中大部分烷烴，其中對nC12～nC17和nC19～nC25正構(gòu)烷烴降解率較高，對nC11和nC27正構(gòu)烷烴降解率相對較低。BF04對短鏈烷烴（nC11～nC23）降解率高于長鏈烷烴（nC24～nC27）。

（3）隨著培養(yǎng)基中鹽度的增加，BF04對柴油最大降解速率拖后。BF04對柴油降解可以用一級反應(yīng)動力學(xué)模型表示，在含鹽量為1%、3%和5%條件下對柴油降解動力學(xué)方程分別為：y=-0.104 2x+7.869 7，y=-0.101 8x+7.977 3和y=-0.028 4x+7.966 6。在含有3%NaCl液體培養(yǎng)基中BF04仍具有較強(qiáng)的降解柴油能力，在修復(fù)石油污染高鹽環(huán)境中具有一定的應(yīng)用潛力。

[1]Li H L,Boufadel M C.Long-term persistence of oil from the Exxon Valdez spill in two-layer beaches[J].Nature Geoscience,2010,3（2）：96-99.

[2]Qin X,Tang J C,Li D S,et al.Effect of salinity on the bioremediation of petroleum hydrocarbons in a saline-alkaline soil[J].Letters in Applied Microbiology,2012,55（3）：210-217.

[3]吳 濤.鹽漬化石油污染土壤的生物修復(fù)研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

WU Tao.Bioremediation of saline soil contaminated with petroleum[D].Shenyang：Shenyang Agricultural University,2013.

[4]Calheiros C S C,Pereira S I A,Brix H,et al.Assessment of culturable bacterial endophytic communities colonizing Canna flaccida inhabiting a wastewater treatment constructed wetland[J].Ecological Engineering,2017,98：418-426.

[5]Afzal M,Khan Q M,Sessitsch A.Endophytic bacteria：Prospects and applications for the phytoremediation of organic pollutants[J].Chemosphere,2014,117（1）：232-242.

[6]Gandolfi I,Canedoli C,Imperato V,et al.Diversity and hydrocarbondegrading potential of epiphytic microbial communities on Platanus x acerifolia leaves in an urban area[J].Environmental Pollution,2017,220（Part A）：650-658.

[7]Weyens N,Truyens S,Dupae J,et al.Potential of the TCE-degrading endophyte Pseudomonas putida W619-TCE to improve plant growth and reduce TCE phytotoxicity and evapotranspiration in poplar cuttings[J].Environmental Pollution,2010,158（9）：2915-2919.

[8]殷立娟,石德成,薛 萍.松嫩平原草原5種耐鹽牧草體內(nèi)K＋,Na＋的分布與積累的研究[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),1994,18（1）：34-40.

YIN Li-juan,SHI De-cheng,XUE Ping.The distribution and accumulation of K+and Na+in five salt-tolerant forage plants in a Song-Nei plain steppe[J].Acta Phytoecologica Sinica,1994,18（1）：34-40.

[9]Hallmann J,Quadt-Hallmann A,Mahaffee W,et al.Bacterial endo－phytes in agricultural crops[J].Canadian Journal of Microbiology,1997,43（10）：895-914.

[10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社,2001：67-105,128-191.

DONG Xiu-zhu,CAI Miao-ying.Manual of systematic and determinative bacteriology[M].Beijing：Science Press,2001：67-105,128-191.

[11]Sambrook J,Russell D W.Molecular cloning：A laboratory manual[M].3rd Edition.Beijing：Science Press,2002：597-627.

[12]張秀霞,單寶來,張劍杰,等.降解菌HJ-1降解石油動力學(xué)[J].中國石油大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2009,33（5）：140-143.

ZHANG Xiu-xia,SHAN Bao-lai,ZHANG Jian-jie,et al.Kinetics on strain HJ-1 degrading petroleum[J].Journal of China University of Petroleum（Edition of Natural Sciences）,2009,33（5）：140-143.

[13]Afzal M,Yousaf S,Reichenauer T G,et al.Soil type affects plant colonization,activity and catabolic gene expression of inoculated bacterial strains during phytoremediation of diesel[J].Journal of Hazardous Materials,2011,186（2/3）：1568-1575.

[14]Pawlik M,Piotrowska-Seget Z.Endophytic bacteria associated with Hieracium piloselloides：Their potential for hydrocarbon-utilizing and plantgrowth-promotion[J].Journalof Toxicology&EnvironmentalHealth,Part A,2015,78（13/14）：860-870.

[15]Fatima K,Afzal M,Imran A,et al.Bacterial rhizosphere and endosphere populations associated with grasses and trees to be used for phytoremediation of crude oil contaminated soil[J].Bulletin of Environmental Contamination&Toxicology,2015,94（3）：314-320.

[16]Khan S,Afzal M,Iqbal S,et al.Plant-bacteria partnerships for the remediation of hydrocarbon contaminated soils[J].Chemosphere,2013,90（4）：1317-1332.

[17]Phillips L A,Germida J J,Farrell R E,et al.Hydrocarbon degradation potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants[J].Soil Biology&Biochemistry,2008,12（40）：3054-3064.

[18]Forchetti G,Masciarelli O,Alemano S,et al.Endophytic bacteria in sunflower（Helianthus annuus L.）：Isolation,characterization,and production of jasmonates and abscisic acid in culture medium[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2007,76（5）：1145-1152.

[19]Ikeda S,Okubo T,Anda M,et al.Community and genome-based views of plant-associated bacteria：Plant-bacterial interactions in soybean and rice[J].Plant&Cell Physiology,2010,51（9）：1398-1410.

[20]Gagne-Bourgue F,Aliferis K A,Seguin P,et al.Isolation and characterization of indigenous endophytic bacteria associated with leaves of switchgrass（Panicum virgatum L.）cultivars[J].Journal of Applied Microbiology,2013,114（3）：836-853.

[21]Oluwafemi S O,Matthew O I,Sunday A,et al.Degradation of hydrocarbons and biosurfactant production by Pseudomonas sp.strain LP1[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2009,25（9）：1615-1623.

[22]Varma S S,Lakshmi M B,Rajagopal P,et al.Degradation of total petroleum hydrocarbon（TPH） in contaminated soil using Bacillus pumilus MVSV3[J].Biocontrol Science,2017,22（1）：17-23.

[23]Calvo C,Toledo F L,González-López J.Surfactant activity of a naphthalene degrading Bacillus pumilus strain isolated from oil sludge[J].Journal of Biotechnology,2004,109（3）：255-262.

[24]De Vasconcellos S P,Crespim E,Da Cruz G F,et al.Isolation,biodegradation ability and molecular detection of hydrocarbon degrading bacteria in petroleum samples from a Brazilian offshore basin[J].Organic Geochemistry,2009,40（5）：574-588.

[25]Fatima K,Imran A,Amin I,et al.Plant species affect colonization patterns and metabolic activity of associated endophytes during phytoremediation of crude oil-contaminated soil[J].Environmental Science&Pollution Research,2016,23（7）：6188-6196.

[26]Ho Y N,Mathew D C,Hsiao S C,et al.Selection and application of endophytic bacterium Achromobacter xylosoxidans strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants[J].Journal of Hazardous Materials,2012,219/220（12）：43-49.

[27]Mukherji S,Jagadevan S,Mohapatra G,et al.Biodegradation of diesel oil by an Arabian Sea sediment culture isolated from the vicinity of an oil field[J].Bioresource Technology,2004,95（3）：281-286.

[28]Horowitz A,Gutnick D,Rosenberg E.Sequential growth of bacteria on crude oil[J].Applied Microbiology,1975,30（1）：10-19.

[29]Verma S,Bhargava R,Pruthi V.Oily sludge degradation by bacteria from Ankleshwar,India[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2006,57（4）：207-213.

[30]Deng M C,Li J,Liang F R,et al.Isolation and characterization of a novel hydrocarbon-degrading bacterium Achromobacter sp.HZ01 from the crude oil-contaminated seawater at the Daya Bay,Southern China[J].Marine Pollution Bulletin,2014,83（1）：79-86.

[31]Nkem B M,Halimoon N,Yusoff F M,et al.Isolation,identification and diesel-oil biodegradation capacities of indigenous hydrocarbon-degrading strains of Cellulosimicrobium cellulans and Acinetobacter baumannii from tarball at Terengganu Beach,Malaysia[J].Marine Pollution Bulletin,2016,107（1）：261-268.

[32]Ghanem K M,Al-Garni S M,Al-Zahrani M A.Bioremediation of diesel fuel by fungal consortium using statistical experimental designs[J].Polish Journal of Environmental Studies,2016,25（1）：97-106.

[33]Margesin R,Schinner F.Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2001,56（5/6）：650-663.

[34]吳 濤,謝文軍,依艷麗,等.耐鹽石油烴降解菌的篩選鑒定及其特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2012,33（11）：3949-3955.

WU Tao,XIE Wen-jun,YI Yan-li,et al.Isolation,identification and characterization of halotolerant petroleum-degrading bacteria[J].Environmental Science,2012,33（11）：3949-3955.

Isolation and degradation characteristics of hydrocarbon-degrading endophytic bacteria from the salt-tolerant plant Chloris virgata

WU Tao1,2,XU Jie3,XIE Wen-jun1,2,YAO Zhi-gang1,LIU Jun-hua2,YANG Hong-jun2,SUN Chun-long1,2,WANG Shu-ping1
（1.Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta,School of Bioengineering,Binzhou University,Binzhou 256600,China;2.Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta,Binzhou University,Binzhou 256600,China;3.Department of Bioengineering,Binzhou Vocational College,Binzhou 256603,China）

The degradation characteristics of hydrocarbon-degrading endophytic bacteria isolated from salt-tolerant plants may provide the foundation for phytoremediation of petroleum-polluted saline soils using endophytic bacteria.Twenty-four strains of endophytic petroleumdegrading bacteria were isolated from the salt-tolerant plant Chloris virgata,which grows in a heavily saline-alkaline,crude oil-contaminated environment in the Yellow River Delta,China.All 24 strains were able to utilize diesel oil as their sole carbon and energy source.Their abilities to degrade diesel oil were compared to screen one highly effective petroleum-degrading bacterium named BF04.The strain BF04 was identified as Bacillus pumilus based on physiological and biochemical characteristics,and 16S ribosomal DNA analysis.In addition,we studied the kinetic characteristics of diesel oil degradation and the capability of the strain to utilize different hydrocarbons.The results showed that strain BF04 could utilize straight-chain paraffin,branched paraffin,and mononuclear aromatics,but could not utilize phenol or polycyclic aromatic hydrocarbons.The degradation rate of diesel-oil short-chain n-alkanes（nC11～nC23）was relatively higher than that of long-chain n-alkanes（nC24～nC27）in the mineral salts（liquid）medium.The degradation of petroleum may be expressed using a first-order kinetic model.Moreover,the strain BF04 degraded diesel-oil effectively in the presence of 3%NaCl,indicating that strain BF04 has potential application in the bioremediation of petroleum-contaminated saline-alkaline soils.

petroleum contamination;saline soil;endophytic bacteria;Bacillus pumilus;salt-tolerant plant;petroleum degradation

X172

A

1672-2043（2017）11-2267-08

10.11654/jaes.2017-0771

吳 濤，許 杰，謝文軍，等.耐鹽植物虎尾草內(nèi)生解烴細(xì)菌的篩選及其降解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（11）：2267-2274.

WU Tao,XU Jie,XIE Wen-jun,et al.Isolation and degradation characteristics of hydrocarbon-degrading endophytic bacteria from the salt-tolerant plant Chloris virgata[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）：2267-2274.

2017－05－31 錄用日期：2017-08-23

吳 濤（1980—），男，山東平陰人，博士，副教授，從事污染土壤的生物修復(fù)研究。E-mail：wtsdbz@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（41401359）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J14LE05）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013DM001）

Project supported：The Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China（41401359）；The Project of Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program（J14LE05）；Natural Science Foundation of Shandong Province（ZR2013DM001）