魏愛麗＊，龍 ?。?，李 微，丁 銳，陳 偉，王莉莉

（1.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

基于細(xì)胞高內(nèi)涵分析表征氮芥HN-3的細(xì)胞毒性

魏愛麗1，2＊，龍 隆1，2＊，李 微1，2，丁 銳1，2，陳 偉1，2，王莉莉1，2

（1.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的研究氮芥HN-3對不同來源細(xì)胞的毒性表型特征。方法HN-3 100，300和450 μmol·L-1分別作用于原代人胚表皮角質(zhì)細(xì)胞（HEKf），原代成人皮膚成纖維細(xì)胞（HDFa）和人肺成纖維細(xì)胞（HLF）0.5，2，4，6，8，24和48 h后，采用基于細(xì)胞成像的多參數(shù)分析技術(shù)，檢測HN-3對細(xì)胞存活、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架（微絲和微管）、線粒體膜電位（MMP）、氧化應(yīng)激、核膜通透性（NMP）、磷酸化組蛋白、溶酶體、自噬、細(xì)胞周期和凋亡等參數(shù)的影響。結(jié)果HN-3引起不可逆性的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為存活細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。在存活細(xì)胞數(shù)量顯著減少前，從0.5 h開始，細(xì)胞內(nèi)活性氧和磷酸化組蛋白水平即顯著升高，谷胱甘肽含量顯著降低（P＜0.01）。HEKf細(xì)胞內(nèi)溶酶體在0.5 h時(shí)減少，而HDFa和HLF細(xì)胞內(nèi)溶酶體則分別在0.5和2 h升高，并伴有微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）蛋白表達(dá)升高。伴隨存活細(xì)胞數(shù)量減少，HEKf細(xì)胞核亮度升高，核面積減少，微絲、微管亮度和面積減少，MMP顯著降低（P＜0.01），溶酶體亮度有增加趨勢；與此相反，HDFa和HLF細(xì)胞表現(xiàn)為核面積增加，微絲、微管亮度和面積增加，MMP顯著升高（P＜0.01），但溶酶體亮度增加，且HLF細(xì)胞LC3B的含量顯著升高（P＜0.01）；同時(shí)，3種細(xì)胞均有NMP增高和錳超氧化物歧化酶含量增加，G2期阻滯。此外，HEKf細(xì)胞出現(xiàn)早期和晚期凋亡，HDFa細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡。結(jié)論HN-3誘發(fā)早期的細(xì)胞損傷效應(yīng)包括DNA損傷、氧化脅迫和溶酶體損傷，晚期導(dǎo)致MMP失衡、NMP增加、G2期細(xì)胞周期阻滯；此外，HN-3特異性地誘導(dǎo)HEKf細(xì)胞核固縮、細(xì)胞骨架蛋白核聚集和細(xì)胞凋亡；誘導(dǎo)HDFa和HLF細(xì)胞核腫脹和細(xì)胞骨架松散，并最終導(dǎo)致HDFa細(xì)胞早凋和HLF細(xì)胞自噬性死亡。

氮芥；細(xì)胞毒表型；DNA損傷；氧化應(yīng)激；高通量篩選分析

硫芥是一戰(zhàn)中被廣泛使用并造成慘重傷亡的強(qiáng)殺傷力化學(xué)武器，是一種以皮膚糜爛為主兼具全身中毒為特點(diǎn)的毒劑［1］。因?yàn)榱蚪婢哂薪婺馕?，故又被稱為芥子氣，其沸點(diǎn)高，揮發(fā)度小，易溶于有機(jī)溶劑和脂肪類組織，極易滲入皮膚造成人體嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)具有病程長、痊愈慢、后遺癥多等病理特點(diǎn)［2-4］。關(guān)于硫芥的損傷機(jī)制已有大量的研究報(bào)道［4-8］，其毒性損傷的本質(zhì)在于其強(qiáng)烷化性，能與特定細(xì)胞大分子共價(jià)交聯(lián)結(jié)合，致使細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)、功能、相關(guān)信號通路和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化以及最終的亞細(xì)胞器、細(xì)胞功能紊亂和結(jié)構(gòu)損傷［2，7］。這些不同階段的細(xì)胞損傷事件與硫芥誘發(fā)皮膚組織損傷的整個(gè)病理生理過程密切相關(guān)。氮芥是用氮原子代替了硫芥中的硫原子合成的系列化合物，分為N，N-二（2-氯乙基）乙胺（HN-1）、N，N-二（2-氯乙基）甲胺（HN-2）和三（2-氯乙基）乙基胺（HN-3）3種類型［9-10］，為硫芥的類似物，具有和硫芥相似的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)以及毒性作用，其中HN-3的毒性最強(qiáng)。隨著氮芥抗癌作用的發(fā)現(xiàn)，對氮芥的研究越來越偏向于癌癥治療及化合物系列結(jié)構(gòu)改造，而忽略了其作為化學(xué)戰(zhàn)劑具有與硫芥同等的危險(xiǎn)性［1，9，11］。另一方面，迄今尚無針對兩者的有效防治藥物，故研究氮芥的毒性效應(yīng)具有重要的意義。近年研究報(bào)道，HN-2作用小鼠皮膚誘導(dǎo)DNA損傷、氧化應(yīng)激和絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶B-轉(zhuǎn)錄因子AP1（mitogen-activated protein kinases/protein kinase B-AP1，MAPK/Akt-AP1）途徑的活化，導(dǎo)致炎癥和蛋白水解介質(zhì)釋放［11］；抑制過度炎癥反應(yīng)可對抗氮芥引起的損傷［12］；在小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞JB6上，HN-2也能誘導(dǎo)DNA損傷并介導(dǎo)相關(guān)的修復(fù)損傷反應(yīng)，阻滯細(xì)胞周期［11，13］。為更好地了解氮芥的細(xì)胞毒性效應(yīng)，本研究在探索硫芥細(xì)胞毒性表型譜研究的基礎(chǔ)上，采用高內(nèi)涵細(xì)胞表型分析技術(shù)平臺，選擇2種原代皮膚細(xì)胞和1種永生化正常人肺細(xì)胞，系統(tǒng)地測定HN-3損傷細(xì)胞表型特征，以期為尋找損傷防治藥物提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

HN-3（純度≥94%）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Thermo Scientific HyClone公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Sigma-Aldrich公司；線粒體膜電位染料Mito Tracker Red CMXRos、溶酶體、pH染料Lyso Tracker Red、微絲染料Alexa Flour 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、凋亡檢測染料、死細(xì)胞染料TOTO-3 iodide、全細(xì)胞染料Cell Mask Deep Red、細(xì)胞核染料Hoechst33342、谷胱甘肽染料mBCI、活性氧染料CM-H2DCFDA、兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）單克隆抗體、小鼠抗α-微管蛋白單克隆抗體、小鼠抗錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）單克隆抗體、小鼠抗磷酸化組蛋白（phospho-histone H2AX，pH2AX）單克隆抗體、Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor 549標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor 549標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗均購自購自美國Life Technologies公司；甲醛溶液、TritonX-100、青霉素、鏈霉素及其他常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)

原代人胚表皮角質(zhì)細(xì)胞（human epidermal keratinocytes-fetal，HEKf）和原代成人皮膚成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblasts-adult，HDFa）購自美國ScienCell公司，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行培養(yǎng)和使用。人肺成纖維細(xì)胞（human lung fibroblasts，HLF）系為本實(shí)驗(yàn)室自存，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%FBS，100 kU·L-1的青霉素、鏈霉素和氨芐青霉素。細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞染毒方案

HN-3即配即用。將HN-3溶解于DMSO配成150 mmol·L-1母液，再用含DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成3×（100，300和450 μmol·L-1）的工作液，其中DMSO終濃度為0.3%，同時(shí)采用含0.3%DMSO培養(yǎng)液作為空白對照。HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞以每孔6×103接種于96孔板（黑邊底透），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，然后按每孔50 μL分別加入不同濃度HN-3溶液，按實(shí)驗(yàn)方案處理細(xì)胞不同時(shí)間（表1）。

1.4 細(xì)胞表型多參數(shù)檢測

按照細(xì)胞表型分析組合（表1）所示，分別進(jìn)行6個(gè)分析組合的參數(shù)標(biāo)記，檢測參數(shù)組合和暴露時(shí)間均參照文獻(xiàn)［14］，每組實(shí)驗(yàn)單獨(dú)進(jìn)行，均設(shè)置細(xì)胞對照組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.4.1 細(xì)胞核、微絲和微管檢測

細(xì)胞暴露HN-3處理結(jié)束后，每孔加入75 μL固定液（含12%甲醛的PBS溶液），室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入 200 μL透膜液（含 0.1%Triton X-100的PBS溶液），室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1 次，再加入50 μL Alexa Flour 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽微絲染料和細(xì)胞核染料，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔使用200 μL PBS洗3次，再加入200 μL封閉液（含5%BSA的PBS溶液）室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗微管蛋白單克隆抗體（1∶500稀釋）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，再加入50 μL Alexa Flour 549標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500稀釋）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機(jī)檢測。

1.4.2 細(xì)胞核和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），MnSOD和核膜通透性（nuclear membrane permeability，NMP）檢測

細(xì)胞在HN-3暴露處理細(xì)胞結(jié)束前0.5 h，每孔加入50 μL細(xì)胞核染料、MMP染料和死細(xì)胞核染料，37℃孵育0.5 h；每孔加入100 μL固定液，室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入200 μL透膜液，室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1次，再加入200 μL封閉液室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗MnSOD單克隆抗體（1∶500稀釋）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，再加入50 μL Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500稀釋）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機(jī)檢測。

1.4.3 細(xì)胞核、LC3B蛋白、溶酶體和pH2AX檢測

細(xì)胞在HN-3暴露處理結(jié)束前0.5 h，每孔加入50 μL細(xì)胞核染料和溶酶體染料，37℃孵育0.5 h；每孔加入100 μL固定液，室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入200 μL透膜液，室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1次，再加入200 μL封閉液室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗pH2AX單克隆抗體（1∶1000）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，每孔加入40 μL兔抗LC3B單克隆抗體工作液，室溫孵育1 h；棄液，再加入50 μL Alexa Flour 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500）和Alexa Flour 549標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗（1∶500）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機(jī)檢測。

Tab.1 Multi-parametric cellular phenotypic assay panel and HN-3 treated protocol time

1.4.4 HDFa細(xì)胞活性氧和谷胱甘肽檢測

取活性氧染料CM-H2DCFDA母液（50 mg CM-H2DCFDA溶于86.5 μL DMSO）10 μL加入至0.5 mL HBSS中，取谷胱甘肽染料mBCI母液（5 mg mBCI溶于 220 μL DMSO）10 μL 加入至 0.5 mL HBSS中，混勻；再分別將上述溶液和1 μL的核染料加入到9 mL預(yù)溫至37℃的HBSS溶液中，混勻，得染色工作液（根據(jù)實(shí)際情況按比例配置所需體積溶液）；染毒處理后細(xì)胞用HBSS洗1次，每孔加入100 μL染色工作液，37℃染色45 min；細(xì)胞換預(yù)溫至37℃的完全培養(yǎng)液孵育5 min；每孔細(xì)胞用100 μL HBSS洗1次，再換200 μL HBSS上機(jī)檢測。

1.4.5 細(xì)胞凋亡的檢測

細(xì)胞染毒處理后，棄液，每孔100 μL結(jié)合緩沖液（mmol·L-1：NaCl 140，HEPES 10，CaCl22.5，pH 7.4）洗1次，加入40 μL凋亡檢測染料（磷脂酰絲氨酸-Alexa Fluor 488膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ用含PI 3 μmol·L-1和 Hoechst33342 1 μmol·L-1的結(jié)合緩沖液1∶500稀釋），室溫避光染色30 min，補(bǔ)加160 μL結(jié)合緩沖液；每孔加入100 μL含有12%甲醛的結(jié)合緩沖液固定，室溫避光固定20 min棄液，每孔加入200 μL PBS溶液，上機(jī)檢測。

1.5 圖像采集及分析

完成標(biāo)記的細(xì)胞，使用IN Cell Analyzer 2000活細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國GE公司）進(jìn)行細(xì)胞圖像采集，選擇20倍物鏡，根據(jù)標(biāo)記的特定熒光標(biāo)記分子的特性采用相應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射波長檢測通道進(jìn)行檢測，DIPI通道（激發(fā)/發(fā)射光波長360 nm/460 nm）檢測Hoechst33342染色；FITC通道（激發(fā)/發(fā)射光波長475 nm/535 nm）檢測Alexa Fluor 488染色；Cy3通道（激發(fā)/發(fā)射光波長535 nm/620 nm）檢測Mito Tracker Red，Lyso Tracker Red，PI，Alexa Fluor 546染色；Cy5通道（激發(fā)/發(fā)射光波長360 nm/460 nm）檢測Cell Mask Deep Red，TOTO-3 iodid，Alexa Fluor 64染色。每孔采集9個(gè)視野，細(xì)胞數(shù)總量不少于200個(gè)，采集圖像儲存于數(shù)據(jù)庫。使用IN Cell Analyzer Workstation圖像分析軟件（GE公司）中的Multi Target Analysis分析模塊，對獲得圖像進(jìn)行分析，表1為各指標(biāo)輸出參數(shù)。除了細(xì)胞凋亡和周期外，參數(shù)均通過細(xì)胞中靶目標(biāo)標(biāo)記的熒光來直接表征。細(xì)胞凋亡分析以AnnexinⅤ和PI染色的熒光強(qiáng)度分別為橫、縱坐標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞分類，包括存活、早期凋亡、晚期凋亡和細(xì)胞死亡4類。細(xì)胞周期分析是根據(jù)Hoechst3342標(biāo)記細(xì)胞核的面積、核染色平均熒光強(qiáng)度及總強(qiáng)度參數(shù)，使用Analyzer Workstation分析軟件、Multi Target Analysis模塊中的Decision Tree Filter將細(xì)胞周期分為G0/G1，S，G2和M期，后2個(gè)分析方法原理與流式細(xì)胞儀分類方法相同。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算3復(fù)孔數(shù)據(jù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以0.3%DMSO處理組為細(xì)胞對照組，進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，并計(jì)算HN-3處理組的變化率：細(xì)胞數(shù)變化率（%）=（細(xì)胞對照組參數(shù)值-HN-3處理組參數(shù)值）/細(xì)胞對照組參數(shù)值×100%；HN-3處理組參數(shù)變化率（%）=（HN-3處理組參數(shù)值-細(xì)胞對照組參數(shù)值）/細(xì)胞對照組參數(shù)值×100%。凋亡和細(xì)胞周期的數(shù)據(jù)由IN Cell Analyzer Workstation圖像分析軟件直接得出。數(shù)據(jù)用±s表示。采用Graphpad 6.0作圖統(tǒng)計(jì)軟件，使用One-way ANOVA進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞核形態(tài)和骨架的影響

圖1A～3A所示，HN-3 300 μmol·L-1作用細(xì)胞48 h，細(xì)胞核數(shù)量明顯減少（P＜0.01），HEKf（圖1A）細(xì)胞核縮小，微絲和微管面積減少；HDFa（圖2A）和HLF（圖3A）細(xì)胞由長梭狀排列，變?yōu)樗缮⑵瑺罘植迹⒐芤院藶橹行木奂?，微絲松散分布。對采集的圖片進(jìn)行分析，以參數(shù)的變化率的百分值作圖。圖1B～3B顯示，3類細(xì)胞隨HN-3作用濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸增加。細(xì)胞核形態(tài)、微絲和微管也隨濃度的增加，變化程度隨之增加。HN-3作用HEKf細(xì)胞（圖1B）核面積減少，形態(tài)參數(shù)增大，亮度增加，均勻程度降低；微絲和微管的亮度和面積降低（P＜0.01）；HDFa細(xì)胞（圖2B）核面積增加，均勻程度降低（P＜0.01），微絲和微管的亮度和面積增加（P＜0.01）；HLF細(xì)胞（圖3B）核面積增加，形態(tài)參數(shù)增大，亮度降低，均勻程度降低，微絲和微管的亮度和面積增加（P＜0.01）。由時(shí)間效應(yīng)曲線圖可見，HEKf細(xì)胞（圖1C）自6 h后，HDFa（圖2C）和HLF（圖3C）細(xì)胞自8 h后細(xì)胞增殖抑制率顯著升高并具有時(shí)間相關(guān)性（r=0.99，P＜0.01），且細(xì)胞核和骨架的各參數(shù)隨細(xì)胞數(shù)量的顯著減少發(fā)生明顯改變（P＜0.01）?？梢?，細(xì)胞核形態(tài)和骨架的改變是HN-3導(dǎo)致細(xì)胞毒性損傷的晚期事件。HEKf與HDFa和HLF細(xì)胞在胞核和骨架參數(shù)上具有不同的變化趨勢，后兩種細(xì)胞的變化趨勢基本一致。

2.2 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞周期的影響

Fig.1 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HEKf cells by high content analysis.A：the typical images of the cells treated with HN-3 300 μmol·L-1for 48 h.B：the cells were treated for 48 h with different concentrations.C：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.Nuc：nuclear；1/FF：1/（form factor）；Int：staining intensity；Int CV：coefficient of variation of staining intensity；TA：total area.The change rate of cell count（%）=（parameter value of control group-parameter value of HN-3 treatment group）/parameter value of control group×100%；the change rate of other eight parameters（%）=（parameter value of HN-3 treatment group-parameter value of control group）/parameter value of control group×100%.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.2 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HDFa cells by high content analysis.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3處理細(xì)胞8 h，HEKf和HDFa細(xì)胞有G2和M期阻滯，HLF細(xì)胞有G0/G1阻滯；HN-3處理細(xì)胞24和48 h，3種細(xì)胞均表現(xiàn)為G2期阻滯（圖4）。可見，HN-3主要將細(xì)胞周期阻滯在G2期，使之不能順利進(jìn)入細(xì)胞分裂期。

2.3 HN-3誘導(dǎo)HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞凋亡

HN-3 450 μmol·L-1處理 HEKf 細(xì)胞 48 h，AnnexinⅤ染色明顯，PI染色不明顯（圖5A），表示HN-3可誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡；處理HDFa細(xì)胞48 h，AnnexinⅤ和PI染色均明顯（圖5B），說明誘導(dǎo)細(xì)胞晚期凋亡。HEKf細(xì)胞（圖5C）在24和36 h即有明確的細(xì)胞早凋現(xiàn)象（P＜0.01），48 h隨HN-3濃度增加，發(fā)生早晚凋亡現(xiàn)象的細(xì)胞比率逐漸增加；在HDFa細(xì)胞（圖5D）上，僅在36 h后有細(xì)胞早凋現(xiàn)象（P＜0.01）；而HLF細(xì)胞（圖5E）未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。隨給藥時(shí)間和HN-3濃度的增加，壞死細(xì)胞所占的比例也增加。結(jié)果表明，HN-3在不同細(xì)胞背景上誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力不同，3種細(xì)胞HN-3中毒后的細(xì)胞死亡機(jī)制有所不同。

Fig.3 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HLF cells by high content analysis.See Fig.1 for the cell treatment and legend.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.4 Effect of HN-3 on cell cycle of HEKf，HDFa and HLF cells.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞線粒體膜電位、氧化應(yīng)激和核膜通透性的影響

Fig.5 Effect of HN-3 on cell apoptosis in HEKf，HDFa and HLF cells.A and B：HEKf and HDFa cells were treated with HN-3 450 μmol·L-1for 48 h ，respectively；C，D and E：the quantitative analysis results of different concentrations of HN-3 treated for 24，36 and 48 h in HEKf（C），HDFa（D）and HLF（E）cells，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3 300 μmol·L-1處理細(xì)胞48 h，HEKf細(xì)胞（圖6A1）MMP降低，HDFa（圖6B1）和HLF（圖6C1）細(xì)胞MMP升高，3類細(xì)胞的MnSOD和NMP均增加。對采集的圖片進(jìn)行分析，以參數(shù)的變化率的百分值為縱坐標(biāo)，濃度或時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。如圖6A2-C2表示，參數(shù)的變化程度隨濃度的增大依次增加，HEKf細(xì)胞（圖6A2）MMP先升高（P＜0.01）再隨濃度的增加有逐漸降低的趨勢（P＜0.01），說明濃度越大，對線粒體的損傷越嚴(yán)重，而HDFa（圖6B2）和HLF（圖6C2）細(xì)胞的MMP則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢（P＜0.01）。說明HN-3對HEKf細(xì)胞與HDFa，HLF細(xì)胞線粒體損傷類型不同，HEKf更為嚴(yán)重。而MnSOD和NMP隨濃度的增加而持續(xù)增加（P＜0.01），其中HEKf和HLF細(xì)胞的MnSOD和HDFa細(xì)胞的NMP的增加最為顯著。鑒于MnSOD水平的升高既反映細(xì)胞的氧化脅迫水平也反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激能力，推測HDFa細(xì)胞氧化脅迫或應(yīng)激修復(fù)的能力相對較弱。HN-3暴露的時(shí)間效應(yīng)曲線顯示，HN-3 300 μmol·L-1處理 HDFa（圖6B3）和HLF（圖6C3）細(xì)胞，上述3個(gè)參數(shù)在24h時(shí)才發(fā)生明顯的變化（P＜0.01），而HEKf細(xì)胞（圖6A3）則是在48 h才有明顯的變化（P＜0.01）。這些變化晚于細(xì)胞數(shù)量開始顯著減少的時(shí)間。除此之外，本研究還檢測了HN-3對HDFa細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH的影響，如時(shí)間效應(yīng)曲線（圖6B2）所示，在0.5 h時(shí)GSH含量迅速降低（P＜0.01），約降至總含量的20%，之后一直持續(xù)到6 h，而ROS含量呈逐漸增加趨勢（P＜0.01），同樣至6 h基本達(dá)到最大值，約75%增加。表明HN-3能快速誘發(fā)HDFa細(xì)胞ROS釋放和GSH耗竭導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，推測HN-3對另2個(gè)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷能力更強(qiáng)。

2.5 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞pH2AX，LC3B和溶酶體的影響

Fig.6 Effect of HN-3 on MnSOD，MMP，NMP，GSH and ROS in HEKf（A1-A3），HDFa（B1-B3）and HLF（C1-C3）cells.A1，B1 and C1：typical images of nucleus，MnSOD，MMP and NMP in HEKf（A），HDFa（B）and HLF（C）cells treated with HN-3 300 μmol·L-1for 48 h；A2，B2 and C2：the cells were treated with NH-3 100，300 and 450 μmol·L-1for 48 h；A3，B3 and C3：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.7 Effect of HN-3 on pH2AX，Lyso and LC3B in HEKf（A1-A3），HDFa（B1-B3）and HLF（C1-C3）cells.A1，B1 and C1 ：typical images of nucleus，pH2AX，lysosome and LC3B in HEKf，HDFa and HLF cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1 for 24 ，except that pH2AX was measured in HLF cells for 4 h；A2，B2，C2：the cells were treated with HN-3 100，300 and 450 μmol·L-1 for 24 h，except that pH2AX was measured in HLF cells for 4 h；A3，B3 and C3：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3 300 μmol·L-1處理細(xì)胞24 h，HEKf細(xì)胞（圖7A1）LC3B蛋白亮度輕度增加，溶酶體亮度增加，HDFa細(xì)胞（圖7B1）LC3B蛋白亮度基本無變化，溶酶體亮度增加，HLF細(xì)胞（圖7C1）LC3B蛋白亮度明顯增加，溶酶體亮度輕度增加，3類細(xì)胞的pH2AX熒光亮度均有明顯的增加。LC3B、溶酶體和pH2AX的變化程度隨濃度的增大依次增加（圖7A2-C2）。在3類細(xì)胞中，pH2AX的亮度增加均很顯著（P＜0.01），另HEKf細(xì)胞（圖7A2）溶酶體亮度增加最明顯（P＜0.01），HLF細(xì)胞（圖7C2）LC3B蛋白亮度增加最明顯（P＜0.01），意味著3類細(xì)胞的DNA損傷均很強(qiáng)，HEKf細(xì)胞溶酶體損傷最嚴(yán)重，HLF細(xì)胞有很強(qiáng)的自噬能力。由時(shí)間效應(yīng)曲線所示（圖7A3-C3），3類細(xì)胞自0.5 h起，pH2AX含量就開始增加（P＜0.01），至4 h時(shí)，pH2AX含量增加＞1倍（P＜0.01）；在HEKf和HDFa細(xì)胞上的持續(xù)測定顯示，至 24 h，pH2AX含量增加至 3～4倍（P＜0.01）。表明HN-3具有較強(qiáng)和持續(xù)的DNA損傷作用。在HEKf細(xì)胞（圖7A3）上，LC3B的表達(dá)含量與細(xì)胞數(shù)量曲線基本一致，即LC3B蛋白是伴隨細(xì)胞死亡發(fā)生變化的；而HN-3暴露0.5 h，溶酶體減少（P＜0.05），之后恢復(fù)并持續(xù)增大（P＜0.01）。提示HN-3作用HEKf細(xì)胞出現(xiàn)的自噬可能是死亡性自噬，且在早期產(chǎn)生了一過性溶酶體損傷作用。在HDFa細(xì)胞（圖7B3）上，0.5 h時(shí)LC3B增加約25%（P＜0.01），之后回復(fù)。相應(yīng)的溶酶體在2 h時(shí)有一過性增加（P＜0.01），之后回復(fù)，并在6 h 減少（P＜0.01），8 h后，伴隨細(xì)胞數(shù)量的減少而逐漸增加（P＜0.01）。提示HDFa細(xì)胞存在一過性自噬修復(fù)現(xiàn)象，但修復(fù)能力較弱。在HLF細(xì)胞（圖7C3）上，0.5 h時(shí)溶酶體和LC3B有一輕度的增加（P＜0.05），之后LC3B隨著時(shí)間的延長含量顯著上升（P＜0.01），至細(xì)胞出現(xiàn)死亡后出現(xiàn)降低的趨勢，而溶酶體只有早期應(yīng)激性和細(xì)胞死亡后升高（P＜0.05），提示HLF細(xì)胞具有較強(qiáng)的自噬修復(fù)作用。以上結(jié)果表明，HN-3在3種不同類型的細(xì)胞中誘發(fā)的細(xì)胞自噬反應(yīng)不同，永生化HLF細(xì)胞自噬能力最強(qiáng)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DNA損傷、氧化脅迫和溶酶體損傷是HN-3損傷細(xì)胞的早期事件，MMP失衡、NMP增加、G2期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞損傷晚期事件。pH2AX含量增加、G2期阻滯、MnSOD和NMP增加及溶酶體亮度增加是HN-3損傷3類細(xì)胞共有的特征。HN-3作用3類不同來源的細(xì)胞系，會產(chǎn)生不完全相同的毒性特征。在細(xì)胞核和骨架的變化上，HN-3會造成HEKf細(xì)胞核、微絲和微管皺縮；造成HDFa和HLF細(xì)胞出現(xiàn)核面積增加，微絲和微管的亮度和面積增加，表現(xiàn)為細(xì)胞呈片狀分布。在線粒體損傷上，HEKf細(xì)胞MMP降低，HDFa和HLF細(xì)胞MMP升高，說明HEKf細(xì)胞有更嚴(yán)重的線粒體損傷。在氧化應(yīng)激上，HDFa細(xì)胞在HN-3處理0.5 h時(shí)，ROS含量迅速升高，谷胱甘肽降低，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，但是只有在高濃度HN-3處理時(shí)才有明顯的MnSOD增加，而HEKf和HLF細(xì)胞的MnSOD在低濃度HN-3處理時(shí)有顯著的增加。在細(xì)胞死亡方式上，HN-3作用HEKf，HDFa和HLF細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量明顯降低的時(shí)間分別是8，24及24 h，出現(xiàn)凋亡的時(shí)間是24及48 h或不出現(xiàn)凋亡，且HEKf細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡和晚期凋亡，自6 h后有LC3B的增加，HDFa只有出現(xiàn)早凋，LC3B的含量基本無變化，而HLF自0.5 h后LC3B的含量顯著上升，隨著濃度和時(shí)間增加，具有增加的趨勢，說明HEKf細(xì)胞對HN-3的毒性作用最敏感，且HLF細(xì)胞具有強(qiáng)自噬修復(fù)作用，隨后是HEKf細(xì)胞，其產(chǎn)生的自噬作用很有可能是自噬性死亡。HN-3作用細(xì)胞0.5 h，即產(chǎn)生pH2AX和活性氧的升高，谷胱甘肽和溶酶體亮度降低，說明DNA、谷胱甘肽和溶酶體可能是HN-3損傷細(xì)胞的重要靶標(biāo)，HN-3損傷細(xì)胞的毒性表型和文獻(xiàn)中報(bào)道的毒性機(jī)制一致。

永生化細(xì)胞易于操作，獲得性強(qiáng)，是化學(xué)品細(xì)胞毒性評價(jià)的主要實(shí)驗(yàn)材料，然而長期體外傳代培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞在體的諸多生物學(xué)特性丟失。為了更準(zhǔn)確反映化學(xué)品的人體危害，開發(fā)有效的對抗手段，更接近人體生理狀態(tài)的原代人源細(xì)胞成為現(xiàn)代毒理學(xué)研究倡導(dǎo)使用的實(shí)驗(yàn)材料［15］。HN-3具有非特異性損傷機(jī)制，其在不同類型細(xì)胞上的毒性作用尚無系統(tǒng)性的比較研究。本研究選擇不同來源或類型的細(xì)胞，其中HEKf和HDFa是皮膚重要的組成細(xì)胞。其中角質(zhì)細(xì)胞由角質(zhì)形成細(xì)胞演變而來，具較強(qiáng)的增殖能力，有保護(hù)機(jī)體免受侵害作用；成纖維細(xì)胞由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，在創(chuàng)傷修復(fù)中表現(xiàn)出重要的作用。HLF是永生化正常人肺成纖維細(xì)胞，也由間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，是細(xì)胞毒研究首選細(xì)胞系。本研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度HN-3在上述3種細(xì)胞上的細(xì)胞毒表型譜，在烷化劑損傷機(jī)制最為相關(guān)的3個(gè)參數(shù)，即DNA損傷、氧化應(yīng)激和G2期阻滯，3種細(xì)胞變化特征一致。在細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞骨架和MMP參數(shù)上，HDFa和HLF細(xì)胞具有相同的變化特征，而HEKf細(xì)胞的變化特征與2種成纖維細(xì)胞不一致，如HEKf細(xì)胞核皺縮、MMP下降、細(xì)胞骨架以核為中心聚集，而2種成纖維細(xì)胞多是核輕度腫脹、MMP升高、細(xì)胞骨架松散。值得注意的是，3種細(xì)胞的死亡方式表現(xiàn)不同，從HEKf，HDFa到HLF細(xì)胞，凋亡能力由強(qiáng)至弱，早期自噬活性由弱至強(qiáng)。結(jié)果說明，即使是永生化細(xì)胞HLF也可較好地反映HN-3類烷化劑的主要損傷機(jī)制；HEKf細(xì)胞較成纖維細(xì)胞對于HN-3的損傷作用更為敏感。鑒于早期自噬對抗細(xì)胞凋亡［16］，提示永生化細(xì)胞在傳代過程中獲得了更強(qiáng)的自噬修復(fù)能力，而致凋亡能力喪失，這一發(fā)現(xiàn)仍需要進(jìn)一步證明。但也提示，基于死亡調(diào)控機(jī)制的抗芥子氣保護(hù)策略的篩選可能不適于選用永生化細(xì)胞。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的SM的細(xì)胞表型譜結(jié)果［14］發(fā)現(xiàn)，HN-3和硫芥在2種原代培養(yǎng)人皮膚細(xì)胞的表型譜特征，HN-3與硫芥具有類似的細(xì)胞表型特征，如DNA損傷、谷胱甘肽耗竭、活性氧釋放、溶酶體損毀、氧化應(yīng)激，線粒體損傷、核膜通透性、細(xì)胞周期阻滯、凋亡和自噬等細(xì)胞毒現(xiàn)象；并在2種類型細(xì)胞上，HN-3與硫芥具有一致的表現(xiàn)。然而，在特定細(xì)胞表型上HN-3與硫芥也呈現(xiàn)出不同程度的作用，如HN-3具有更強(qiáng)更持久的誘導(dǎo)DNA損傷能力，而硫芥則表現(xiàn)為更強(qiáng)谷胱甘肽耗竭、谷胱甘肽釋放、氧化應(yīng)激，溶酶體損傷的作用。說明硫芥急性毒性更強(qiáng)，HN-3潛伏期長，提示應(yīng)更關(guān)注NH3長期的致突變效應(yīng)。

總之，通過不同來源和不同類型細(xì)胞上，對HN-3的時(shí)間和濃度細(xì)胞表型特征的定量測定，更加明確了HN-3烷基化試劑本質(zhì)的細(xì)胞損傷效應(yīng)和機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)HN-3較硫芥具有更強(qiáng)的DNA損傷作用和更弱的氧化損傷、溶酶體破壞效應(yīng)，其毒性的長期效應(yīng)和毒性機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為其中毒的臨床防治提供思路。

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＊Co-first author.

2016-12-25 接受日期：2017-06-08）

（本文編輯：喬 虹）

Charaterizing cytotoxicity of nitrogen mustard HN-3 based on cellular high content analysis

WEI Ai-li1,2＊,LONG Long1,2＊,LI Wei1,2,DING Rui1,2,CHEN Wei1,2,WANG Li-li1,2
(1.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Beijing 100850,China;2.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)

OBJECTIVETo study the cytotoxic characteristics of nitrogen mustard HN-3 in different cell.METHODSHuman epidermal keratinocytes-fetal(HEKf),human dermal fibroblasts-adult(HDFa)and human lung fibroblasts(HLF)cell lines were treated with HN-3 100,300 and 450 μmol·L-1for 0.5,2,4,6,12,24 and 48 h,respectively.Multi-parameter analysis technology based on cell imaging was used to examine the effects of HN-3 on cell survival,cell cycle arrest,apoptosis,autophagy and oxidative stress,along with parameters concerning nucleus,cytoskeleton(actin and tubulin),lysosome,nuclear membrane permeability(NMP),mitochondrial membrane potential(MMP)and phosphohistone H2AX(pH2AX).RESULTSHN-3 caused irreversible cellular damage by significantly decreasing the number of HEKf,HDFa and HLF cells in a time-dependent manner(P＜0.01).Before the cell number was reduced robustly,the content of reactive oxygen species and pH2AX significantly increased,but the glutathione content decreased after cells were exposed to HN-3 for 0.5 h(P＜0.01).In addition,the content of lysosome was reduced in HEKf cells at 0.5 h,but increased in HDFa and HLF cells at 0.5 and 2 h respectively,accompanied by the increase in microtubule-associated protein 1 light chain 3B(LC3B)puncta.With the significant reduction of the cell number in HEKf cell line,the nuclear intensity increased,nuclear area decreased,the intensity and area of F-actin and α-tubulin decreased,MMP decreased(P＜0.01)and lysosomal intensity increased.But the effects of HN-3 on HDFa and HLF cell lines were quite different.The nuclear area increased,the intensity and area of F-actin and a-tubulin increased,MMP increased(P＜0.01)and the intensity of lysosome increased.In HLF cells,there was an increase in LC3B puncta(P＜0.01).In all the three cell lines,NMP and manganese superoxide dismutase content were increased,and cell cycle arrested at G2phase.HN-3 Induced early apoptosis in HDFa cells but late apoptosis in HEKf cells.CONCLUSIONHN-3 causes DNA damage,oxidative stress and lysosome damage at an early stage,whereas at the late stage,the imbalance of MMP,increase in NMP,and G2phage arrest are the major cytotoxic effects.Moreover,HN-3 specifically induces nuclear condensation,cytoskeleton protein aggregation and apoptosis in HEKf cell.HN-3 Induces nuclear swelling,and loose cytoskeleton in HDFa cells and HLF cells,eventually inducing early apoptosis in HDFa cells and autophagic death in HLF cells.

nitrogen mustard;cytotoxic phenotype;DNA injury;oxidative stress;high-throughput screening assays

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81430090);the Key Technologies of Comprehensive New Drug Research and Development(2012ZX09301003-001);and the Key Technologies of Comprehensive New Drug Research and Development(2012ZX09301003-003)

WANG Li-li,E-mail:wangll63@126.com,Tel:(010)66932674

R99

A

1000-3002-（2017）07-0742-12

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.007

國家自然科學(xué)基金（81430090）；綜合性新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2012ZX09301003-001）；綜合性新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2012ZX09301003-003）

魏愛麗，女，碩士研究生，主要從事毒理學(xué)和藥物篩選研究；龍 隆，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物篩選工作。

王莉莉，E-mail：wangll63@126.com，Tel：（010）66932674

＊共同第一作者。