■ 湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)股份有限公司 蔣湘 文趙明 冉春麗 邱德全

廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 方儀 劉建勇/文圖

日本囊對(duì)蝦早期胚胎發(fā)育的研究

■ 湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)股份有限公司 蔣湘 文趙明 冉春麗 邱德全

廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 方儀 劉建勇/文圖

日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）隸屬于甲殼綱、十足目、對(duì)蝦科、囊對(duì)蝦屬，分布在印度—西太平洋熱帶、非洲東海岸、馬來(lái)西亞、日本、朝鮮、中國(guó)東南沿海等海域，我國(guó)90年代開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行人工養(yǎng)殖。日本囊對(duì)蝦耐干露、色澤艷麗，長(zhǎng)途運(yùn)輸存活率達(dá)90%以上，通常鮮活銷售，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深受水產(chǎn)品市場(chǎng)和養(yǎng)殖者歡迎。日本囊對(duì)蝦的早期發(fā)育階段是復(fù)雜的生命周期中最為敏感的階段。鹽度和溫度是自然水體分布范圍的主要決定因子，影響著日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)與繁殖，尤其是影響日本囊對(duì)蝦胚胎發(fā)育的最重要的非生物因素。多年來(lái)，凡納濱對(duì)蝦進(jìn)口親蝦的價(jià)格節(jié)節(jié)攀升，而養(yǎng)殖成功率卻不斷下降，嚴(yán)重影響對(duì)蝦養(yǎng)殖效益。因此開(kāi)展日本囊對(duì)蝦的人工育種和養(yǎng)殖技術(shù)研究，以期替代部分凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖，優(yōu)化我國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)，并為我國(guó)對(duì)蝦的繁殖生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 親蝦來(lái)源

實(shí)驗(yàn)在湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)股份有限公司南三基地開(kāi)展，水產(chǎn)科研車間96個(gè)孵化桶、親蝦A車間水泥池（5m×5m×1.2m）2個(gè)、產(chǎn)卵桶、加熱棒、奧特光學(xué)生物顯微鏡、吸管、燒杯等。實(shí)驗(yàn)所用日本囊對(duì)蝦親蝦來(lái)源臺(tái)灣野生群體子一代，平均體長(zhǎng)為12.48±1.28cm，體重為21.32±2.13g。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

親蝦暫養(yǎng)50天，室內(nèi)培育，將已交配的并性腺剛開(kāi)始發(fā)育的雌蝦（圖15）挑出單獨(dú)養(yǎng)殖，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)性腺成熟，晚上7點(diǎn)挑選性腺發(fā)育Ⅳ期或以上（圖14）親蝦到500L產(chǎn)卵桶內(nèi)催產(chǎn)，溫度30℃，鹽度26.04‰，每個(gè)桶加5ppm的EDTA二鈉鹽消除重金屬離子，產(chǎn)卵后移走親蝦，隨時(shí)取卵進(jìn)行鏡檢（物鏡10×或40×）并拍照。

1.3 溫度與鹽度對(duì)日本囊對(duì)蝦胚胎發(fā)育試驗(yàn)

設(shè)置加溫與不加溫2個(gè)試驗(yàn)組比較受精卵胚胎發(fā)育的差異，每個(gè)組設(shè)置2個(gè)重復(fù)，自然水溫（26±0.36）℃，加溫30℃恒定。用處理過(guò)的海水、淡水及分析純NaCI調(diào)節(jié)鹽度梯度，按等對(duì)數(shù)間隔設(shè)置5個(gè)鹽度梯度，分別為15.02‰、19.20‰、24.53‰、31.65‰、40.04‰，每個(gè)組設(shè)置2個(gè)重復(fù)，將親蝦在產(chǎn)卵桶內(nèi)剛產(chǎn)出的受精卵分放于不同鹽度的桶中進(jìn)行孵化觀察，每隔一定時(shí)間取少量受精卵于顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育情況并拍照做記錄。

2.結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育

在水溫30℃、鹽度26.04‰下，日本囊對(duì)蝦受精卵產(chǎn)出到孵化過(guò)程見(jiàn)圖1～12。

2.1.1 卵裂

日本囊對(duì)蝦剛產(chǎn)出的卵形狀不規(guī)則，略呈三角形（圖17），隨后吸水成圓球形，卵徑250微米左右。受精卵內(nèi)部分泌一種膠狀物質(zhì)，吸水膨脹而形成透明的受精膜（圖1），為沉性卵，未受精卵則無(wú)此過(guò)程（圖13），為浮性卵。檢查卵子是否受精，可以根據(jù)這一特點(diǎn)予以分別。當(dāng)海水靜止時(shí)，受精卵沉在底部容易缺氧死亡，孵化時(shí)應(yīng)適當(dāng)加大氣量，讓水體微波帶動(dòng)受精卵處于漂浮狀態(tài)，增加與海水接觸面積，提高孵化率。成熟的卵子一旦接觸海水即發(fā)生皮層反應(yīng)，與是否受精無(wú)關(guān)，受海水激活的卵子，卵皮層中的周邊體似米粒狀向外釋放，卵子也由不規(guī)則形慢慢呈現(xiàn)圓形。日本囊對(duì)蝦的卵屬中黃卵，卵裂方式為全均等分裂，第1、2、3次分裂產(chǎn)生的分裂球尤其明顯（圖2、3、4），第3次卵裂產(chǎn)生的8個(gè)分裂球呈現(xiàn)正常的螺旋卵裂特征，從第1次分裂2細(xì)胞到第6次分裂產(chǎn)生64細(xì)胞進(jìn)入到囊胚期（圖7），每次分裂時(shí)間大約為 8～15min。

2.1.2 原腸期

經(jīng)第7次卵裂后，大約在產(chǎn)卵后2.5h，囊胚的植物極開(kāi)始變平，接著該處細(xì)胞向內(nèi)凹陷，逐漸形成原腸腔(圖8)。胚胎呈中空?qǐng)A形，原腸腔形狀不規(guī)則，在顯微鏡下不能明顯觀察到胚胎邊緣的分裂球，可明顯觀察到內(nèi)陷處的細(xì)胞分裂球。整個(gè)原腸期歷時(shí)間約1.5h。

圖1 受精卵

圖2 二細(xì)胞

圖3 四細(xì)胞

圖4 八細(xì)胞

圖5 十六細(xì)胞

圖6 三十二細(xì)胞

圖7 囊胚期

圖8 原腸期

圖9 肢牙期

圖10 膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期

圖11 膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期（眼點(diǎn)）

圖12 無(wú)節(jié)幼體

圖13 未受精卵

圖14 性腺Ⅴ期

圖15 性腺Ⅰ期圖

圖16 交配后納精囊

圖17 卵子

2.1.3 肢芽期

原腸胚繼續(xù)發(fā)育，在其腹面兩側(cè)凸起3對(duì)芽突（圖9），胚胎發(fā)育進(jìn)入肢芽期。芽突繼續(xù)發(fā)育形成3對(duì)附肢，第2、3對(duì)附肢又分成雙肢。在該期可清楚看到包裹胚胎的第3層膜出現(xiàn)，即內(nèi)膜。肢芽期發(fā)育的時(shí)間約6h。

2.1.4 膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期

胚胎的3對(duì)附肢末端出現(xiàn)刺狀剛毛(圖10、11)，逐漸長(zhǎng)長(zhǎng)，數(shù)量增加，腹部中央出現(xiàn)了1個(gè)棕色眼點(diǎn)。在膜內(nèi)幼體前期，幼體不能抖動(dòng)，隨著發(fā)育進(jìn)行，幼體開(kāi)始抖動(dòng)，頻率加大，幼體以尾刺刺破內(nèi)膜和外膜而出，形成無(wú)節(jié)幼體（圖12）。膜內(nèi)幼體發(fā)育時(shí)間約3h。

2.2 溫度對(duì)日本囊對(duì)蝦胚胎發(fā)育的影響

對(duì)照組孵出所需時(shí)間為（15.50±0.23）h，實(shí)驗(yàn)組孵化時(shí)間（12.33±0.44）h， 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組平均孵化所需時(shí)間比對(duì)照組快（3.17±0.21）h，統(tǒng)計(jì)分析表明存在差異顯著（P＜0.05）。研究結(jié)果表明在適宜溫度范圍內(nèi)，隨著水溫升高，受精卵孵化速率加快。

2.3 鹽度對(duì)日本囊對(duì)蝦胚胎發(fā)育的影響

表1 鹽度對(duì)日本囊對(duì)蝦胚胎發(fā)育的影響

鹽度對(duì)胚胎發(fā)育影響如表1所示，在鹽度為24.53‰～31.65‰時(shí)，孵化率高達(dá)85%以上，鹽度底于15.02‰或者高于40.04‰均不能正常孵化，觀察發(fā)現(xiàn)19.20‰組孵出少量無(wú)節(jié)幼體均不正常，幼體沉于底部，不能游動(dòng)，活力很差；鹽度15.02‰則不能孵出無(wú)節(jié)幼體，大部分停留在囊胚期，少數(shù)發(fā)育到肢芽期；鹽度40.04‰同樣不能孵出無(wú)節(jié)幼體，受精卵入水后很快發(fā)育便停止；而鹽度對(duì)孵化時(shí)間的影響不顯著。

3.結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)少量發(fā)育異常的受精卵，可能是由于機(jī)械操作受傷或卵過(guò)于集中缺氧導(dǎo)致受精卵膜破裂，發(fā)育停止在多細(xì)胞期、肢芽期、膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期等階段。另外日本囊對(duì)蝦未受精卵同樣可以進(jìn)行卵裂，但分裂球模糊不均等，形狀差異明顯，且到達(dá)相同分裂期所需的時(shí)間比受精卵延遲很多，正常細(xì)胞分裂到2幼體期需要25min，而未受精卵1.5h左右，通常未受精卵分裂2次后即停止發(fā)育，因此卵子能否進(jìn)行均等分裂是確定卵子是否受精的重要標(biāo)準(zhǔn)，在受精卵孵化過(guò)程中，要定時(shí)攪動(dòng)水體，讓底層的受精卵浮于水中，以防缺氧死亡。

溫度對(duì)日本囊對(duì)蝦受精卵的孵化率均有顯著影響，幼體出膜時(shí)間與水溫之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，已有較多的報(bào)道，宋盛憲等人以野生捕獲的日本囊對(duì)蝦為材料，觀察胚胎發(fā)育過(guò)程，結(jié)果得到32℃和20℃分別為孵化時(shí)的溫度上限和溫度下限，在適宜溫度范圍內(nèi)，水溫與孵化時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；黃明哲等人研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對(duì)蝦28℃時(shí)的孵化時(shí)間比27.5℃時(shí)快66min；施流章研究溫度、鹽度對(duì)長(zhǎng)毛對(duì)蝦卵的孵化的影響，結(jié)果表明孵化期與水溫有密切關(guān)系，不論在何種鹽度組內(nèi)（28±0.5）℃均比（24±0.5）℃孵化快。本研究結(jié)果得到（26±0.36）℃時(shí)的孵化時(shí)間比30℃時(shí)孵化時(shí)間慢（3.17±0.21）h，研究結(jié)果與以上一致，日本囊對(duì)蝦屬變溫動(dòng)物，水溫高低決定新陳代謝的強(qiáng)弱，同樣，胚胎發(fā)育速率也受溫度影響較大。鹽度主要影響受精孵的孵化率，而對(duì)孵化速率無(wú)顯著影響，本研究中結(jié)果中得到適宜的孵化鹽度范圍為24.53‰～31.65‰，低于或高于某一臨界值都導(dǎo)致受精孵不能孵化，24.53‰、31.65‰孵化時(shí)間均在15h左右，說(shuō)明在適宜鹽度范圍內(nèi)，胚胎發(fā)育速率無(wú)明顯影響，日本囊對(duì)蝦受精卵的孵化過(guò)程對(duì)鹽度要求較為嚴(yán)格，鹽度高低直接影響胚胎的滲透壓調(diào)節(jié)。綜合溫度與鹽度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到：溫度與發(fā)育時(shí)間的關(guān)系大于鹽度與發(fā)育時(shí)間的關(guān)系，影響胚胎發(fā)育速率快慢的主要因素是溫度，而不是鹽度；超出正常值的鹽度孵化范圍，高鹽度對(duì)胚胎的發(fā)育更加不利于低鹽度，與其它蝦類相比，中國(guó)對(duì)蝦胚胎發(fā)育的鹽度適宜范圍為23.82‰～36.87‰，孵化率為70%～90%，顯然日本囊對(duì)蝦的孵化鹽度范圍比較窄，因此，就廠家而言，親蝦孵化期間應(yīng)密切注意海水鹽度的變化，避免造成損失。