鐘 方 麗， 王 文 姣,2， 王 曉 林， 羅 亞 宏

( 1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院, 吉林 吉林 132022；2.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 吉林 長春 130012 )

錦燈籠宿萼總黃酮體外抗氧化活性

鐘 方 麗1， 王 文 姣1,2， 王 曉 林1， 羅 亞 宏1

( 1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院, 吉林 吉林 132022；2.吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 吉林 長春 130012 )

錦燈籠宿萼；總黃酮；抗氧化

0 引 言

錦燈籠又名紅姑娘、燈籠果，為酸漿(PhysalisalkekengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼[1]，是一種優(yōu)良的耐寒綠化植物，果實(shí)可食用，果實(shí)的果紅素還可用作食品著色劑。研究表明，錦燈籠宿萼提取物具有降血糖、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[2-3]。其中黃酮類化合物是錦燈籠主要的功效成分之一[4-5]，很多由植物提取的黃酮提取物都具有較好的抗氧化活性及對(duì)自由基的清除能力，是目前抗氧劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[9-10]。人體存在過量的自由基，會(huì)誘發(fā)各種慢性疾病[11]。黃酮類化合物具有較強(qiáng)的自由基清除能力，為了預(yù)防和控制過量自由基對(duì)人體帶來的不利影響，天然抗氧劑黃酮類化合物成為研究熱點(diǎn)之一[12]。錦燈籠宿萼為食藥兩用型中藥材，黃酮為其活性成分之一，本實(shí)驗(yàn)探索了錦燈籠宿萼總黃酮提取液對(duì)各種自由基及亞硝酸鹽的清除活性，并考察了其對(duì)Fe3+的還原能力，為錦燈籠宿萼的進(jìn)一步應(yīng)用提供了相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

錦燈籠宿萼，蘆丁對(duì)照品，鹽酸萘乙二胺，三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，鄰二氮菲(1,10-鄰二氮雜菲)，鐵氰化鉀，二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)，其他均為分析純，水為重蒸餾水。

1.2 方 法

1.2.1 線性范圍的確定

精確稱取恒重的蘆丁對(duì)照品10.5 mg，配制成0.21 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精確移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL對(duì)照品溶液，分別置于6個(gè)50 mL容量瓶中，按照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出回歸方程及其線性范圍。

1.2.2 總黃酮提取液的制備及含量測定

精確稱取適量粉碎的錦燈籠宿萼，按照液料比8∶1(mL/g)加入提取溶劑80%的乙醇水溶液，回流提取2次，每次3 h，過濾，合并濾液，濃縮至50 mL容量瓶中，定容，制備錦燈籠宿萼總黃酮提取液。測定吸光度，計(jì)算提取液中總黃酮的含量。

1.2.3 總黃酮提取液的體外抗氧化活性

1.2.3.1 DPPH·清除率的測定

稱取適量錦燈籠宿萼總黃酮提取液，加入50%乙醇水溶液，分別配制成總黃酮質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的樣品溶液。分別取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，測定517 nm處的吸光度。

稱取適量維生素C，分別配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的對(duì)照溶液，測定517 nm處的吸光度。計(jì)算樣品溶液、維生素C對(duì)照溶液對(duì)DPPH·的清除率[14]。

DPPH·清除率=[(A0-A1+A2)/A0]×100%

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度，A1為樣品溶液的吸光度，A2為對(duì)照溶液的吸光度。

1.2.3.2 ·OH 清除率的測定

分別吸取1.0 mL “1.2.3.1”的不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，測定536 nm處吸光度。

稱取維生素C適量，配制成對(duì)照溶液，質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。計(jì)算樣品溶液、維生素C對(duì)照溶液對(duì)·OH的清除率[15]。

·OH清除率=(A′0-A′1)/(A′2-A′1)×100%

式中：A′0為供試液與鄰二氮菲、硫酸亞鐵、H2O2混合液反應(yīng)后的吸光度；A′1為蒸餾水代替供試液與鄰二氮菲、硫酸亞鐵、H2O2混合液反應(yīng)后的吸光度；A′2為蒸餾水代替供試液與鄰二氮菲、硫酸亞鐵混合液反應(yīng)后的吸光度。

稱取適量錦燈籠宿萼總黃酮提取液，加入50%乙醇水溶液，分別配制成總黃酮質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的樣品溶液，在6個(gè)具塞試管中分別放入3.0 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，25 ℃水浴預(yù)熱20 min，分別測定320 nm處吸光度。

式中：Ab為蒸餾水代替供試液與鄰苯三酚溶液反應(yīng)后的吸光度；Ac為供試液與鄰苯三酚溶液反應(yīng)后的吸光度；Ad為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液與供試液反應(yīng)后的吸光度。

1.2.3.4 還原力的測定

供試品若能被鐵氰化鉀氧化，則可以將鐵氰化鉀中的Fe3+還原為Fe2+，從而使溶液顯普魯士藍(lán)色，該溶液在700 nm處有特征吸收，通過該波長下吸光度的高低，可以評(píng)價(jià)供試品還原力的大小，溶液的吸光度越高，說明供試品的還原能力越大。

在6個(gè)具塞試管中分別放入1.0 mL “1.2.3.3”的不同質(zhì)量濃度供試品溶液，按照文獻(xiàn)[17]操作，分別測定A和A′。

稱取維生素C適量，配制成與錦燈籠宿萼總黃酮提取液相同質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液，同樣按文獻(xiàn)[17]操作。計(jì)算供試液、維生素C對(duì)照溶液的還原力。

還原力=A-A′

式中：A為供試液與鐵氰化鉀溶液反應(yīng)后的吸光度；A′為蒸餾水代替供試液與鐵氰化鉀溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.2.3.5 NaNO2清除率的測定

在弱酸性環(huán)境下，NaNO2能夠與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，再與鹽酸萘乙二胺繼續(xù)反應(yīng)，能夠生成在538 nm處有強(qiáng)吸收的紅色絡(luò)合物。在相同反應(yīng)條件下，供試品對(duì)NaNO2的清除能力越大，溶液中NaNO2含量則越低，表明供試品對(duì)NaNO2的清除活性越高。

在6個(gè)具塞試管中分別加入質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的錦燈籠宿萼總黃酮提取液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，按照文獻(xiàn)[16]操作，分別測定A0、Ai、Aj。

精密吸取質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的維生素C溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，按照同樣方法操作。計(jì)算供試液、維生素C對(duì)照溶液對(duì)NaNO2的清除率[16]。

NaNO2清除率=[(Ak-Ai+Aj)/Ak]×100%

式中：Ai為加入供試品溶液的吸光度；Aj為供試品溶液的本底吸光度；Ak為不加供試品溶液的吸光度。

1.2.3.6 ABTS+·清除率的測定

ABTS+·通過氧化劑過氧化作用能夠生成一種在波長734 nm處有較強(qiáng)特征吸收的自由基陽離子。在體系中加入抗氧化劑，體系中的ABTS+·被清除，溶液在734 nm處的吸光度降低，通過與空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，可以說明供試品對(duì)ABTS+·的清除效果，這種方法在天然提取物的抗氧化性研究中應(yīng)用較多。

按照文獻(xiàn)[18]配制ABTS+·基液和工作液。在6個(gè)具塞試管中，分別加入“1.2.3.3”中不同質(zhì)量濃度的總黃酮提取液0.1 mL，按照文獻(xiàn)[18]操作，分別測定Af、Ag。

稱取維生素C適量，配制成與錦燈籠宿萼總黃酮提取液相同質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液，按照同樣方法操作。計(jì)算供試液、維生素C對(duì)照溶液對(duì)ABTS+·的清除率[18]。

ABTS+·清除率=[(Af-Ag)/Af]×100%

式中：Af為ABTS+·工作液的吸光度，Ag為加入供試品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍及提取液中總黃酮質(zhì)量濃度的測定

結(jié)果表明，蘆丁的回歸方程為Y=12.382X+0.010 8，R=0.999 6。其線性范圍為8.40～50.40 μg/mL。錦燈籠宿萼提取液的總黃酮質(zhì)量濃度為0.596 mg/mL。

2.2 總黃酮提取液的體外抗氧化性

2.2.1 DPPH·清除率的測定

由圖1(a)可知，隨著供試品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度的逐漸升高，其對(duì)DPPH·的清除率不斷增加，當(dāng)其總黃酮的質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，清除率可以達(dá)到89.00%。由圖1(b)可知，維生素C溶液對(duì)DPPH·的清除率也隨著其質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)質(zhì)量濃度僅為0.06 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)92.06%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總黃酮提取液對(duì)DPPH·具有一定的清除活性，但其清除能力明顯弱于維生素C對(duì)照溶液。

(a) 總黃酮提取液

(b) VC溶液

圖1 總黃酮提取液和VC溶液對(duì)DPPH·的清除率

Fig.1 The scavenging activities of extraction solution and VCto DPPH·

2.2.2 ·OH清除率的測定

由圖2可知，供試品溶液及維生素C溶液對(duì)·OH的清除率均隨著二者質(zhì)量濃度的升高而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.4 mg/mL時(shí)，供試品溶液的清除率低于維生素C對(duì)照溶液，而當(dāng)二者質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，供試品溶液的清除率明顯高于維生素C對(duì)照溶液，而且其清除率隨質(zhì)量濃度增加而升高的趨勢明顯大于維生素C溶液。當(dāng)二者質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，供試品溶液、維生素C溶液對(duì)·OH的清除率分別為54.20%、41.28%。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL 時(shí)，總黃酮提取液·OH的清除能力強(qiáng)于維生素C溶液。

圖2 總黃酮提取液和VC溶液對(duì)·OH的清除率

圖3 總黃酮提取液和VC溶液對(duì)的清除率

2.2.4 還原力的測定

由圖4可知，供試品溶液及維生素C溶液的還原力均隨著二者質(zhì)量濃度的增加而增大。當(dāng)二者的質(zhì)量濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)，供試品溶液及維生素C溶液的還原力分別為0.938和0.943。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮提取液的還原力與維生素C溶液相當(dāng)。

圖4 總黃酮提取液和VC溶液的還原力

2.2.5 NaNO2清除率的測定

由圖5可以看出，隨著供試品溶液和維生素C溶液用量的增加，其對(duì)NaNO2的清除率均逐漸增加，當(dāng)供試品溶液用量由0.3 mL增加到1.8 mL 時(shí)，其對(duì)NaNO2的清除率由71.39%增加到89.49%，增加趨勢略顯平緩，而維生素C溶液用量由0.3 mL增加到1.8 mL時(shí)，其對(duì)NaNO2的清除率由33.80%增加到95.14%，增加趨勢明顯。當(dāng)二者用量均為1.8 mL時(shí)，供試品溶液、維生素C溶液的清除率分別為89.49%、95.14%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總黃酮提取液、維生素C溶液對(duì)NaNO2均具有一定的清除活性，但由于實(shí)驗(yàn)時(shí)供試品溶液的質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL，而維生素C溶液的質(zhì)量濃度僅為0.05 mg/mL，黃酮提取液對(duì)NaNO2的清除能力明顯低于維生素C溶液。

圖5 總黃酮提取液和VC溶液對(duì)NaNO2的清除率

2.2.6 ABTS+·清除率測定實(shí)驗(yàn)

由圖6可知，供試品溶液及維生素C溶液對(duì)ABTS+·的清除率均隨著二者質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加。當(dāng)二者質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)，供試品溶液對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)94.25%，而維生素C溶液對(duì)ABTS+·的清除率僅為45.13%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液對(duì)ABTS+·具有顯著的清除活性，而且明顯強(qiáng)于維生素C溶液。

圖6 總黃酮提取液和VC溶液對(duì)ABTS+·的清除率

3 結(jié) 論

錦燈籠宿萼總黃酮提取液的體外抗氧化活性隨著總黃酮質(zhì)量濃度的升高而增大。錦燈籠宿萼是食藥兩用的天然植物，其總黃酮提取物可以作為天然抗氧化劑用于保健食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，該研究為錦燈籠宿萼的進(jìn)一步綜合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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AntioxidantabilitiesoftotalflavonoidsinvitroinpersistentcalyxofClayxseuFructusPhysalis

ZHONGFangli1,WANGWenjiao1,2,WANGXiaolin1,LUOYahong1

( 1.SchoolofChemistryandPharmaceuticalEngineering,JilinInstituteofChemicalTechnology,Jilin132022,China；2.SchoolofChemistry,JilinUniversity,Changchun130012,China)

persistent calyx ofClayxseuFructusPhysalis; total flavonoids; antioxidant ability

鐘方麗,王文姣,王曉林,羅亞宏.錦燈籠宿萼總黃酮體外抗氧化活性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(6):397-401.

ZHONG Fangli,WANG Wenjiao, WANG Xiaolin, LUO Yahong. Antioxidant abilities of total flavonoidsinvitroin Persistent calyx ofClayxseuFructusPhysalis[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6):397-401.

2016-01-06.

吉林省教育廳資助項(xiàng)目(吉教科合字[2014]第355號(hào)).

鐘方麗(1970-),女,教授,E-mail:fanglizhong@sina.com;通信作者：王曉林(1969-),男,教授,E-mail:wangxiaolin69@eyou.com.

TS202.3；R927.2

A

1674-1404(2017)06-0397-05