王波 劉文海

（濰坊工程職業(yè)學(xué)院花卉學(xué)院 山東青州 262500）

春蘭離體再生體系的研究

王波 劉文海

（濰坊工程職業(yè)學(xué)院花卉學(xué)院 山東青州 262500）

以春蘭種子為外植體進行再生體系建立試驗，采用正交試驗方法研究基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素濃度、天然添加物對原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化的影響，篩選出適合快繁各階段的培養(yǎng)體系。研究結(jié)果表明，種子誘導(dǎo)原球莖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球莖增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球莖分化培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

春蘭；種子；原球莖誘導(dǎo)

春蘭，蘭科蘭屬植物，是我國蘭花栽培歷史最為悠久的種類之一。葉帶形，葉態(tài)優(yōu)美；花色以綠色、淡褐黃色居多，花幽香，有重要觀賞價值[1]。由于長期無節(jié)制的亂采濫挖，野生資源已枯竭。目前春蘭常用種子和分株法繁殖，其種子的胚多半不成熟或發(fā)育不全，這樣的種子是比較難以發(fā)芽的；自然的分株方法，繁殖系數(shù)很低[2]，采取組織培養(yǎng)方法可以加快繁殖速度。但組織培養(yǎng)中外植體的選擇尤為重要，采用莖尖、側(cè)芽等器官對母株傷害較大，并且芽容易褐化難以啟動，而采用種子為外植體可避免母株的損傷，對保護珍稀春蘭資源具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

購于山東綠圣蘭業(yè)花卉科技有限公司，經(jīng)人工授粉后，取其種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

取健壯植株上生長7～9個月未開裂的蒴果，自來水沖洗30min，超凈臺中75%酒精消毒5min，再用0.1%升汞溶液消毒10min，無菌水沖洗。于超凈臺上剖開蒴果，取種子備用。

1.2.2 種子預(yù)處理

根據(jù)黃磊方法[3]，種子萌發(fā)階段采用10%NaClO溶液處理20min。

1.2.3 種子萌發(fā)與原球莖誘導(dǎo)

采用三因素三水平正交試驗設(shè)計確定最佳培養(yǎng)基和激素組合（表1）。將預(yù)處理的種子接種到不同的培養(yǎng)基中，每個蒴果接種3瓶，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)15周后以原球莖誘導(dǎo)數(shù)量作為觀察指標(biāo)。培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基+NAA+6-BA+蔗糖30g/L+瓊脂 7.5g/L+活性炭 2.0g/L，PH5.5。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照強度2000lx，時間12h/d。

表1 L9（33）正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.4 原球莖的增殖

將上述試驗條件下生長良好的原球莖，用無菌鑷子掰成大小均勻的小塊，接種于不同激素和天然添加物配比的培養(yǎng)基中（表2），每個處理接種5個。接種后置于25℃，光照12h/d，光照強度2000lx條件下培養(yǎng)，60d后調(diào)查其增殖情況，統(tǒng)計新增殖的原球莖總數(shù)。

表2 原球莖增殖培養(yǎng)基正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.5 原球莖的分化

取生長健壯、大小均勻的原球莖接種到添加不同激素和天然添加物配比的分化培養(yǎng)基中（表3），每個處理集中10個。接種后置于25℃，光照12h/d，光照強度2000lx條件下培養(yǎng)，60d后調(diào)查其分化情況，統(tǒng)計原球莖分化出芽的總數(shù)。

表3 原球莖分化培養(yǎng)基正交試驗因素水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)與原球莖誘導(dǎo)

將經(jīng)過10%NaClO溶液處理后的種子接種到不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和激素配比中，培養(yǎng)15周后統(tǒng)計誘導(dǎo)率，試驗結(jié)果表明（表4），不同處理之間誘導(dǎo)率出現(xiàn)明顯差異，極差分析表在所設(shè)置的3個因素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、NAA、6-BA，NAA對原球莖的誘導(dǎo)率影響較大，其次為6-BA和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。綜合分析極差結(jié)果，該試驗最佳培養(yǎng)基配比為1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

2.2 原球莖增殖培養(yǎng)

將生長良好的原球莖接種到不同的增殖培養(yǎng)基中。以NAA、6-BA、椰乳為因素設(shè)置試驗。原球莖培養(yǎng)10d后開始出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，新增原球莖黃綠色。9組試驗原球莖的增殖倍數(shù)出現(xiàn)差異（表5），極差分析表明所設(shè)置的3個因素基中NAA和6-BA對原球莖的增殖影響較大，其次為天然添加物。綜合分析極差結(jié)果，該試驗最佳培養(yǎng)基配比為1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

表4 原球莖誘導(dǎo)試驗結(jié)果分析

表5 原球莖增殖試驗結(jié)果分析

2.3 原球莖分化培養(yǎng)條件

將生長一致且健壯的原球莖接種到不同的分化培養(yǎng)基中。以NAA、6-BA、KT、椰乳為因素設(shè)置試驗。9組試驗原球莖的分化率出現(xiàn)較大差異（表6），試驗組5原球莖分化率最高。極差分析表明NAA、6-BA、KT、椰乳四個因素對試驗結(jié)果的順序為NAA＞KT＞6-BA＞椰乳。原球莖分化最佳培養(yǎng)基配比為1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

3 結(jié)論

鑒于自然條件下，春蘭分株繁殖效率低，種子難以萌發(fā)的技術(shù)難題，本研究綜合春蘭組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)、增殖、分化階段，以種子為外植體初步建立了春蘭組織培養(yǎng)繁殖體系。研究結(jié)果表明，種子誘導(dǎo)原球莖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球莖增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球莖分化培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+瓊脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

表6 原球莖分化試驗結(jié)果分析

[1]丁永康.中國蘭花[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2008，8.

[2]劉道敏，榮維國，郝睿.國蘭“綠蕙紅舌”的組織培養(yǎng)技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，39（4）：656～659.

[3]黃 磊.春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J].種子，2003（6）：40～41.

S642.5

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1005-7897（2017）22-0009-02

2017-9-6