周伯如，戴佳軒，徐建亞，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023)

排卵后給予米非司酮對(duì)雌性大鼠動(dòng)情周期、黃體功能的影響及意義

周伯如，戴佳軒，徐建亞，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023)

目的探討排卵后給予米非司酮對(duì)雌性大鼠動(dòng)情周期、黃體功能的影響及其意義。方法選擇具有規(guī)律周期性變化、動(dòng)情周期為4天的雌性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、單周期組、兩周期組及三周期組，每組10只。單周期組、兩周期組及三周期組分別于排卵后灌胃給予米非司酮1 mL/100 g，分別用藥1、2、3個(gè)周期；空白組灌胃給予等體積生理鹽水。記錄各組給藥前后動(dòng)情后期及動(dòng)情周期的持續(xù)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂的大鼠數(shù)量。末次給藥后第2天(給藥后D2)及給藥后進(jìn)入下一動(dòng)情周期的第2天(下一周期D2)采用放射免疫分析法檢測血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，處死后計(jì)數(shù)卵巢組織中生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測子宮組織雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)mRNA表達(dá)。結(jié)果空白組、單周期組動(dòng)情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂。各組給藥前后動(dòng)情周期持續(xù)時(shí)間無明顯變化(P均>0.05)；兩周期組、三周期組動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間均明顯短于給藥前及空白組、單周期組給藥后(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組給藥后D2、下一周期D2血清E2均高于空白組，且三周期組升高更明顯(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組給藥后D2血清FSH均低于空白組，LH均高于空白組(P均<0.05)。兩周期組、三周期組下一周期D2血清FSH均低于空白組與單周期組，血清LH均高于空白組與單周期組(P均<0.05)。各組給藥后D2、下一周期D2血清P水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。單周期組、兩周期組及三周期組閉鎖卵泡數(shù)均多于空白組，黃體數(shù)、生長卵泡數(shù)均少于空白組(P均<0.05)。兩周期組與三周期組生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)及閉鎖卵泡數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織ER mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，且兩周期組、三周期組升高更明顯(P均<0.05)。單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織PR mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，且三周期組升高更明顯(P均<0.05)。結(jié)論雌性大鼠排卵后給予兩個(gè)周期米非司酮可通過提高子宮組織PR基因表達(dá)而縮短其動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間并導(dǎo)致黃體功能不全，可用于建立有效、穩(wěn)定的黃體功能不全大鼠模型。

黃體功能不全；米非司酮；多周期排卵；動(dòng)情周期；大鼠

米非司酮為高效孕激素拮抗劑，多用于排卵后避孕及早期妊娠的藥物流產(chǎn)。女性排卵后單次使用米非司酮不會(huì)對(duì)月經(jīng)正常規(guī)律造成影響[1]，但其生殖內(nèi)分泌水平已發(fā)生變化，可出現(xiàn)黃體功能不全(LPD)等表現(xiàn)[2]。近年來，米非司酮亦被諸多學(xué)者用于構(gòu)建LPD動(dòng)物模型[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，單次排卵后給予米非司酮可使雌性SD大鼠出現(xiàn)LPD的病理學(xué)特征與生殖內(nèi)分泌變化，但存在造模后有效時(shí)間較短、給藥時(shí)間限制較大等缺點(diǎn)[4]。2016年7～8月，本研究觀察了多周期排卵后給予米非司酮對(duì)雌性大鼠動(dòng)情周期及黃體功能的影響，旨在為建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：SPF級(jí)雌性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，室內(nèi)溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h明暗交替，自由攝食、飲水。藥物：米非司酮片(25 mg/片)購于上海新華聯(lián)制藥有限公司，充分研磨后配置成濃度為1 mg/mL的均一混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆茫o藥前復(fù)溫至25～28 ℃。主要試劑：雌二醇(E2)、孕酮(P)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)放射免疫試劑盒購于北京華英生物技術(shù)研究所，RNAiso Plus提取液、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購于日本Takara公司。主要儀器：r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀購于中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司，蛋白核酸分析儀購于德國Eppendorf公司，QuantStudio7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購于美國Thermo公司。

1.2 動(dòng)物分組與干預(yù) 雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日8:00、15:00、21:00進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片(以下稱陰道涂片)，置于倒置生物顯微鏡下觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞形態(tài)，以明確大鼠動(dòng)情周期變化。篩選陰道涂片具有規(guī)律周期性變化、動(dòng)情周期為4天的雌性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、單周期組、兩周期組及三周期，每組10只。各組每日8:00進(jìn)行陰道涂片，發(fā)現(xiàn)典型動(dòng)情期表現(xiàn)的時(shí)間即記為D1。按照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》中的方法進(jìn)行劑量換算，單周期組、兩周期組及三周期組D1上午9:00～11:00灌胃給予米非司酮1 mL/100 g，空白組灌胃給予生理鹽水1 mL/100 g。單周期組僅在第1個(gè)動(dòng)情周期的D1給予米非司酮，兩周期組與三周期組參照上法分別給藥2、3個(gè)動(dòng)情周期。

1.3 動(dòng)情周期檢測 各組大鼠給藥前及給藥后每日進(jìn)行陰道涂片，參照楊麗娟等[4]的方法記錄大鼠完整動(dòng)情周期及動(dòng)情后期的持續(xù)時(shí)間。

1.4 血清E2、P、FSH、LH水平檢測 采用放射免疫分析法。末次給藥后第2天(記為給藥后D2)及給藥后進(jìn)入下一動(dòng)情周期的第2天(記為下一周期D2)14:00～16:00(相當(dāng)于人的黃體中期)，各組大鼠于眼底靜脈叢取血0.5～1 mL，常溫靜置1～2 h，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用放射免疫分析法檢測血清E2、P、FSH、LH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 各組血清E2、P、FSH、LH水平檢測完成后，給予10%水合氯醛按0.35 mL/100 g行腹腔麻醉，斷頭處死后迅速取出子宮、卵巢組織。解剖顯微鏡下觀察、分離輸卵管等多余組織，濾紙吸凈血液。各組隨機(jī)選擇3只大鼠的子宮、卵巢組織(其余組織-80 ℃凍存)，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、5 μm厚切片。常規(guī)行HE染色，奧林巴斯BX40光學(xué)顯微鏡下觀察子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)改變，采用體視學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)隨機(jī)各選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)卵巢組織中的生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)，取平均值。

1.6 子宮組織雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組凍存的子宮組織，按照RNAiso Plus提取試劑盒說明書采用常規(guī)一步法提取子宮組織總RNA，測定RNA樣品含量及純度合格，使用SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒對(duì)cDNA樣本進(jìn)行處理，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。大鼠ER、PR及內(nèi)參GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)完成。ER引物序列：上游引物：5′-CGACTATGCCTCTGGCTACC-3′，下游引物：5′-CGATGGTGCATTGGTTTGTA-3′，引物長度：122 bp。PR引物序列：上游引物：5′-CTGCTCTTCTCTCGGTCCTG-3′，下游引物：5′-CTGGGATTTCTGCTTCTTCG-3′，引物長度：131 bp。GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′，下游引物：5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′，引物長度：77 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃擴(kuò)增34 s，40個(gè)循環(huán)。各樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用QuantStudio7 Flex系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)情周期及動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間比較 空白組、單周期組動(dòng)情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)動(dòng)情周期規(guī)律性變化消失(表現(xiàn)為持續(xù)性動(dòng)情間期)。各組給藥前后動(dòng)情周期及動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間比較見表1。

表1 各組給藥前后動(dòng)情周期、動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間比較

注：與同組給藥前比較，*P<0.05；與空白組給藥后比較，#P<0.05；與單周期組給藥后比較，△P<0.05。

2.2 各組血清E2、P、FSH、LH水平比較 見表2。

2.3 各組子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果：①子宮：空白組子宮固有層組織疏松，子宮腺體多，間質(zhì)血管豐富，單周期組、兩周期組、三周期組子宮內(nèi)膜層明顯菲薄，腺體數(shù)減少，腺腔偏小，間質(zhì)膠原纖維增多，以三周期組變化更明顯。②卵巢：空白組生長卵泡數(shù)量較多，黃體發(fā)育好，體積大，顆粒細(xì)胞層較厚；單周期組、兩周期組、三周期組卵巢內(nèi)閉鎖卵泡數(shù)量增多，顆粒細(xì)胞排列松散，卵母細(xì)胞放射冠減少或消失。各組卵巢組織生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)量比較見表3。

表2 各組給藥前后血清E2、P、FSH、LH水平比較

注：與同組給藥后D2比較，*P<0.05；與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與單周期組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與兩周期組同時(shí)間點(diǎn)比較，▲P<0.05。

表3 各組卵巢組織生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡數(shù)量比較(個(gè)

注：與空白組比較，#P<0.05；與單周期組比較，△P<0.05。

2.4 各組子宮組織ER、PR mRNA表達(dá)比較 見表4。

表4 各組子宮組織ER、PR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與單周期組比較，△P<0.05；與兩周期組比較，▲P<0.05。

3 討論

研究證實(shí)，米非司酮競爭性拮抗P與其受體結(jié)合，其受體親和力是P的4～5倍，能夠顯著抑制P的正常生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)卵泡發(fā)育、排卵期LH峰形成以及黃體功能具有抑制作用[5,6]。女性在非孕黃體期一次口服100 mg米非司酮可于1 h內(nèi)達(dá)到血藥濃度峰值，消除半衰期為12～24 h，100～800 mg并無明顯的血藥濃度差異，不易產(chǎn)生蓄積效應(yīng)[7,8]。由于米非司酮可造成LPD的發(fā)生，因此近年來多被應(yīng)用于LPD動(dòng)物模型的構(gòu)建。目前常用的造模方案主要有兩種：①根據(jù)雌性大鼠妊娠第5天受精卵著床這一特點(diǎn)，在其著床前2～3天使用米非司酮，拮抗孕激素，使其子宮內(nèi)膜容受性受損以致受精卵無法著床，達(dá)到模擬LPD的目的[9]；②對(duì)未受孕大鼠連續(xù)使用米非司酮，造成生殖內(nèi)分泌水平紊亂，出現(xiàn)卵泡發(fā)育障礙，進(jìn)而影響黃體功能[10]。米非司酮雖然滿足了LPD相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需求，但隨著研究的深入，以上兩種方案均出現(xiàn)了一定的局限性：第一種方案雖能模擬妊娠期黃體功能異常，但臨床上絕大多數(shù)患者就診時(shí)并未妊娠，其黃體分泌水平與妊娠期有所區(qū)別，不能更好地模擬臨床；第二種方案則因連續(xù)使用米非司酮可抑制大鼠排卵，造成動(dòng)情周期紊亂，導(dǎo)致造模失敗。

研究表明，正常大鼠的動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期、動(dòng)情前期平均時(shí)長分別為14、18、60、12 h，其動(dòng)情期末段與動(dòng)情后期相當(dāng)于人的黃體中前期，在動(dòng)情間期中前段黃體萎縮，而下一周期的卵泡發(fā)育從動(dòng)情間期前段即開始。雌性SD大鼠的動(dòng)情期一般于晚間22時(shí)至次日1時(shí)出現(xiàn)，排卵發(fā)生于動(dòng)情期出現(xiàn)后的6～8 h[11]。本課題組雖未在夜間對(duì)大鼠陰道涂片進(jìn)行觀察(夜間操作有導(dǎo)致大鼠正常節(jié)律紊亂的不利影響)，但所有在前一日陰道涂片表現(xiàn)為動(dòng)情前期的大鼠，均于次日8:00出現(xiàn)典型動(dòng)情期特征。大鼠動(dòng)情期的陰道涂片可見大量脫落堆疊角化細(xì)胞，此時(shí)比較容易判斷。因此，我們認(rèn)為對(duì)于LPD大鼠模型，在上午8:00陰道涂片發(fā)現(xiàn)動(dòng)情期后2 h內(nèi)使用米非司酮，既能在黃體形成后對(duì)其功能產(chǎn)生影響，又可減小對(duì)卵泡發(fā)育與排卵產(chǎn)生的直接影響，是較為可靠且便捷的用藥方式。本研究結(jié)果顯示，給予米非司酮可導(dǎo)致大鼠動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間縮短，其中以兩周期組、三周期組變化更明顯。但LPD的前提是有卵泡發(fā)育及排卵(排卵后形成黃體)，因此動(dòng)情周期規(guī)律性變化消失(表現(xiàn)為長時(shí)間動(dòng)情間期)的大鼠并不符合實(shí)驗(yàn)要求。本研究結(jié)果顯示，空白組、單周期組動(dòng)情周期均保持規(guī)律性，兩周期組、三周期組中分別有1只(10%)、5只(50%)動(dòng)情周期規(guī)律性變化消失。以上結(jié)果提示，給予兩周期米非司酮更符合構(gòu)建LPD大鼠模型的要求。

研究顯示，子宮ER、PR在月經(jīng)周期中具有規(guī)律性變化，其在黃體前、中期的降調(diào)是子宮內(nèi)膜容受性建立的主要標(biāo)志之一，可反映黃體功能[12,13]。本研究結(jié)果顯示，單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織ER mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，且兩周期組、三周期組升高更明顯；單周期組、兩周期組、三周期組子宮組織PR mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的LPD變化特征一致[12]。研究表明，米非司酮可抑制FSH的合成與分泌，其機(jī)制可能與外周循環(huán)中瘦素水平降低有關(guān)，瘦素減少可導(dǎo)致雌激素水平升高，引起促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌，導(dǎo)致LH分泌增加[14,15]。以往認(rèn)為血清LH水平偏低是LPD的特征之一，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LPD患者黃體期血清LH水平并不一定偏低，F(xiàn)SH/LH可能是影響卵巢分泌功能的重要因素。FSH/LH過高可出現(xiàn)卵巢儲(chǔ)備功能下降、卵巢早衰的表現(xiàn)；FSH/LH過低可導(dǎo)致卵巢反應(yīng)性下降，雌孕激素分泌異常，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性低下，還可引起下一周期卵泡發(fā)育障礙、小卵泡排卵，從而導(dǎo)致下一周期黃體發(fā)育不良，連續(xù)出現(xiàn)LPD[16]。本研究結(jié)果顯示，兩周期組、三周期組下一周期D2血清FSH水平均低于空白組與單周期組，血清LH水平均高于空白組與單周期組，與上述結(jié)論基本一致。其原因可能與下丘腦GnRH分泌的脈沖變化密切相關(guān)[17,18]，而調(diào)節(jié)GnRH分泌的機(jī)制則較為復(fù)雜，仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，雌性大鼠排卵后給予兩個(gè)周期米非司酮可導(dǎo)致其動(dòng)情后期持續(xù)時(shí)間縮短及黃體功能不全，有助于建立有效、穩(wěn)定的黃體功能不全大鼠模型。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473713)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141463)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX15_0991)；中國和歐洲醫(yī)療保健發(fā)展合作研究計(jì)劃(CHETCH)。

周惠芳(E-mail： zhouhuifang201301@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.009

R714.21

A

1002-266X(2017)44-0032-04

2017-01-20)