張佳嬋，王昌濤,2,*，劉 瑤，石秀芹，趙 丹，李 萌，王成濤，孫寶國(guó)

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料工程研究中心，北京 100048）

沙棘粕醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗衰老功效及其機(jī)制

張佳嬋1，王昌濤1,2,*，劉 瑤1，石秀芹1，趙 丹1，李 萌1，王成濤2,3，孫寶國(guó)2,3

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料工程研究中心，北京 100048）

以沙棘粕為研究對(duì)象，經(jīng)乙醇提取、大孔吸附樹脂純化獲得沙棘粕醇提取物（sea buckthorn seed extracts，SBSE）。以秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究SBSE的抗衰老作用及其可能機(jī)制。本研究考察了不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲生命周期、生殖能力和應(yīng)激抵御能力的影響，探索了SBSE對(duì)線蟲抗氧化酶活力以及衰老相關(guān)基因表達(dá)水平的作用，從基因水平探索SBSE的抗衰老可能機(jī)制。結(jié)果：SBSE可以顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的存活時(shí)間（p＜0.05），減輕脂褐素水平的積累；0.05 mg/mL SBSE處理后秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量為（246.40±21.11）個(gè)，顯著高于空白對(duì)照組的（205.80±20.42）個(gè)（p＜0.05）；對(duì)熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激有顯著的防御效果（p＜0.05）；此外，SBSE提高了秀麗隱桿線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力，降低了秀麗隱桿線蟲促衰老基因age-1、daf-2的表達(dá)水平，提高了抗衰老基因sir-2.1的表達(dá)。該結(jié)果表明SBSE或許通過提高抗氧化酶活力以及改變衰老相關(guān)基因的表達(dá)水平來發(fā)揮抗衰老的功效。

沙棘粕醇提取物；秀麗隱桿線蟲；抗氧化酶；抗衰老

衰老是生命過程的必然規(guī)律，是指機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生退行性變化的過程[1]。自由基學(xué)說是目前解釋衰老的重要學(xué)說之一。近年來人們專注于對(duì)抗衰老活性成分效果及作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物、黃芪提取物、人參提取物等能直接清除自由基、提高抗氧化酶的活力以及降低丙二醛（malondialdehyde，M D A）的含量，發(fā)揮抗衰老的作用[2-4]。沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是我國(guó)西部生態(tài)治理的優(yōu)選植物，其果、葉、籽中均含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，目前已有研究證實(shí)了沙棘果汁、果油、果渣以及葉提取物在抗衰老方面的卓越功效[5-6]。

沙棘粕是沙棘籽經(jīng)過脫油處理后的副產(chǎn)物，含有較多纖維素、半纖維素等物質(zhì)，一般作為飼料或廢棄物丟棄，造成資源的浪費(fèi)[7]。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，沙棘粕中仍含有豐富的黃酮、多酚、原花青素等物質(zhì)[8-11]，具有顯著的抗菌、抗氧化功效。但是相關(guān)研究?jī)?nèi)容多集中在對(duì)其成分定性定量分析以及化學(xué)水平功效的評(píng)價(jià)方面，鮮有研究將其應(yīng)用于抗衰老模式生物——秀麗隱桿線蟲，評(píng)價(jià)秀麗隱桿線蟲的抗衰老指標(biāo)。本課題前期摸索也已證實(shí)其在細(xì)胞水平顯著的抗衰老能力。

秀麗隱桿線蟲生命周期短、易飼養(yǎng)、自我繁殖能力強(qiáng)、與人類具有相似的衰老過程，因此越來越多抗衰老方面的研究選擇其作為模式生物[12-15]。有研究證實(shí)了線蟲壽命的長(zhǎng)短與抵御應(yīng)激的能力存在正相關(guān)，增強(qiáng)抵御能力的措施同樣可以延長(zhǎng)線蟲壽命[16-21]。

本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為模式生物，從線蟲生理指標(biāo)（壽命、生殖能力）、抵御應(yīng)激能力（熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激）、體內(nèi)抗氧化酶活力、基因水平4 個(gè)方面研究沙棘粕醇提取物（sea buckthorn seed extracts，SBSE）的抗衰老功效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘粕由青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰咎峁?，均烘干粉碎過篩；大腸埃希菌OP50和野生秀麗隱桿線蟲品系N2均由北京市農(nóng)林科學(xué)院惠贈(zèng)。

蘆丁、原花青素 中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸（均為分析純）北京化工廠；大孔吸附樹脂DM130、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、胰蛋白胨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胡桃醌 天津一方科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；微量樣品總RNA提取試劑盒、FastQuant RT Kit（含gDNase）、SYBR Green 天根生物科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE E100掃描電子顯微鏡 日本Nikon公司；BS2202S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；YJ-2450醫(yī)用超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；SPx-250BF-2生化培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FC Multiskan酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Anke 3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE制備及初步分離

于35 ℃，將80%乙醇與經(jīng)粉碎干燥處理的沙棘粕以8∶1（V/m）的比例混合，提取1.5 h后3 000×g離心15 min，分離上清液，按照相同方法重復(fù)提取2 次，合并上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮粗SBSE。

利用大孔吸附樹脂初步分離提純所得濃縮粗SBSE。DM130樹脂為載體，濕樹脂（20 g）乙醇濕法裝柱（2.0 cm×35 cm）。上樣體積10 mL（15 mg/mL），吸附時(shí)間60 min，解吸液為80%乙醇，解吸時(shí)間為65 min。將解吸液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并于-80 ℃、3 Pa的條件下冷凍干燥48 h，得到SBSE。

取適量SBSE，用少量二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶液溶解，控制DMSO體積分?jǐn)?shù)小于1%，過0.22 μm無菌濾膜獲得SBSE濃縮液，秀麗隱桿線蟲正式實(shí)驗(yàn)前用大腸埃希菌OP50菌液稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

1.3.2 主要活性成分的測(cè)定

將冷凍干燥后SBSE配制成10 mg/mL溶液，用于測(cè)定黃酮、原花青素以及總酚的質(zhì)量濃度。

黃酮含量按照硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定[22]；原花青素含量按照香草醛比色法測(cè)定[23]；總酚含量按照福林試劑還原比色法測(cè)定[22]。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)

[2 4]的方法，配制線蟲基本培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM），每個(gè)NGM平板加入200 μL大腸埃希菌OP50菌液，用玻璃涂布棒涂布均勻，培養(yǎng)皿邊緣留出約0.5 cm為無菌區(qū)，涂布后的培養(yǎng)皿于37 ℃過夜培養(yǎng)。將L3或L4期秀麗隱桿線蟲接種于涂布后的NGM培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察秀麗隱桿線蟲的生長(zhǎng)情況并定期更換培養(yǎng)基。

1.3.4 秀麗隱桿線蟲生命周期實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[24]的方法，實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中，將同期化的L4期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到含有4 種不同質(zhì)量濃度SBSE（在大腸埃希菌OP50菌液中質(zhì)量濃度分別為1.00、0.50、0.10、0.05 mg/mL）培養(yǎng)基中，對(duì)照組則以M9緩沖液代替。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平板約為30 條秀麗隱桿線蟲，置于20 ℃培養(yǎng)，記為實(shí)驗(yàn)的第0天。在秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵期（第1～4天），每天將秀麗隱桿線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)基中。隔天記錄秀麗隱桿線蟲的存活、死亡、刪除數(shù)量，直至所有秀麗隱桿線蟲死亡。

死亡及刪除判斷方法：用接種針刺激秀麗隱桿線蟲，若刺激2 次以上均無反應(yīng)，則可以判斷秀麗隱桿線蟲死亡；若秀麗隱桿線蟲鉆到培養(yǎng)基中、丟失、爬到培養(yǎng)皿壁上干死、生殖道外翻，則應(yīng)被刪除。

1.3.5 秀麗隱桿線蟲急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

分組及處理方法同1.3.4節(jié)。參考文獻(xiàn)[24]方法，每組準(zhǔn)備10 個(gè)平板，每個(gè)平板約30 條秀麗隱桿線蟲。置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)設(shè)為0 h。每隔2～3 h將培養(yǎng)皿取出，記錄秀麗隱桿線蟲的存活、死亡數(shù)量。觀察過后丟棄，以防溫度改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。共進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

死亡及刪除判斷方法同1.3.4節(jié)。

1.3.6 秀麗隱桿線蟲生殖實(shí)驗(yàn)

分組及處理方法同1.3.4節(jié)，但采用同期化L3期秀麗隱桿線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[24]方法，每組設(shè)置10 個(gè)平行，每個(gè)平板1 條秀麗隱桿線蟲，置于20 ℃培養(yǎng)。將秀麗隱桿線蟲開始產(chǎn)卵的當(dāng)天記為第1天，每天將秀麗隱桿線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)皿中，至產(chǎn)卵期結(jié)束，約3～5 d。將所有平板置于20 ℃培養(yǎng)孵化，統(tǒng)計(jì)每條秀麗隱桿線蟲在平板中孵化出線蟲的總數(shù)即為該線蟲的產(chǎn)卵量。共進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

分組方法同1.3.4節(jié)，但采用同期化L3期秀麗隱桿線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[25]方法，每組設(shè)定3 個(gè)平行，每個(gè)平板約40 條秀麗隱桿線蟲。每天將秀麗隱桿線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d后，分別轉(zhuǎn)移到濃度為500 μmol/L的胡桃醌NGM培養(yǎng)基中，每組3 板，每板30 條。每間隔2 h觀察秀麗隱桿線蟲死亡情況并記錄，至所有秀麗隱桿線蟲死亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。倒置熒光顯微鏡觀察秀麗隱桿線蟲脂褐素水平，激發(fā)波長(zhǎng)340～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

1.3.8 抗氧化酶活力測(cè)定

分組方法同1.3.4節(jié)，但采用同期化L3期秀麗隱桿線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)定3 個(gè)平行，每個(gè)平板約40 條秀麗隱桿線蟲。每天將秀麗隱桿線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d后，用M9緩沖液沖洗NGM培養(yǎng)基表面秀麗隱桿線蟲至離心管。生理鹽水洗滌并加入200 μL生理鹽水于液氮中反復(fù)凍融3 次，離心取上清液測(cè)定SOD、CAT和GSH-Px活力及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照SOD、CAT和GSH-Px檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.3.9 抗衰老相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定

分組方法同1.3.4節(jié)，但采用同期化L3期秀麗隱桿線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)定3 個(gè)平行，每個(gè)平板約40 條線蟲。每天將秀麗隱桿線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d后，用M9緩沖液沖洗NGM培養(yǎng)基表面線蟲至離心管。生理鹽水洗滌后放入-80 ℃冰箱備用。依次進(jìn)行線蟲RNA的提取、RNA純度及完整性的鑒定、合成cDNA以及利用半定量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法監(jiān)測(cè)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)相關(guān)抗氧化基因mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所得結(jié)果以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBSE活性成分

表1 SBSE活性成分組成Table 1 Contents of fl avonoids, proanthocyanidins and total phenols in SBSE

表1顯示，SBSE純化前、后均含有豐富的黃酮、原花青素以及總酚。10 mg/mL純化前SBSE中黃酮占3 類物質(zhì)總量的35%以上，原花青素占37.5%，總酚質(zhì)量濃度為（2.51±0.21）mg/mL，占27.5%。SBSE經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，對(duì)原花青素和總酚具有富集作用，原花青素所占比例提升至42%，總酚質(zhì)量濃度增加至（4.71±0.21）mg/mL，與純化前相比差異極顯著（p＜0.01）。

2.2 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

表2 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 2 Effect of SBSE on lifespan of Caenorhaditis elegans

自然壽命是進(jìn)行抗衰老研究分析的首選指標(biāo)。本項(xiàng)目測(cè)定了4 個(gè)質(zhì)量濃度條件下SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響，對(duì)其平均壽命、最長(zhǎng)壽命以及壽命中位數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。SBSE處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長(zhǎng)壽命以及壽命中位數(shù)均高于對(duì)照組。0.05 mg/mL與0.50 mg/mL SBSE組秀麗隱桿線蟲的平均壽命顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），并且0.05～0.50 mg/mL的SBSE組最長(zhǎng)壽命均極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01），0.05、0.10 mg/mL和0.50 mg/mL SBSE組壽命中位數(shù)與對(duì)照組差異極顯著（p＜0.01）或顯著（p＜0.05），說明SBSE可以顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲壽命。但是，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.00 mg/mL時(shí)，秀麗隱桿線蟲平均壽命與壽命中位數(shù)與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），最長(zhǎng)壽命顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），說明高質(zhì)量濃度SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲存活率有一定影響。

圖1 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響Fig. 1 Effect of SBSE on lipofuscin fl uorescent intensity of Caenorhabditis elegans

參照文獻(xiàn)[25]對(duì)線蟲節(jié)點(diǎn)的篩選，以對(duì)照組存活率20%為節(jié)點(diǎn)，收集秀麗隱桿線蟲，熒光倒置顯微鏡觀察脂褐素水平。由圖1（圖中箭頭指示為熒光處）可知，SBSE可以減緩秀麗隱桿線蟲的衰老，延長(zhǎng)平均存活時(shí)間，減少脂褐素的積累。

2.3 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響

表3 各組秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量Table 3 Number of offsprings of Caenorhaditis elegans in each group

正常秀麗隱桿線蟲的子代數(shù)量在200～350 個(gè)，且對(duì)環(huán)境極其敏感。有報(bào)道指出，在很多生物中存在著壽命的延長(zhǎng)要以犧牲生殖為代價(jià)[26]，但也有報(bào)道指出白藜蘆醇[27]、淫羊藿總黃酮[28]可以延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命同時(shí)不影響生殖能力。本研究通過秀麗隱桿線蟲生殖能力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表3），SBSE在延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲壽命的同時(shí)，并沒有對(duì)生殖能力造成影響。0.05 mg/mL SBSE組秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量達(dá)到（246.40±21.11）個(gè)，顯著高于對(duì)照組20%以上（p＜0.05）。且SBSE處理組子代數(shù)量在第2、3天達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比差異極為顯著（p＜0.01）。

2.4 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗急性熱應(yīng)激效應(yīng)的影響

圖2 秀麗隱桿線蟲對(duì)熱應(yīng)激效應(yīng)的生存曲線Fig. 2 Survival curves of Caenorhaditis elegans against heat stress

本研究探討了35 ℃條件下，不同質(zhì)量濃度SBSE干預(yù)秀麗隱桿線蟲抵抗熱應(yīng)激的能力變化。由圖2可知，與對(duì)照組相比，SBSE組秀麗隱桿線蟲生存曲線右移，說明抵抗熱應(yīng)激效應(yīng)的能力均有所增強(qiáng)。

表4 SBSE對(duì)熱應(yīng)激各組秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 4 Effect of SBSE on lifespan of Caenorhaditis elegansin in each group with heat stress

由表4可知，0.05 mg/mL的SBSE組秀麗隱桿線蟲平均生存時(shí)間最長(zhǎng)，比對(duì)照組提高69.48%（p＜0.01），0.10、0.50 mg/mL的SBSE組秀麗隱桿線蟲平均生存時(shí)間也均極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01）。

2.5 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響

衰老是生物體各器官功能開始逐步降低的一種生理現(xiàn)象，是一個(gè)緩慢的漸進(jìn)過程，自由基學(xué)說是目前解釋衰老的重要學(xué)說之一。機(jī)體正常代謝在產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生活性氧副產(chǎn)物，如超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH），活性氧含量過多會(huì)造成機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的失衡，加速衰老[1]。胡桃醌可以誘導(dǎo)線蟲發(fā)生體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生，誘發(fā)線蟲氧化應(yīng)激[29]。

圖3 秀麗隱桿線蟲對(duì)氧化應(yīng)激效應(yīng)的生存曲線Fig. 3 Survival curves of Caenorhaditis elegans against oxidative stress

本實(shí)驗(yàn)選擇胡桃醌作為強(qiáng)氧化劑，構(gòu)建氧化損傷環(huán)境，將SBSE處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至氧化損傷環(huán)境中，通過測(cè)定秀麗隱桿線蟲存活率來檢測(cè)SBSE是否可以幫助機(jī)體抵御氧化損傷。由圖3可知，與胡桃醌對(duì)照組相比，SBSE處理后秀麗隱桿線蟲生存時(shí)間均有所延長(zhǎng)，抵御氧化應(yīng)激的能力普遍提高。

表5 SBSE對(duì)氧化應(yīng)激秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 5 Effect of SBSE on lifespan of Caenorhaditis elegans in each group with oxidative stress

由表5可知，其中0.05、0.10 mg/mL處理后的秀麗隱桿線蟲平均生存時(shí)間極顯著高于胡桃醌對(duì)照組（p＜0.0 1），分別由（4.9 7±0.1 7）h提高到（7.60±0.14）h和（7.16±0.27）h。

圖 4 SBSE對(duì)胡桃醌損傷組秀麗隱桿線蟲脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of SBSE on lipofuscin fl uorescent intensity of Caenorhabditis elegans with juglone-induced oxidative stress

以胡桃醌對(duì)照組存活率20%為節(jié)點(diǎn)，收集線蟲，熒光倒置顯微鏡觀察脂褐素水平，結(jié)果見圖4（圖中箭頭所指處為熒光處）。經(jīng)SBSE處理后，秀麗隱桿線蟲的脂褐素水平明顯降低，由此可見，SBSE可以保護(hù)秀麗隱桿線蟲以抵御氧化應(yīng)激損傷。

2.6 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化酶活力情況的影響

圖5 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲CAT（A）、SOD（B）、GSH-Px（C）活力的影響Fig. 5 Effect of SBSE on CAT (A), SOD (B) and GSH-Px (C) activity of Caenorhabditis elegans

由圖5可知，在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，SBSE均可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活力（p＜0.05）。0.05 mg/mL的SBSE組的CAT活力由（37.80±0.30）U/mg pro顯著提高到（98.33±19.32）U/mg pro（p＜0.05），其他質(zhì)量濃度均極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01），CAT酶活力存在劑量依賴關(guān)系；SBSE組的SOD活力均極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01）；GSH-Px活力在SBSE質(zhì)量濃度低于0.10 mg/mL時(shí)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，當(dāng)SBSE質(zhì)量濃度高于0.10 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比，未發(fā)現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）。

2.7 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲衰老相關(guān)基因表達(dá)情況的影響基因age-1、sir-2.1、sod-3、daf-2等能通過胰島素-類胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（insulin/IGF-1，IIS）調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲壽命[31-34]。其中age-1、daf-2基因進(jìn)入衰老期后表達(dá)量增加，顯示促進(jìn)衰老作用；而sir-2.1、sod-3進(jìn)入衰老期后表達(dá)量下降，顯示延緩衰老的作用。

圖6 SBSE對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化基因age-1（A）、daf-2（B）、sod-3（C）、sir-2.1（D）表達(dá)情況的影響Fig. 6 Effect of SBSE on the expression of age-1(A), daf-2(B), sod-3(C)and sir-2.1(D) in Caenorhabditis elegans

由圖6可知，與對(duì)照組相比，0.05 mg/mL SBSE作用下，促衰老基因age-1表達(dá)量極顯著降低（p＜0.01），1.00 mg/mL SBSE對(duì)age-1的影響不顯著（P＞0.05），與低劑量組0.05 mg/mL相比有極顯著性差異（p＜0.01）；促衰老相關(guān)基因daf-2在SBSE刺激下，表達(dá)水平極顯著降低（p＜0.01），且低劑量組與高劑量組之間有極顯著性差異（p＜0.01）。與對(duì)照組相比抗衰老相關(guān)基因sod-3在SBSE作用下表達(dá)量極顯著降低（p＜0.01），2 個(gè)SBSE組間差異不顯著（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，sir-2.1基因的表達(dá)量顯著上升（p＜0.05），且低劑量組與高劑量組間差異極顯著（p＜0.01）。

3 討 論

衰老以及與衰老相關(guān)的疾病是日趨嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題和社會(huì)問題。Brenner[12]發(fā)現(xiàn)了秀麗隱桿線蟲的遺傳調(diào)控機(jī)制，自此以后，秀麗隱桿線蟲便作為模式生物，廣泛應(yīng)用于抗衰老物質(zhì)的篩選和抗衰老分子機(jī)制的研究中。本實(shí)驗(yàn)以沙棘產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物沙棘粕為研究對(duì)象，依照課題組前期研究條件提取分離純化得到SBSE，以模式生物——秀麗隱桿線蟲為研究載體，探討了SBSE的抗衰老功效及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過初步分析發(fā)現(xiàn)：SBSE純化前、后，均含有黃酮、原花青素以及總酚，其中，大孔吸附樹脂的純化對(duì)原花青素和總酚有富集作用，兩者質(zhì)量濃度與純化前相比具有極顯著差異（p＜0.01）。該結(jié)果為SBSE在秀麗隱桿線蟲抗衰老方面的研究提供了參考依據(jù)。

自然壽命是進(jìn)行抗衰老研究分析的首選指標(biāo)。在有關(guān)天然產(chǎn)物延長(zhǎng)線蟲壽命方面，目前存在2 種不同結(jié)果：一種為某種物質(zhì)只能延長(zhǎng)脅迫條件下線蟲的壽命，而不能延長(zhǎng)非環(huán)境脅迫條件下的線蟲壽命。如綠茶中表沒食子酸只有在熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激環(huán)境中才能延長(zhǎng)線蟲壽命，而在自然條件下則無顯著影響[35]；Chen Wei等[36]在研究白藜蘆醇對(duì)線蟲壽命的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇只能在氧化應(yīng)激環(huán)境下有效延長(zhǎng)線蟲的壽命。另一種結(jié)果為某種物質(zhì)不僅可以延長(zhǎng)脅迫環(huán)境下線蟲的壽命，也可以延長(zhǎng)非環(huán)境脅迫條件下的線蟲壽命。例如，黃酮類化合物淫羊藿苷不僅可延長(zhǎng)自然環(huán)境條件下的線蟲壽命，也可以延長(zhǎng)熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激條件下的線蟲壽命[28]；Wilson等[37]在研究藍(lán)莓多酚時(shí)也發(fā)現(xiàn)其能延長(zhǎng)自然環(huán)境和熱應(yīng)激環(huán)境下線蟲的壽命。本實(shí)驗(yàn)所用樣品SBSE也可歸于后一種結(jié)果：0.05 mg/mL的SBSE提高秀麗隱桿線蟲壽命的效果最顯著；對(duì)胡桃醌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷也具有一定的抵御作用，其中0.05、0.10 mg/mL處理后的線蟲平均生存時(shí)間極顯著提高（p＜0.01）。通過熒光檢測(cè)線蟲脂褐素水平發(fā)現(xiàn)，SBSE處理下自發(fā)熒光減弱，有效降低了脂褐素的積累。

在秀麗隱桿線蟲的研究中，部分科學(xué)家認(rèn)為延長(zhǎng)壽命和生殖均需要資源，而體內(nèi)的資源有限，因此長(zhǎng)壽和生殖能力之間存在“利弊權(quán)衡”[26]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)秀麗隱桿線蟲生理指標(biāo)和生化指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)：SBSE可以顯著提高秀麗隱桿線蟲的自然壽命（p＜0.05），對(duì)其生殖能力也具有顯著促進(jìn)作用（p＜0.05）。與此同時(shí)，淫羊藿提取物[28]、白藜蘆醇[27]等也不僅能延長(zhǎng)線蟲壽命，而且能提高其生殖能力?？梢?，并非本結(jié)果與“利弊權(quán)衡”理論不合，說明該結(jié)果是有一定指導(dǎo)意義的。

IIS是一個(gè)高度保守且最為詳盡的壽命調(diào)控環(huán)節(jié)[32]。在線蟲體內(nèi)，IIS對(duì)于發(fā)育、代謝和衰老的調(diào)節(jié)均起到關(guān)鍵作用，該信號(hào)通路通過控制磷酸化daf-16轉(zhuǎn)移因子來調(diào)控[32-33]。在氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激條件下，daf-16能激活下游因子SOD-3，SOD-3能清除體內(nèi)過多的超氧化物和自由基，減少氧化損傷[33-34]。daf-2是線蟲中表達(dá)的胰島素受體家族的唯一成員，激活daf-16或抑制daf-2是調(diào)節(jié)IIS延緩線蟲衰老的關(guān)鍵[31]。許多被證實(shí)有延長(zhǎng)線蟲壽命作用的植物活性成分或藥物，其抗衰老作用機(jī)制多與該信號(hào)通路密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)daf-16基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，但是對(duì)其下游分子促衰老基因age-1、daf-2和抗衰老基因sir-2.1、sod-3進(jìn)行了考察。SBSE可以極顯著降低age-1、daf-2表達(dá)水平（p＜0.01），顯著提高sir-2.1的表達(dá)（p＜0.05），對(duì)sod-3基因表達(dá)水平有極顯著抑制作用（p＜0.01），但是對(duì)SOD活力有極顯著促進(jìn)作用（p＜0.01），這說明基因轉(zhuǎn)錄水平的變化并不足以反映蛋白翻譯水平以及蛋白活性的變化。該結(jié)果也預(yù)示著SBSE與IIS通路可能有關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)SBSE與IIS通路的可能作用機(jī)制，還需進(jìn)一步以IIS關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變的突變株（如daf-16（mu86）突變株和daf-2（e1370）突變株）為研究載體，進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，SBSE可能是通過IIS調(diào)控秀麗隱桿線蟲抗衰老相關(guān)基因的表達(dá)水平，降低體內(nèi)脂褐素的積累，增加其對(duì)抗急性熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激的抵御能力，使得線蟲壽命顯著延長(zhǎng)（p＜0.05）。

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Anti-Aging Effect and Its Mechanism of Ethanol Extract from Sea Buckthorn Seed Meal in Caenorhabditis elegans

ZHANG Jiachan1, WANG Changtao1,2,*, LIU Yao1, SHI Xiuqin1, ZHAO Dan1, LI Meng1, WANG Chengtao2,3, SUN Baoguo2,3
(1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In the present study, the anti-aging effect of sea buckthorn seed extracts (SBSE) obtained by ethanol extraction and macroporous resin purif i cation was evaluated using Caenorhabditis elegans as a model organism and its underlying mechanism was discussed as well. The effect of different concentrations of SBSE was investigated on the lifespan,reproductive capability, heat and oxidative stress defense of C. elegans. In order to explore the anti-aging mechanism of SBSE at the gene level, the activity of antioxidant enzymes and the expression levels of related genes were determined. The results indicated that SBSE could signif i cantly prolong the lifespan of C. elegans (P ＜ 0.05), and reduce the accumulation of lipofuscin. Meanwhile, the number of C. elegans offsprings treated with 0.05 mg/mL of SBSE (246.40 ± 21.11) was signif i cantly bigger than the control (205.80 ± 20.42) (P ＜ 0.05). SBSE could signif i cantly enhance the heat and oxidative stress defense (P ＜ 0.05). Furthermore, SBSE increased the activity of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase, down-regulated the pro-aging gene expression levels of age-1 and daf-2, and up-regulated the anti-aging gene expression levels of sir-2.1. Therefore, SBSE possess an anti-aging effect by increasing the activity of antioxidant enzymes and changing the expression of aging-related genes.

sea buckthorn seed extracts; Caenorhabditis elegans; antioxidant enzymes; anti-aging

10.7506/spkx1002-6630-201723023

TS201.4

A

1002-6630（2017）23-0141-08

2017-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571801）

張佳嬋（1987—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xiaochan8787@163.com

*通信作者：王昌濤（1975—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘ぁ-mail：wangct@th.btbu.edu.cn

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