李漢榮，黃淑君,2，曾本華，方 祥，王 麗，鐘青萍，童貽剛，魏 泓,*，廖振林,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400；3.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室，重慶 400038；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所，北京 100071）

香蕉抗性淀粉對C57BL/6J肥胖小鼠腸道放線菌群的調(diào)控作用

李漢榮1，黃淑君1,2，曾本華3，方 祥1，王 麗1，鐘青萍1，童貽剛4，魏 泓3,*，廖振林1,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511400；3.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室，重慶 400038；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所，北京 100071）

目的：研究不同劑量香蕉抗性淀粉（resistant starch，RS）對高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J肥胖小鼠腸道放線菌群多樣性的影響。方法：將40 只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為5 組，分別采用普通飼料（CONV）、高脂飼料（HF）以及添加5%、10%、15%香蕉抗性淀粉的高脂飼料（5% RS+HF、10% RS+HF、15% RS+HF）進(jìn)行飲食干預(yù)，8 周后采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)對小鼠糞便樣本放線菌菌群組成進(jìn)行分析，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對小鼠糞便樣本雙歧桿菌數(shù)量進(jìn)行比較。結(jié)果：DGGE圖譜分析顯示，HF組聚類與其余4 組徹底分離，抗性淀粉各組趨于成簇但無明顯界限。5% RS+HF組與15% RS+HF組放線菌多樣性和豐富度方面均顯著低于CONV組與HF組（p＜0.05），10% RS+HF組多樣性和豐富度較另外2 組RS+HF組有所上升。高脂飼料能夠極顯著降低腸道中雙歧桿菌數(shù)量（p＜0.01），而10%和15%香蕉抗性淀粉的加入均高度顯著增加雙歧桿菌數(shù)量（p＜0.001）。結(jié)論：香蕉抗性淀粉可恢復(fù)肥胖小鼠腸道放線菌群多樣性，顯著促進(jìn)雙歧桿菌生長，且具有劑量依賴關(guān)系。

香蕉抗性淀粉；腸道放線菌；變性梯度凝膠電泳

抗性淀粉（resistant starch，RS）分為RS1（物理包埋淀粉）、RS2（抗性淀粉）、RS3（老化淀粉）、RS4（化學(xué)改性淀粉）4 類。RS2又稱生淀粉，存在于生香蕉、馬鈴薯或玉米淀粉中，香蕉抗性淀粉是青香蕉經(jīng)物理方法直接提取的天然原料，有低糖高淀粉、對酶有高度抗性、營養(yǎng)成分不流失等優(yōu)點。香蕉抗性淀粉的凍融穩(wěn)定性與玉米淀粉相當(dāng)，黏度熱穩(wěn)定性、凝沉性均高于馬鈴薯淀粉[1]；另外，香蕉粉色澤、香氣和口味俱佳，不需烹煮，比豆粉或薯粉更適合食品開發(fā)。香蕉作為熱帶水果代表，由于褐變腐爛造成大量經(jīng)濟(jì)損失。香蕉粉在國內(nèi)仍是一種待開發(fā)的保健食品，科學(xué)利用產(chǎn)地豐富香蕉資源進(jìn)行深加工，研發(fā)香蕉粉功能性食品將更具有市場前景。

近年來，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，對人類健康帶來巨大危害的肥胖癥已成為亟待解決的全球性問題[2-3]。盡管人類基因組在決定人體體質(zhì)量方面起到的主要作用毋庸置疑[4]，但在過去25 年里，人們也同樣認(rèn)識到，肥胖癥并不是完全由基因組的改變所決定的[5]。值得注意的是，人類腸道中居住著數(shù)量高達(dá)100萬億的微生物，比人體細(xì)胞數(shù)量多十幾倍，微生物含有的基因數(shù)量至少是人類自身基因數(shù)量的100 倍[6-7]，其功能地位相當(dāng)于人后天獲得的一個重要“器官”[8]。所以研究者們已經(jīng)把腸道微生物菌群放在了影響人體營養(yǎng)代謝的重要地位。

已有研究證實腸道菌群能夠調(diào)控宿主基因表達(dá)[9]、改變熱量利用率[10-11]以及脂肪代謝，而飲食結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性[12]。抗性淀粉作為一種在健康人體小腸內(nèi)不能被消化吸收但能在結(jié)腸內(nèi)被微生物發(fā)酵利用的淀粉，具有優(yōu)于膳食纖維的功能?？梢酝ㄟ^腸道菌群發(fā)酵抗性淀粉產(chǎn)生短鏈脂肪酸改善腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道菌群[13]，同時具有改善血糖、血脂代謝[14]等有益作用，達(dá)到消脂減肥的功效。除了擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以外，放線菌（Actinobacteria）作為腸道菌群中的另外一個優(yōu)勢門類，其菌群的結(jié)構(gòu)是否與脂肪代謝有一定的關(guān)聯(lián)、抗性淀粉對腸道放線菌有著何種影響還有待研究。本實驗通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)探究香蕉抗性淀粉對小鼠腸道放線菌群多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、動物、菌株與試劑

香蕉粉（RS2型抗性淀粉含量52.8%） 廣東佛山蕉業(yè)生物科技有限公司。

C57BL/6J小鼠40 只，雌雄各20只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXK2012-0003；SYXK2012-0002）。

雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）購自中國工業(yè)菌種保藏中心。

分別按表1配制5 組飼料：普通飼料（CONV）、高脂飼料（HF）、5%香蕉抗性淀粉+高脂飼料（5% RS+HF，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、10% RS+HF、15% RS+HF。其中基礎(chǔ)飼料的成分為：玉米35%、黃豆粉15%、麥麩15%、面粉15%、魚粉6%、豆餅3%、酵母粉2%、雞蛋5%、菜油1%、骨粉2.5%、食鹽0.5%；高脂飼料成分為：豬油68%、蛋黃粉23%、蔗糖9%。飼料均由重慶市大坪醫(yī)院配制。

表1 實驗各組小鼠飼料配方Table 1 Diet formulations

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-BeadbeaterTM組織研磨器 美國BioSpec公司；ND-1000核酸定量儀 美國NanoDrop公司；PYC-150型PCR儀 美國MJ Research公司；DCode Universal Mutation Detection System變性梯度凝膠電泳儀、GelDOC2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Allegra 64R離心機(jī)美國Beckman Coulter公司；Light Cycler 480熒光定量PCR儀 美國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組與飼料配方

40 只健康C57BL/6J小鼠分成5 組，每組雌雄各4 只。分別采用5 組飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。所有小鼠每天自由攝食飲水，晝夜比12 h∶12 h，溫度22 ℃和舒適濕度，每周稱體質(zhì)量。

1.3.2 小鼠糞便DNA提取

飲食干預(yù)第0周和第8周采用逼迫法取小鼠新鮮糞便，參照李瑞等[15]的方法提取小鼠糞便DNA，去除RNA后以1%凝膠電泳檢測，在ND-1000核酸定量儀上測定DNA含量和純度，DNA質(zhì)量濃度均調(diào)整為100 ng/μL，分管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 放線菌門巢式PCR擴(kuò)增

引物參考文獻(xiàn)[1 6]：F 2 4 3：5’-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3’；R1378：5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’；R513GC：5’-GC-clamp-CGGCCGCGGCTGCTGGCACGTA-3’，其中GC-clamp序列（GC夾）：5’-CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’。第一輪PCR反應(yīng)25 μL體系：模板1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物F243和R1378（10 μmol/L）各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。第一輪程序：95 ℃ 7 min；95 ℃ 1 min，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 15 min。第二輪PCR反應(yīng)25 μL體系：以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物作為模板1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物F243和R513GC（均為10 μmol/L）各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。第二輪程序：95 ℃ 7 min；95 ℃ 1 min，70 ℃ 40s，72 ℃ 40 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。所得PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE分析

參照Muyzer等[17]的方法對放線菌16S rRNA V6～V8區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，總菌變性梯度為42%～60%，放線菌變性梯度為30%～70%，上樣量3 μL。采用DCode DGGE系統(tǒng)，1×TAE緩沖液60 ℃條件下，220 V預(yù)電泳10 min，然后85 V電泳16 h，結(jié)束后銀染法染色，拍照。

1.3.5 DGGE圖譜數(shù)字化分析

采用Quantity One 4.6.2軟件對DGGE指紋圖譜進(jìn)行處理，對小鼠腸道放線菌菌群多樣性進(jìn)行分析。分析DGGE圖譜每條泳道的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）和菌群均勻度（E），分別按式（1）、（2）計算，并采用UPGMA聚類方法獲得一個各泳道間的聚類分析進(jìn)化樹。

式中：Ni為該泳道中第i條條帶亮度；N為該泳道所有條帶亮度的總和；S為總條帶數(shù)。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測

擴(kuò)增雙歧桿菌16S rRNA全長基因引物序列[18]如下：F8：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R1391：5’-GACGGGCGGTGWGTRCA-3’。反應(yīng)體系（25 μL）：DNA 0.5 μL、10×Taq酶0.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、Taq緩沖液 2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。電泳割膠回收1 369 bp目的片段，以試劑盒純化后的產(chǎn)物與pMD?18-T Vector連接并克隆，抽提克隆質(zhì)粒作為含16S rRNA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。測序鑒定確為目的質(zhì)粒后測定DNA濃度，按式（3）計算拷貝數(shù)濃度。

式中：N為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)濃度/（copies/μL）；ρ為測得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度/（ng/μL）；M為重組后質(zhì)粒的堿基對數(shù)。

用已知濃度的質(zhì)粒10 倍稀釋法制作得5 個濃度梯度，分別作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物序列：Bif-F：5’-TCACAACTGACGCTTAGGCTC-3’；Bif-R：5’-AATGTACTACCCAGGCGGATC-3’。反應(yīng)體系（20 μL）：模板2 μL、2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。質(zhì)粒拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程。

將干預(yù)8 周后的小鼠糞便DNA進(jìn)行實時熒光定量PCR，每個樣品3 個重復(fù)。以Ct平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算每個樣本中1g DNA中雙歧桿菌的拷貝數(shù)，以對數(shù)值表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用One-way ANOVA對不同實驗組進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂飲食對小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 不同飲食干預(yù)對小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of different dietary interventions on body weight in mice

如圖1所示，干預(yù)前各組小鼠體質(zhì)量在同一水平，高脂飲食2 周后HF組的體質(zhì)量保持平穩(wěn)的增長，第8周時CONV組已經(jīng)與HF組產(chǎn)生了高度顯著的差異（p＜0.001），說明高脂飲食對小鼠體質(zhì)量影響非常明顯，肥胖小鼠模型建模成功。

此外，在初期小鼠不適應(yīng)高脂飲食表現(xiàn)為體質(zhì)量先小幅下降后升高，而5% RS緩解了高脂飲食的油膩感和適口性，增加了飲食攝入量，使體質(zhì)量增長較HF組快，但后期增長趨勢慢于HF組，若要判斷最終效果需延長時間進(jìn)一步觀察。10% RS+HF組和15% RS+HF組第3周后體質(zhì)量增長減慢，且15% RS+HF組更接近CONV組的體質(zhì)量。說明RS具有消脂減肥的功效，且其效果與劑量存在依賴關(guān)系。

2.2 小鼠腸道放線菌的PCR-DGGE圖譜

圖2 小鼠腸道放線菌的DGGE圖譜Fig. 2 DGGE prof i les of gut Actinobacteria in mice

表2 第0周時放線菌PCR-DGGE條帶測序結(jié)果Table 2 Sequence similarity of PCR-DGGE bands of gut Actinobacteria in mice without dietary intervention with GenBank sequences

表3 干預(yù)8周后放線菌PCR-DGGE條帶測序結(jié)果Table 3 Sequence similarity of PCR-DGGE bands of gut Actinobacteria in mice subjected to 8-week dietary intervention with GenBank sequences

從圖2a可看出，條帶3～7其亮度非常高，為0周各組小鼠腸道內(nèi)的優(yōu)勢放線菌。由表2可知，條帶3、4、6被鑒定出最接近的菌種為Bifidobacterium spp.，條帶5、7最接近的菌種分別為Rhodococcus spp.、Corynebacterium spp.，其余為非優(yōu)勢菌種。經(jīng)過8周的飲食干預(yù)，各組小鼠與干預(yù)前腸道放線菌之間產(chǎn)生了差異。由表3可知，條帶4、5最接近的菌種為Bifidobacterium spp.、Kineosphaera spp.，在CONV組亮度相當(dāng)高，說明為優(yōu)勢條帶，而在HF組徹底消失，隨著香蕉抗性淀粉劑量增大，條帶亮度增強，10% RS+HF組亮度最高，15%RS+HF組亮度減弱，表明香蕉抗性淀粉能削弱高脂飲食對該菌生長的抑制作用，促進(jìn)其生長，且具有劑量依賴關(guān)系。條帶11為Microbacterium spp.，在HF組未出現(xiàn)，10% RS+HF組和15% RS+HF組條帶11亮度高于CONV組，說明高劑量的香蕉抗性淀粉對該菌生長的促進(jìn)作用大于高脂飲食對其的抑制作用，且促進(jìn)效果明顯。

2.3 UPGMA聚類和主成分分析

圖3 第0、8周放線菌的UPGMA聚類和主成分分析圖Fig. 3 UPGMA cluster and principal component analysis of gut Actinomycetes in mice after 0 and 8 weeks of dietary intervention

從圖3a、c來看，各組小鼠之間相互交錯，未出現(xiàn)組內(nèi)聚集現(xiàn)象，說明5 組小鼠腸道放線菌差異不明顯，可用于香蕉抗性淀粉對腸道放線菌影響的研究觀察。8 周的飲食干預(yù)使5 組小鼠之間腸道放線菌發(fā)生分離，從圖3b、d可看出，高脂飲食誘導(dǎo)的HF組與其余4組徹底分離，說明高脂飲食明顯改變了小鼠放線菌群。結(jié)合DGGE圖譜條帶分析與測序，以及后續(xù)的實時熒光定量PCR對雙歧桿菌的定量分析，可以推測高脂飲食對放線菌群有明顯抑制作用；其余4 組之間沒有明顯的分界線，但不同抗性淀粉組之間有各組內(nèi)聚成簇的趨勢，說明香蕉抗性淀粉能夠不同程度調(diào)節(jié)高脂飲食引起的腸道放線菌的變化，且具有劑量依賴關(guān)系。

2.4 小鼠腸道放線菌生物多樣性分析

圖 4 第0（A）、8（B）周小鼠腸道放線菌群的多樣性分析Fig. 4 Diversity analysis of gut Actinobacteria in mice after 0 (A) and 8 (B)weeks of dietary intervention

由圖4A可知，各組多樣性指數(shù)（H）、均勻度（E）和豐富度（S）之間均無明顯差異（P＞0.05），說明干預(yù)前各組小鼠的腸道放線菌之間無顯著差異。8 周的飲食干預(yù)使5 組小鼠之間腸道放線菌多樣性發(fā)生改變。在多樣性指數(shù)和均勻度2 項指標(biāo)上，HF組多樣性略低于CONV組（P＞0.05），5% RS+HF組相對于HF組均有所降低，但差異不明顯（P＞0.05），10% RS+HF組有所升高（P＞0.05），而15% RS+HF組進(jìn)一步降低，與HF組產(chǎn)生了顯著性的差異（p＜0.05）。這可能是由于5%香蕉抗性淀粉的加入改善了適口性，使飼料攝入量增加，同時也增加了高脂飼料的攝入，直接影響了腸道菌群的多樣性。隨著香蕉抗性淀粉的劑量增加到10%，香蕉抗性淀粉的作用抵消甚至超過了高脂飼料的作用，使得菌群多樣性升高。當(dāng)繼續(xù)加大香蕉抗性淀粉的劑量至15%時，飼料中基礎(chǔ)飼料的量進(jìn)一步減少，香蕉抗性淀粉單一成分可能促進(jìn)了部分菌的生長，卻無法滿足另一大部分菌的生長，導(dǎo)致多樣性下降。豐富度方面未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 雙歧桿菌實時熒光定量PCR分析

雙歧桿菌屬特異性16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，峰形單一，峰尖且窄，說明未產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝-3.449 lg x+44.30，擴(kuò)增效率為95.0%，相關(guān)系數(shù)99.9%。說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度較好，可以覆蓋99.9%的數(shù)據(jù)范圍。

實時熒光定量PCR結(jié)果由圖5可知，HF組的雙歧桿菌數(shù)量極顯著低于CONV組（p＜0.01），5%RS+HF組與HF組沒有顯著差異（P＞0.05），而10%RS+HF組和15%RS+HF組高度顯著高于HF組（p＜0.001）。說明高脂飲食干預(yù)8周后，雙歧桿菌數(shù)量明顯下降，香蕉抗性淀粉的加入有利于恢復(fù)雙歧桿菌的生長，且能使其數(shù)量高于正常水平，具有劑量依賴關(guān)系，以添加10%香蕉抗性淀粉的效果最佳。

圖5 雙歧桿菌實時熒光定量PCR結(jié)果Fig. 5 Quantif i cation of Bif i dobacterium in fecal samples from mice by fl uorescence quantitative PCR

3 討 論

本實驗發(fā)現(xiàn)不同飲食結(jié)構(gòu)對小鼠腸道放線菌群具有顯著影響，高脂飼料對腸道放線菌群生長具有抑制作用，香蕉抗性淀粉能夠緩解這種抑制作用，同時促進(jìn)雙歧桿菌的生長，并有劑量依賴關(guān)系。

大部分腸道放線菌屬厭氧共生菌，雖然它們在腸道總菌中占有的比例較小，但是已有研究發(fā)現(xiàn)它們的種類和數(shù)量與宿主健康有著重要的關(guān)系。放線菌中有相當(dāng)比例的菌屬具有產(chǎn)短鏈脂肪酸的能力，而短鏈脂肪酸對腸道環(huán)境具有有益的調(diào)節(jié)作用，是益生菌的一個重要功能產(chǎn)物[19]，其中受關(guān)注最多的是雙歧桿菌。雙歧桿菌屬是一種非常重要的腸道益生菌，對宿主健康具有降膽固醇等重要的促進(jìn)作用[20-22]。

本研究參照Heuer等[16]的方法對腸道放線菌進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)第0周時放線菌在各組中分布均勻，經(jīng)過8 周的飲食干預(yù)，放線菌的種類相對于第0周時有所增加，并且5 組之間產(chǎn)生差異。CONV組與HF組放線菌多樣性指數(shù)及均勻度較香蕉抗性淀粉各劑量組高，這可能是由于香蕉抗性淀粉主要促進(jìn)部分菌的繁殖，而對于其他一些菌的生長具有抑制作用。Young[23]用抗性淀粉喂養(yǎng)斷奶SD大鼠發(fā)現(xiàn)放線菌比例顯著增加，其中主要是由雙歧桿菌一些種的數(shù)量大量增加引起的。

由第8周DGGE圖譜可看出，不同的飲食對放線菌的影響存在差異。條帶3、9、10、13最接近的菌種均為Corynebacterium spp.，條帶3為HF組的獨有條帶，條帶9和10在5 組中均有出現(xiàn)，HF組的亮度高于其他組，如此看來高脂飲食能夠促進(jìn)Corynebacterium中某些菌種的生長。而條帶13在HF組中未出現(xiàn)，在其余4 組中出現(xiàn)了且CONV組亮度最高，這又說明高脂飲食對Corynebacterium中某些菌種的生長具有強烈的抑制作用。這兩種現(xiàn)象似乎互相矛盾了，其實又是合理的。Corynebacterium是自然界中廣泛存在的一個菌屬，在土壤、水、植物、動物以及人體都有發(fā)現(xiàn)。大部分Corynebacteria不致病，是正常菌群中的一部分。Corynebacterium中也有一部分菌種是致病菌，如Corynebacterium diphtheriae，能導(dǎo)致致命的白喉病[24]。除此之外，一些Corynebacterium spp.能產(chǎn)生有益的次級代謝產(chǎn)物，如Corynebacterium glutamicum產(chǎn)生谷氨酸[25]，或具備特殊的生理功能，如Corynebacterium casei用來老化奶酪。由于本研究中相似度不夠高，所以不能完全確定條帶與菌種的一一對應(yīng)關(guān)系。條帶11最接近的菌種為Microbacterium spp.，除HF組之外，其他組均有出現(xiàn)，且隨香蕉抗性淀粉劑量的增大數(shù)量增多，為好氧的革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性，不形成吲哚和H2S，可利用乙酸、丙酸作為底物生長[26]。條帶4和5在CONV組亮度最高，HF組中未出現(xiàn)，香蕉抗性淀粉各劑量組中10% RS+HF組最高，說明高脂飲食對它們的生長具有抑制作用，而10%的香蕉抗性淀粉的緩解作用最明顯。經(jīng)測序最接近的菌種分別為Bifidobacterium spp.、Kineosphaera spp.，這與抗性淀粉對雙歧桿菌生長具有促進(jìn)作用這一結(jié)果一致[26]，而后者的相似度只有88%，可能并非該菌。條帶6和7為5 組小鼠腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌，但是HF組亮度低于其余4組，且組內(nèi)分布不均勻，CONV組與10% RS+HF組亮度最高。經(jīng)鑒定最相似的菌種均為Bifidobacterium spp.，進(jìn)一步說明高脂飼料對雙歧桿菌生長具有抑制作用，香蕉抗性淀粉能夠緩解這種抑制，并具有劑量依賴關(guān)系。

本研究還通過實時熒光定量PCR技術(shù)對香蕉抗性淀粉飲食干預(yù)8 周后的腸道雙歧桿菌進(jìn)行絕對定量，發(fā)現(xiàn)CONV組、10% RS+HF組以及15% RS+HF組與HF組之間在雙歧桿菌數(shù)量上產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)差異，其中10% RS+HF組與15% RS+HF組高度顯著高于HF組（p＜0.001）。這一結(jié)果也說明純高脂飲食對雙歧桿菌的生長具有不利影響，而香蕉抗性淀粉的加入能夠緩解甚至逆轉(zhuǎn)這種影響，添加10%香蕉抗性淀粉的效果最佳。第8周放線菌DGGE圖譜中條帶4、6、7經(jīng)鑒定最接近的菌種均為雙歧桿菌，在高脂組亮度較暗甚至完全消失，而在香蕉抗性淀粉組得到加強的這一現(xiàn)象正與實時熒光定量PCR的結(jié)果相吻合。

有研究報道香蕉淀粉控制糖尿病小大鼠的體質(zhì)量，增加短鏈脂肪酸，促進(jìn)擬桿菌乳桿菌生長，減少腸球菌數(shù)目[27]。鄔應(yīng)龍等[28]發(fā)現(xiàn)甘薯制備的3 種RS4抗性淀粉可改善高脂飲食小鼠腸道微生物多樣性。方建東[29]、何梅[30]等發(fā)現(xiàn)玉米抗性淀粉同樣使大鼠后腸雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌生長，大腸桿菌等有害菌數(shù)量減少。熟香蕉糖分超過60%，淀粉含量低于3%，而青香蕉化學(xué)成分中天然的抗性淀粉含量達(dá)到60%～70%，糖分含量低于3%，還有總膳食纖維含量11%～12%、水分含量8%～9%和少量蛋白質(zhì)（3%）[27]。所謂抗性淀粉類食品，其抗性淀粉含量應(yīng)超過18%，本實驗材料的香蕉粉中天然抗性淀粉含量超過52%，屬于香蕉天然抗性淀粉RS2。另外，香蕉粉中含有少量可溶性的糖、蛋白質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)會在小腸被消化吸收，具有抗性的RS淀粉不被消化到達(dá)結(jié)腸后才被微生物利用。本實驗中香蕉天然抗性淀粉對肥胖小鼠腸道菌群的益生作用與已有文獻(xiàn)中甘薯、玉米等其他抗性淀粉的作用類似[27-30]，但香蕉和玉米中其余成分的作用均未作單獨研究。

目前，已有較多研究證實了香蕉抗性淀粉可作為雙歧桿菌增殖因子，促進(jìn)雙歧桿菌的生長繁殖。本實驗證實了高脂飲食明顯降低C57BL/6J小鼠腸道菌群多樣性、抑制雙歧桿菌生長。香蕉抗性淀粉恢復(fù)肥胖C57BL/6J小鼠腸道放線菌群多樣性，顯著促進(jìn)雙歧桿菌的生長，且具有劑量依賴關(guān)系。

[1] 趙國建, 鮑金勇, 楊公明. 三種香蕉淀粉顆粒性質(zhì)的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(2): 46-49. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.02.004.

[2] PADWAL R S, SHARMA A M. Prevention of cardiovascular disease:obesity, diabetes and the metabolic syndrome[J]. Canadian Journal of Cardiology, 2010, 26: 18-20. DOI:10.1016/S0828-282X(10)71077-1.

[3] BODEN G, SHULMAN G I. Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes: def i ning their role in the development of insulin resistance and β-cell dysfunction[J]. European Journal of Clinical Investigation,2002, 32(Suppl 3): 14-23. DOI:10.1046/j.1365-2362.32.s3.3.x.

[4] FAROOQI I S, O’RAHILLY S. Genetics of obesity in humans[J].Endocrine Reviews, 2006, 27(7): 710-718. DOI:10.1210/er.2006-0040.

[5] HILL J O. Understanding and addressing the epidemic of obesity:an energy balance perspective[J]. Endocrine Reviews, 2006, 27(7):750-761. DOI:10.1210/er.2006-0032.

[6] ECKBURG P B, BIK E M, BERNSTEIN C N, et al. Diversity of the human intestinal microbial flora[J]. Science, 2005, 308: 1635-1638.DOI:10.1126/science.1110591.

[7] QIN J, LI R, RAES J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature, 2010, 464: 59-65.DOI:10.1038/nature08821.

[8] B?CKHED F, DING H, WANG T, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004,101(44): 15718-15723. DOI:10.1073/pnas.0407076101.

[9] PREISSLANDL K, ZIMMERMANN R, HAMMERLE G, et al.Lipoprotein lipase: the regulation of tissue specif i c expression and its role in lipid and energy metabolism[J]. Current Opinion in Lipidology,2002, 13(5): 471-481. DOI:10.1097/00041433-200210000-00002.

[10] TURNBAUGH P J, LEY R E, MAHOWALD M A, et al. An obesityassociated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J]. Nature, 2006, 444: 1027-1031. DOI:10.1038/nature05414.

[11] LEY R E, TURNBAUGH P J, KLEIN S, et al. Microbial ecology:human gut microbes associated with obesity[J]. Nature, 2006, 444:1022-1023. DOI:10.1038/4441022a.

[12] ZHANG C, ZHANG M, WANG S, et al. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice[J]. The ISME Journal, 2010, 4(2):232-241. DOI:10.1038/ismej.2009.112.

[13] READER D, JOHNSON M L, HOLLANDER P, et al. Response of resistant starch in a food bar vs. two commercially available food bars in persons with type Ⅱ diabetes mellitus[J]. Diabetes, 1997, 46(1):254A.

[14] SAJILATA M G, SINGHAL R S, KULKARNI P R. Resistant starch:a review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2006, 5(1): 1-17. DOI:10.1111/j.1541-4337.2006.tb00076.x.

[15] 李瑞, 廖振林, 方祥, 等. 抗性淀粉對HFA小鼠腸道菌群的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 25(7): 762-765.

[16] HEUER H, KRSEK M, BAKER P, et al. Analysis of actinomycete communities by specif i c amplif i cation of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(8): 3233-3241.

[17] MUYZER G, DE WAAL E C, UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplif i ed genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology,1993, 59(3): 695-700.

[18] ZOETENDAL E G, BOOIJINK C C G M, WELS M, et al. A metagenomics view on the human microbiota of the small-intestine[J].Microbial Ecology, 2009, 57(3): 587-588.

[19] FUENTES-ZARAGOZA E, RIQUELME-NAVARRETE M J,SáNCHEZ-ZAPATA E, et al. Resistant starch as functional ingredient: a review[J]. Food Research International, 2010, 43(4):931-942. DOI:10.1016/j.foodres.2010.02.004.

[20] TAHRI K, GRILL J P, SCHNEIDER F. Involvement of trihydroxyconjugated bile salts in cholesterol assimilation by bifidobacteria[J]. Current Microbiology, 1997, 34(2): 79-84.DOI:10.1007/s002849900148.

[21] HONG Z J Y. Progress in the effect of probiotics on cholesterol and its mechanism[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2005,2:34 DOI:10.3321/j.issn:0001-6209.2005.02.034.

[22] LIONG M T, SHAH N P. Bile salt deconjugation ability, bile salt hydrolase activity and cholesterol co-precipitation ability of Lactobacilli strains[J]. International Dairy Journal, 2005, 15(4):391-398. DOI:10.1016/j.idairyj.2004.08.007.

[23] YOUNG W, ROY N C, LEE J, et al. Changes in bowel microbiota induced by feeding weanlings resistant starch stimulate transcriptomic and physiological responses[J]. Applied and Environmental Microbiology,2012, 78(18): 6656-6664. DOI:10.1128/AEM.01536-12.

[24] FREEMAN V J. Studies on the virulence of bacteriophage-infected strains of Corynebacterium diphtheriae[J]. Journal of Bacteriology,1951, 61(6): 675.

[25] KALINOWSKI J, BATHE B, BARTELS D, et al. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of l-aspartate-derived amino acids and vitamins[J]. Journal of Biotechnology, 2003, 104(1): 5-25.DOI:10.1016/S0168-1656(03)00154-8.

[26] WU Y, WU M, WANG C, et al. Microbacterium profundi sp.nov., isolated from deep-sea sediment of polymetallic nodule environments[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2008, 58(12): 2930-2934. DOI:10.1099/ijs.0.2008/000455-0.

[27] 白永亮, 彭真福, 陳慶發(fā), 等. 香蕉粉干預(yù)對糖尿病大鼠腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(9): 2110-2114.

[28] 鄔應(yīng)龍, 王文婷. RS4型抗性淀粉對高脂飲食C57BL/6J小鼠腸絨毛形態(tài)及腸道菌群的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(21): 333-338.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201321067.

[29] 方建東. 抗性淀粉對小鼠腸道菌群的影響以及作用機(jī)制的研究[D].杭州: 浙江工商大學(xué), 2014: 57-59. DOI:10.7666/d.Y2531187.

[30] 何梅, 洪潔, 楊月欣, 等. 抗性淀粉對大鼠腸道菌群的影響[J]. 衛(wèi)生研究, 2005, 34(1): 85-87. DOI:10.3969/j.issn.1000-8020.2005.01.030.

Regulative Effect of Dietary Banana Resistant Starch on Gut Actinobacteria in Obese C57BL/6J Mice

LI Hanrong1, HUANG Shujun1,2, ZENG Benhua3, FANG Xiang1, WANG Li1, ZHONG Qingping1, TONG Yigang4, WEI Hong3,*, LIAO Zhenlin1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2. Guangdong Maternal and Child Health Hospital, Guangzhou 511400, China; 3. Department of Laboratory Animal Science,College of Basic Medical Sciences, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China; 4. Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

To study the impact of a high-fat diet supplemented with different doses of banana resistant starch (RS) on the diversity of gut Actinobacteria in obese C57BL/6J mice, 40 mice were randomly divided into five groups, which were fed a conventional diet (CONV), a high-fat diet (HF) alone, supplemented with 5% (5% RS + HF), 10% (10% RS +HF), and 15% (15% RS + HF) of RS, respectively. After 8 weeks of dietary intervention, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to monitor the changes in the composition of gut Actinobacteria in mice. The amounts of fecal Bif i dobacterium were compared among the fi ve groups of animals by real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR). Cluster analysis of the DGGE profiles showed that the HF group was significantly different from the other 4 groups. All the RS groups tended to form a cluster without obvious boundaries. In addition, the diversity and abundance of Actinobacteria in the 5% RS + HF and 15% RS + HF groups were signif i cantly lower than in the CONV and HF groups (P ＜ 0.05) and also lower than in the 10% RS + HF group. PCR results suggested that the high-fat diet could highly signif i cantly reduce the number of gut Bif i dobacteria (P ＜ 0.01), which, however, was very signif i cantly increased bysupplementation of 10% and 15% RS (P ＜ 0.001). Hence, we concluded that resistant starch can restore the diversity of gut Actinobacteria in obese mice, and signif i cantly promote the growth of Bif i dobacteria in a dose-dependent manner.

banana resistant starch; gut Actinobacteria; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

2016-10-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171673；31071528；31671855；81370906）；國家重點實驗室開放課題（SKLPBS1518）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）項目（2013CB532406）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）項目（2014AA022209；2014AA022204）

李漢榮（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物與營養(yǎng)調(diào)控。E-mail：826261525@qq.com

*通信作者：魏泓（1969—），男，教授，博士，研究方向為遺傳工程技術(shù)及無菌動物技術(shù)。E-mail：weihong63528@163.com

廖振林（1968—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物與營養(yǎng)調(diào)控。E-mail：602581821@qq.com

10.7506/spkx1002-6630-201723024

R151.2

A

1002-6630（2017）23-0149-08

李漢榮, 黃淑君, 曾本華, 等. 香蕉抗性淀粉對C57BL/6J肥胖小鼠腸道放線菌群的調(diào)控作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23):149-156.

10.7506/spkx1002-6630-201723024. http://www.spkx.net.cn

LI Hanrong, HUANG Shujun, ZENG Benhua, et al. Regulative effect of dietary banana resistant starch on gut Actinobacteria in obese C57BL/6J mice[J]. Food Science, 2017, 38(23): 149-156. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723024. http://www.spkx.net.cn