樊宗山， 敬廣偉， 趙海鵬

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南中牟451450； 2. 河南師范大學(xué)體育學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453002； 3. 河南雞公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，河南信陽(yáng)464000； 4. 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封475001)

游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

樊宗山1， 2， 敬廣偉3， 趙海鵬4*

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南中牟451450； 2. 河南師范大學(xué)體育學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453002； 3. 河南雞公山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，河南信陽(yáng)464000； 4. 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封475001)

探討游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。選擇11月齡的雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)平均分為對(duì)照組和游泳組，對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)而游泳組進(jìn)行1個(gè)月的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。分別采用剛果紅染色、Tunel檢測(cè)、Western Blot和Morris水迷宮等實(shí)驗(yàn)方法觀察小鼠大腦皮層Aβ斑形成、神經(jīng)元凋亡、線粒體生成相關(guān)蛋白表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層Aβ斑的形成、抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)線粒體生成、增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。由此可見，游泳運(yùn)動(dòng)可作為一項(xiàng)防治阿爾茨海默病的行為治療候選方案。

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠； 游泳運(yùn)動(dòng)； 學(xué)習(xí)記憶

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，典型的神經(jīng)病理變化是大腦內(nèi)存在β樣淀粉(amyloid-β，Aβ)沉淀形成的老年斑以及神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元丟失和神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)元由于其特殊的功能決定其只能依靠氧化磷酸化提供能量，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要細(xì)胞器，因此線粒體的質(zhì)量體積占神經(jīng)元的體積超過(guò)30%(王來(lái)，祝世功，2016)。線粒體結(jié)構(gòu)破壞、活性降低、功能紊亂等所導(dǎo)致的突觸降解、神經(jīng)元凋亡或丟失是AD發(fā)生的重要病理機(jī)制(Armand-Ugonetal.，2017；Wangetal.，2017；Yuetal.，2017)。研究表明，Aβ可富集到線粒體內(nèi)，誘導(dǎo)線粒體分裂，促進(jìn)線粒體片段化和瞬時(shí)通透孔(mitochondrial permeability transition)的開放，導(dǎo)致病理癥狀。抑制線粒體分裂可降低神經(jīng)元的線粒體功能紊亂、突觸降解及動(dòng)物的認(rèn)知能力降低，促進(jìn)線粒體功能則可以緩解AD的病理癥狀(Yeetal.，2015；Valasanietal.，2016；Baeketal.，2017；Reddyetal.，2017)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)能促進(jìn)線粒體生成，增強(qiáng)線粒體功能(王來(lái)，祝世功，2016)，因而對(duì)維持神經(jīng)元功能可能發(fā)揮重要作用。游泳運(yùn)動(dòng)能提高機(jī)體的認(rèn)知能力，抑制疾病或衰老導(dǎo)致的記憶能力降低，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)(崔建梅等，2013；欒海云等，2016)。本研究觀察游泳訓(xùn)練的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及其大腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況，探討游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物來(lái)源

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所并在本實(shí)驗(yàn)室繁育，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：J004462，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001。將雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠雜合體(+/-)與野生型雌鼠(-/-)合籠繁殖，幼鼠出生后2周，提取小鼠DNA并做PCR鑒定仔鼠基因型。APP基因上游引物為5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’，下游引物為5’-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3’，PCR產(chǎn)物為350 bp；PS1基因上游引物為5’-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3’，下游引物為5’-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3’，PCR產(chǎn)物為608 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。APP/PS1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠在306 bp和608 bp處有2條條帶，野生型小鼠無(wú)條帶。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度60%～80%的環(huán)境下飼養(yǎng)，以出生當(dāng)天為P0，直至飼養(yǎng)至游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束，共12個(gè)月。

1.2試劑

Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；DAPI試劑、剛果紅染色試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；小鼠抗PGC-1α抗體、兔抗細(xì)胞色素c氧化酶Ⅳ(cytochrome c oxidase Ⅳ，COX Ⅳ)抗體和小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自Santa公司；辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司；RIPA裂解液購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只隨機(jī)平均分為對(duì)照組和游泳組。將游泳組小鼠放入游泳池，游泳池四周光滑且池壁高出水面20 cm，水溫30 ℃±1 ℃(等于或稍低于體溫時(shí)游泳時(shí)間最長(zhǎng))，每次游泳15 min，每天1次，每周5 d，周二、四休息，共持續(xù)4周。如果小鼠漂浮在水中不游，用水溫計(jì)驅(qū)趕其尾部，使其不停游動(dòng)。

2.2剛果紅染色Aβ斑

將對(duì)照組和游泳組小鼠用水合氯醛腹腔麻醉，冰上灌流、取腦，置于4%多聚甲醛中室溫浸泡后固定24 h。固定后的大腦進(jìn)行梯度脫水處理：50%酒精，2 h；75%酒精，過(guò)夜；90%酒精，1 h；95%酒精Ⅰ，1 h；95%酒精Ⅱ，1 h；無(wú)水乙醇Ⅰ，1 h；無(wú)水乙醇Ⅱ，1 h；二甲苯Ⅰ，1 h；二甲苯Ⅱ，1 h；最后放入冬青油中過(guò)夜。脫水后的大腦用生物組織包埋機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司)包埋制成蠟塊。石蠟切片機(jī)將蠟塊切成4 μm的薄片，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60 ℃烘箱中干燥2 h，脫蠟復(fù)水。蘇木素染色液浸染5 min，酸性分化液分化5 s，自來(lái)水沖洗2 min返藍(lán)，自來(lái)水沖洗2 min，剛果紅染色液浸染20～30 min，無(wú)水乙醇快速?zèng)_洗3次，二甲苯透明，中性樹膠封片，用熒光顯微鏡(BX61，Olympus，Japan)觀察并拍照。

2.3Tunel檢測(cè)皮層神經(jīng)元的凋亡

取對(duì)照組和游泳組小鼠大腦石蠟切片，根據(jù)Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書依次添加相應(yīng)試劑。用熒光顯微鏡(BX61，Olympus，Japan)觀察并拍照。

2.4WesternBlot

10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，預(yù)冷的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)冰上進(jìn)行心臟灌注，至右心房流出清亮液體，斷頭取腦，迅速將小鼠大腦置于預(yù)冷的PBS中，小心剝離大腦皮質(zhì)，將其置于添加有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液中，電動(dòng)勻漿器勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，所得上清即為皮層總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量。樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離目的蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，用1×TBST漂洗3次，每次15 min，之后加入HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，用1×TBST漂洗3次，每次15 min。ECL試劑盒顯影曝片。Quntity One 4.62進(jìn)行條帶灰度分析。

2.5Morris水迷宮檢測(cè)

游泳前進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：測(cè)量小鼠對(duì)水迷宮空間學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7 d，第1～6天，每只小鼠每天訓(xùn)練3次。在水迷宮的不同象限貼上標(biāo)識(shí)，將小鼠按著標(biāo)識(shí)面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。如果小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，用導(dǎo)引棒將其引至平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10 s，這時(shí)潛伏期記為60 s。第7天測(cè)試；(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)：在第8天撤除水下平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠進(jìn)入原先放置平臺(tái)的象限所花的時(shí)間(目標(biāo)象限搜索時(shí)間百分比)和進(jìn)入該象限的次數(shù)(通過(guò)目標(biāo)區(qū)域次數(shù))，作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

2.6數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(MeanSD)表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定

PCR結(jié)果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠分別約在350 bp和608 bp處觀察到APP和PS1目的帶，該位置DNA片段的大小與理論結(jié)果一致，而野生型小鼠沒有這2條目的帶，說(shuō)明獲得APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(圖1)。

圖1 PCR鑒定APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠Fig. 1 APP/PS1 transgenic mice identified by PCR

M. Marker, 1.APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠APP/PS1 transgenic mouse， 2. 野生型小鼠wild type mouse.

3.2游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ斑的影響

剛果紅對(duì)Aβ斑的染色結(jié)果顯示，12月齡的對(duì)照組小鼠皮層內(nèi)形成大量的Aβ斑，然而通過(guò)1個(gè)月的游泳運(yùn)動(dòng)，游泳組小鼠皮層內(nèi)Aβ斑的數(shù)量極顯著減少(P<0.01)(圖2)。

3.3游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)皮層神經(jīng)元的影響

Tunel對(duì)神經(jīng)元凋亡的檢測(cè)結(jié)果顯示，12月齡的對(duì)照組小鼠皮層內(nèi)存在大量的神經(jīng)元凋亡，而經(jīng)過(guò)游泳運(yùn)動(dòng)的小鼠，皮層內(nèi)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量極顯著減少(P<0.01)(圖3)。

圖2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ斑的影響Fig. 2 Effects of swimming on Aβ plaques

A. 剛果紅標(biāo)記的Aβ斑， B. Aβ斑的統(tǒng)計(jì)分析；**P<0.01。

A. Aβ plaques marked by Congo red staining， B. statistical analysis of Aβ plaques；**P<0.01.

圖3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)皮層神經(jīng)元的影響Fig. 3 Effects of swimming on cortical neurons

A. Tunel標(biāo)記的凋亡細(xì)胞， B. 凋亡細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分析；**P<0.01； DAPI. 染細(xì)胞核， Tunel. 斷裂的DNA， Merge. 凋亡細(xì)胞。

A. apoptotic cells identified by Tunel， B. statistical analysis of apoptotic cells；**P<0.01； DAPI. nucleus， Tunel. broken DNA， Merge. apoptotic cells.

3.4游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)元PGC-1α和COXⅣ表達(dá)的影響

Western Blot檢測(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)PGC-1α和COX Ⅳ的表達(dá)。結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了小鼠皮質(zhì)內(nèi)PGC-1α和COX Ⅳ表達(dá)的上調(diào)，說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)線粒體的生成(圖4)。

圖4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)元PGC-1α和COX Ⅳ表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of swimming on the expression of PGC-1α and COX Ⅳ in neurons

**P<0.01，***P<0.001.

3.5游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，前3 d內(nèi)對(duì)照組和游泳組小鼠的逃避潛伏期都比較長(zhǎng)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從第4天開始，游泳組小鼠所需要的時(shí)間比對(duì)照組少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5：A)。在第8天撤出平臺(tái)，觀察小鼠的空間探索能力，發(fā)現(xiàn)游泳組小鼠穿過(guò)平臺(tái)所在象限的次數(shù)多于對(duì)照組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5：B)。觀察水迷宮的軌跡圖發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡比較復(fù)雜、沒有規(guī)律、耗時(shí)較多，而游泳組小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡的規(guī)律比較明顯、耗時(shí)較少(圖5：C)。

4 討論

AD作為老年期退行性且不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，常導(dǎo)致患者進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力減退以及性格和行為改變等。目前，Aβ沉淀形成老年斑所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡或丟失是解釋AD發(fā)生的重要病理機(jī)制。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有由小鼠朊病毒蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的突變?nèi)祟惖矸蹣忧暗鞍?APPswe)和人類早老素(DeltaE9)基因，最早在3月齡時(shí)即可出現(xiàn)Aβ沉積形成老年斑的病理變化，且隨著月齡的增加，出現(xiàn)AD病理癥狀的表現(xiàn)越加明顯，因此該模型小鼠是用來(lái)研究AD較理想的動(dòng)物模型(Jinetal.，2015；Zhaoetal.，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，12月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層內(nèi)形成大量由Aβ沉積所導(dǎo)致的老年斑，并觀察到神經(jīng)元大量凋亡，與AD出現(xiàn)大量Aβ斑沉積和神經(jīng)元凋亡或丟失的病理癥狀相吻合。

圖5 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig. 5 Effects of swimming on learning and memory abilities in APP/PS1 transgenic mice

A.逃避潛伏期， B. 穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)， C. 游泳軌跡；*P<0.05，**P<0.01。

A. time of latency， B. passing times across the platform quadrant， C. swim-tracking path；*P<0.05，**P<0.01.

最近研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可富集在線粒體內(nèi)，導(dǎo)致線粒體氧化損傷、生成能力降低、動(dòng)力學(xué)紊亂、結(jié)構(gòu)破壞和功能降低等，這些是AD發(fā)生的早期事件，因此，促進(jìn)線粒體的功能、抑制神經(jīng)元凋亡或丟失可能是防治AD的策略之一(Piconeetal.，2014；Wuetal.，2014；劉艷萍等，2015)。對(duì)缺血再灌注的研究表明，促進(jìn)線粒體生成可以增強(qiáng)線粒體的功能從而抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)(Wangetal.，2014)。孕期的游泳運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)子代大腦線粒體生成，降低新生鼠缺氧缺血性腦損傷、增加運(yùn)動(dòng)能力、促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)記憶能力，說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)行為可以通過(guò)促進(jìn)線粒體生成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)(Marcelinoetal.，2013，2016)。PGC-1α是線粒體生成的重要調(diào)控因子，促進(jìn)PGC-1α的表達(dá)可以增強(qiáng)線粒體的體積分?jǐn)?shù)、增加線粒體DNA的拷貝數(shù)、上調(diào)線粒體自身蛋白的表達(dá)，如COX Ⅳ促進(jìn)線粒體生成，增強(qiáng)線粒體的功能發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)(Abrahan & Ash，2016；王來(lái)，祝世功，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，12月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過(guò)游泳運(yùn)動(dòng)后，大腦皮層PGC-1α和COX Ⅳ的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)線粒體的生成。病理學(xué)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，游泳組小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ沉積形成的老年斑數(shù)量減少、神經(jīng)元凋亡數(shù)量降低，說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)可以降低Aβ斑的形成，抑制神經(jīng)元凋亡或丟失。Morris水迷宮檢測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力表明，游泳組小鼠的逃避潛伏期小于對(duì)照組，60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)多于對(duì)照組，對(duì)水迷宮軌跡圖的分析表明，對(duì)照組小鼠軌跡比較復(fù)雜、凌亂，而游泳組軌跡較為簡(jiǎn)單、有規(guī)律，充分說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的降低。

總之，本研究結(jié)果表明，游泳運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的PGC-1α的表達(dá)、促進(jìn)線粒體的生成、抑制Aβ斑的形成、抑制神經(jīng)元的凋亡或丟失、增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，該研究結(jié)果為探討AD的運(yùn)動(dòng)行為治療提供了依據(jù)。

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EffectsofSwimmingExerciseonLearningandMemoryAbilityofAPP/PS1TransgenicMice

FAN Zongshan1， 2， JING Guangwei3， ZHAO Haipeng4*

(1. Henan Vocational College of Agriculture， Zhongmou， Henan Province 451450， China； 2. Physical Education Institute of Henan Normal University， Xinxiang， Henan Province 453002， China； 3. Henan Jigong Mountain National Nature Reserve Management Bureau， Xinyang， Henan Province 464000， China； 4. School of Life Science， Henan University， Kaifeng， Henan Province 475001， China)

To investigate the effects of swimming on learning and memory ability of APP/PS1 transgenic mice. 11-month-old male APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into control group and swimming group. The control group had no exercise， and the swimming group had swimming training for 1 month. The expression of Aβ plaques， neuron apoptosis， mitochondria biogenesis-related protein expression and the learning and memory of APP/PS1 transgenic mice were determined by Congo red staining， Tunel assay， Western Blot and Morris water maze. The result showed that swimming exercise reduced the formation of Aβ plaques and neuronal apoptosis， promoted mitochondria biogenesis in the cerebral cortex of APP/PS1 transgenic mice， and enhanced the ability of learning and memory of APP/PS1 transgenic mice. This study suggested that swimming can promote the learning and memory ability of APP/PS1 transgenic mice by facilitating mitochondria biogenesis， and thus can be used as a treatment for the prevention and treatment of Alzheimer’s disease.

APP/PS1 transgenic mice； swimming； learning and memory

10.11984/j.issn.1000-7083.20170243

2017-08-11接受日期2017-11-10

樊宗山(1979—)， 男， 碩士研究生， 主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理與體育教學(xué)， E-mail：fanzs161@sohu.com

*通信作者Corresponding author， 男， 博士， 副教授， 研究方向：動(dòng)物學(xué)， E-mail：hpzhao1980@qq.com

R339.4

A

1000-7083(2017)06-0663-06