徐明珠，羅歡，周志雄，賈國庚，鄧建新，李傳仁

(長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

香樟葉斑病病原菌的分離與鑒定

徐明珠，羅歡，周志雄，賈國庚，鄧建新，李傳仁

(長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

香樟葉斑病是近年來荊州市香樟樹Cinnamomumcamphora的一種常發(fā)病害，褐色壞死斑點1～2 mm，常兩個至多個相互連接形成不規(guī)則病斑，遍布于整個葉片，嚴重影響香樟的正常生長。根據(jù)柯赫法則對感病組織進行分離、接種、再分離，再對獲得的病原菌進行形態(tài)觀察和rDNA-ITS、TUB-2和GPDH基因序列分析，結(jié)果表明引起香樟葉斑病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum的果生刺盤孢C.fructicola和暹羅刺盤孢C.siamense，屬于國內(nèi)首次報道。

香樟;葉斑病；病原菌；分離；鑒定

香樟Cinnamomumcamphora(L.) Presl.為亞熱帶常綠喬木，具芳香，廣泛分布于亞洲東南部。在我國，該樹種主要集中在長江流域及以南地區(qū)[1]，屬于我國重要的經(jīng)濟樹種，也是城市園林綠化的優(yōu)良樹種，其傳統(tǒng)用途主要包括園林綠化和裝飾、木材(建筑，家具和雕塑)、醫(yī)藥、殺蟲和驅(qū)蟲劑等。調(diào)查研究表明，香樟已被我國36個城市選為市樹，在傳統(tǒng)文化和宗教信仰方面也具有重要的應用價值[2]。隨著香樟種植面積的加大，病害問題也隨之而來。

近年來，荊州市道路綠化香樟常發(fā)生較為嚴重的葉斑病，嚴重影響香樟的正常生長。為此，作者通過組織分離法對病原菌進行分離、培養(yǎng)與致病性檢測試驗，并利用形態(tài)學和多基因位點序列分析的方法進行分類鑒定，旨在明確其種類，為科學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料：2016年5月，采于湖北省荊州市荊州區(qū)荊秘路長江大學西區(qū)附近的感病香樟樹。

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA，Difco，美國)、合成低營養(yǎng)培養(yǎng)基(synthetic low nutrient agar，SNA)[3]、次氯酸鈉溶液(天津天力化學試劑有限公司)、引物(ITS5和ITS4、Bt2a和Bt2b、GDF和GDR)由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

儀器：PCR儀(Veriti，ABI vertical，美國)、顯微成像系統(tǒng)(Eclipse Ci-E，尼康，日本)、打孔器(6 mm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 將具有典型癥狀的病葉沖洗干凈后，在病健交界處切取2～3 mm的組織塊，浸入4%次氯酸鈉溶液中消毒2 min，然后用無菌水沖洗3次，置于無菌濾紙上吸干表面殘留水分，再轉(zhuǎn)移至PDA(Difco)培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌絲后，從菌落邊緣挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，對所分離的菌株進行進一步純化和形態(tài)觀察。純培養(yǎng)物斜面培養(yǎng)后放入4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性檢測 從分離病原菌的香樟樹上，選取健康嫩葉，自來水沖洗干凈，用2%次氯酸鈉表面消毒2 min，然后無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干表面水分，放置于無菌高濕的保鮮盒中。將分離到的所有純化菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣切取6 mm菌絲塊，放置于保鮮盒中的香樟葉片上，以空白的PDA培養(yǎng)基作對照。蓋上盒蓋，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況。發(fā)病后，從病斑上再次分離病原物，檢測是否與接種菌株相同。試驗共重復3次。

1.2.3 病原菌形態(tài)學觀察 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，形成菌落后，用滅菌后的打孔器切取菌落邊緣直徑為6 mm的菌絲團塊，轉(zhuǎn)移到PDA平板(直徑90 mm)中央。在黑暗條件下，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、測量菌落大小。同時，在PDA菌落上挑取少量菌絲團塊，轉(zhuǎn)接于SNA培養(yǎng)基中央，并在四周放置無菌蓋玻片用以產(chǎn)生附著胞。在無光照條件下，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，以水為介質(zhì)，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)，隨機測量50個分生孢子的大小，并觀察蓋玻片上附著胞的形態(tài)，測量其大小。

1.2.4 DNA提取、PCR擴增及序列測定 將分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，從菌落上刮取菌絲團塊，放入1.5 mL離心管中，冷凍干燥后，利用CTAB法提取總DNA[4]。對其核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)，β-微管蛋白(TUB-2)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPDH)等3個基因片段進行PCR擴增，所用引物分別為ITS5和ITS4[5]、Bt2a和Bt2b[6]、GDF和GDR[7]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。采用體積為40 μL的2×Taq預混PCR反應體系(Genstar，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)，參考王薇 等[8]的條件。擴增產(chǎn)物與新型核酸染料(GoldenView，北京博邁德基因技術(shù)有限公司)混合，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對已擴增好的產(chǎn)物委托南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.2.5 多基因位點序列分析 將所獲得的供試菌株YZU 161002和YZU 161027的基因序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對，根據(jù)比對的初步結(jié)果，選用Weir等[9]盤長孢狀刺盤孢菌復合群中的模式菌株或權(quán)威菌株序列與本研究的供試菌株進行序列分析。利用Mega v5.03軟件中的ClustalW程序?qū)蝹€基因序列進行校排(alignment)，并對多個基因序列進行連接合并。利用RAxML軟件中的GTRCAT模型，重復1000次的自舉分析(bootstrap)，將Colletotrichumclidemiae設(shè)為組外對照，構(gòu)建ML(Maximum Likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟葉斑病癥狀 荊州市香樟葉斑病，多表現(xiàn)為褐色壞死斑點1～2 mm，常兩個至多個相互連接形成不規(guī)則形病斑，遍布于整個葉片(圖1A，B)，嚴重時葉片枯死，脫落。

A.病葉正面;B.病葉背面圖1 香樟葉斑病癥狀

2.2 致病性 經(jīng)初步菌落形態(tài)觀察，從香樟病葉上分離獲得的菌株可分為兩大類群，未分離到其它菌物。致病性檢測發(fā)現(xiàn)所有菌株均可引起健康香樟葉片發(fā)病，對照組未見發(fā)病。第3天起已出現(xiàn)褐色病斑，隨后病斑上產(chǎn)生灰色菌絲，7 d后致病結(jié)果如圖2所示，有些病斑上會產(chǎn)生粉紅色粘質(zhì)孢子堆(圖2C)。從這些病斑上再次分離病原菌，發(fā)現(xiàn)所獲得分離物與接種菌一致，表明所分離的菌株均為引起荊州市香樟葉斑病的病原菌。

C.菌株YZU 161002;D.菌株YZU 161027圖2 致病性檢測癥狀

2.3 病原菌的分離結(jié)果與形態(tài)特征 根據(jù)所分離到的病原菌菌株在PDA上的菌落特征及SNA上的形態(tài)特征，獲得形態(tài)一致的兩個類群，即兩個種類。要把這兩個種類鑒定到種非常困難，但是可確定兩株菌均為盤長孢狀刺盤孢菌復合群(C.gloeosporioidesComplex)中的種類，如表1所示。

表1 香樟葉斑病病原菌與盤長孢狀刺盤孢菌復合群種類的形態(tài)學比較

對兩個類群中的代表菌株YZU 161002和YZU 161027進行進一步的形態(tài)學觀察，結(jié)果為：

菌株YZU 161002在PDA上25 ℃暗培養(yǎng)的菌絲呈輻射狀生長，速度較快，菌落絮狀平鋪，初期白色或灰白色，漸變?yōu)闇\灰色至橄欖綠色，后期中央菌絲團塊有粉紅色孢子堆出現(xiàn)，7 d后菌落直徑大小為82～84 mm，背面灰色至深橄欖綠色；在SNA上25 ℃暗培養(yǎng)7 d后，分生孢子長橢圓形、無色、單胞、常見一端鈍圓，一端略尖銳，大小為(10～21)×(3～8)，附著胞深褐色，近球形、橢圓形、長橢圓形或三角形，邊緣不規(guī)則，大小為(7～15)×(6～9)μm(圖3)。

A.在PDA上的菌落形態(tài);B.在SNA上的分生孢子;C-D.附著胞圖3 香樟葉斑病病原菌菌株YZU 161002的形態(tài)特征

菌株YZU 161027在PDA培養(yǎng)基上，菌絲絨毛狀輻射生長，菌落白色，背面黃白色，7 d后菌落直徑大小為77～79 mm；在SNA上25 ℃無光照培養(yǎng)7 d后，分生孢子單胞、長橢圓形、無色、大小為(10～19.5)×(4～6.5)μm，附著胞卵形近不規(guī)則圓形、橢圓形或近球形，深褐色，大小為(7～14)×(5～7)μm(圖4)。

A.在PDA上的菌落形態(tài);B.在SNA上的分生孢子;C-D.附著胞圖4 香樟葉斑病病原菌菌株YZU 161027的形態(tài)特征

2.4 多基因位點序列分析 對香樟葉斑病的兩個病原菌菌株YZU 161002 和YZU 161027的rDNA-ITS、TUB-2和GPDH三個基因進行PCR擴增測序后，分別獲得577 / 576 bp，416 / 416 bp，280 / 277 bp大小的序列，其GenBank登錄號見表2。

表2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用長孢狀刺盤孢菌復合群菌株的種類、寄主及GenBank登錄號

利用三個基因拼接起來進行序列分析，并構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

結(jié)果表明，菌株YZU 161002與果生刺盤孢Colletotrichumfructicola菌株聚集在一起，菌株YZU 161027與暹羅刺盤孢C.siamense菌株聚集在一起，與其它相近種可明顯區(qū)分開來。這兩個種類均屬于盤長孢狀刺盤孢菌復合群(C.gloeosporioidesComplex)，因此，根據(jù)分子鑒定的結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學觀察，確定這兩個類群的菌株分別為Colletotrichumfructicola和C.siamense。

圖5 基于rDNA-ITS，TUB-2和GPDH基因序列構(gòu)建的ML(maximum likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究通過形態(tài)學、分子生物學及致病性檢測，證明了引起荊州市香樟葉斑病的病原菌為炭疽菌屬真菌Colletotrichumfructicola和C.siamense。這兩個種類是在2009年由Prihastuti等[10]從泰國南部健康咖啡漿果和病果上分離獲得，并首次報道為新種。2012年，有報道認為這兩個炭疽菌種類可侵染很多植物，引起植物發(fā)病，造成經(jīng)濟損失。無獨有偶，這兩個種類共同也可引起桃子[12]、辣椒[15]、油茶[16]等炭疽病發(fā)生。早期研究發(fā)現(xiàn)炭疽菌Colletotrichum可引起香樟和芳香樟發(fā)病，在葉部常表現(xiàn)癥狀為褐色斑點，形態(tài)學鑒定為膠胞炭疽菌C.gloeosporioides，又稱盤長孢狀刺盤孢菌[17-18]。但是，基于分子系統(tǒng)發(fā)育研究表明，過去形態(tài)學上的膠胞炭疽菌不只是一個種，而是一個盤長孢狀刺盤孢菌復合群(C.gloeosporioidescomplex)，共包含22個種和一個亞種[9]，包括C.fructicola和C.siamense。

盤長孢狀刺盤孢菌復合群的種類形態(tài)之間非常相似，種內(nèi)易存在差異性，目前培養(yǎng)的方法和條件相對比較混亂，準確的分類鑒定必須輔之以分子生物學方法。rDNA-ITS、ACT、TUB-2和GPDH等均為炭疽菌分子系統(tǒng)發(fā)育研究常用基因序列[9-14]。本研究通過三種常用基因(rDNA-ITS、TUB-2和GPDH)分析研究同樣發(fā)現(xiàn)，多基因位點序列分析可明確鑒定盤長孢狀刺盤孢菌復合群內(nèi)種類。

葛建明 等[17]描述的上海地區(qū)香樟炭疽病的病原菌和王麗貞[18]所報道的福建省三明市芳香樟炭疽病的病原菌經(jīng)形態(tài)學鑒定為膠胞炭疽菌C.gloeosporioides，此結(jié)果需要通過分子生物學方法再次核驗。本研究首次通過形態(tài)學和分子系統(tǒng)發(fā)育分析證明了香樟葉斑病是由兩種炭疽菌引起，為該葉斑病的有效防治提供了理論依據(jù)。

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(責任編輯 李計順)

IsolationandidentificationofthepathogenfromtheleafspotdiseaseonCinnamomumcamphora

/XU Mingzhu,et al.

(College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

Leaf spot disease onCinnamomumcamphoraoccurred severely and frequently in Jingzhou,Hubei province in recent years.The disease had the brown necrotic spot with 1-2 micrometers in length,two or more spots connected to perform a big spot in irregular shape and diffused onto the whole leave.It was strongly harmful to the growth of camphor.Based on Kohn′s rule,the author finished the isolation,inoculation and re-isolation for the infected tissues,and then observed the morphology of the isolated pathogen and conducted gene sequence analysis of rDNA-ITS,TUB-2 and GPDH.The results showed that the pathogens wereColletotrichumfructicolaandC.Siamense,both of them were firstly reported in China.

Cinnamomumcamphora;leaf spot disease;pathogen;isolation;identification

2016-12-09；

2017-02-21

國家自然科學基金項目(31400014)；長江大學青年人才基金項目(2015cqr17；2016cqr08)

徐明珠(1991—)，女，湖北荊州人，漢族，碩士在讀，從事園藝植物研究

鄧建新，男，副教授，從事植物真菌病害研究，E-mail：djxin555@hotmail.com；李傳仁，男，教授，主要從事昆蟲學研究，E-mail：lichuanren63@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)04-0021-05