*

(1.河北科技大學 環(huán)境科學與工程學院，石家莊 050018；2. 天津城建大學 環(huán)境與市政工程學院，天津 300384)

液質聯(lián)用檢測微生物菌群高絲氨酸內酯類信號分子

劉云曼1李亞靜2張燕2宋圓圓2牛文鈺1廉靜1*郭建博2

(1.河北科技大學 環(huán)境科學與工程學院，石家莊 050018；2. 天津城建大學 環(huán)境與市政工程學院，天津 300384)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時定量檢測高絲氨酸內酯類信號分子的方法。利用群體感應規(guī)律揭示顆粒污泥反應器快速啟動機制。本方法首先取自反應器的活性污泥經(jīng)離心分離，用乙酸乙酯萃取，旋轉蒸干后經(jīng)甲醇溶解定容可直接進樣測量；然后選取C18(50mm×4.6mm,1.8μm)色譜柱進行分離，甲醇與水(含0.1%甲酸)作為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧正離子模式(ESI+)電離，多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定性定量測定，分析時間為8.5min。對7種AHLs檢測的結果表明，在10～1000μg/L的范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，檢出限為310μg/L，在低、中、高3個加標水平下的回收率為96.57%～122.70%，相對標準偏差為0.21%～5.87%。

厭氧氨氧化 信號分子 ?；呓z氨酸內酯 高效液相色譜-串聯(lián)質譜

群體感應是細胞間進行通信且協(xié)調生理過程的行為，發(fā)生在細胞群體水平，依賴于細胞密度的變化。微生物細胞間的交流通過檢測微生物分泌的化學信號、電信號等進行分析[3]。信號分子是微生物用于細胞交流而分泌的一類特殊的菌體代謝產(chǎn)物，是群體感應中的重要媒介，且在不同種類的菌體間具有通用性[4]。當信號分子的濃度達到一定的閾值時可調控基因的表達[5]，如毒性因子的表達、抗生素和胞外酶的產(chǎn)生、細胞膜的生成等[6-9]。

群體感應中細菌分泌的信號分子主要有三類：革蘭氏陰性菌分泌的帶不同酰基側鏈的高絲氨酸內酯類(AHLs)；革蘭氏陽性菌分泌的寡肽類(AIP)；革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均可分泌的2號誘導物類(AI-2)，種內和種間交流均可使用的特異性交流信號[1,6,7, 10]。厭氧氨氧化菌為革蘭氏陰性菌，分泌AHLs類信號分子。由于微生物產(chǎn)生的信號分子的濃度極低，檢測困難，探索合適的檢測信號分子的方法很有意義。

檢測信號分子的方法有多種，傳統(tǒng)的檢測方法有利用生物傳感菌作為傳感器來檢測AHLs的存在；還有利用薄層層析與生物感應器相結合的方法檢測AHLs的種類[11, 12]，但是無法進行準確的定性定量分析。近年來高效液相色譜-質譜聯(lián)用、氣相色譜-質譜聯(lián)用技術作為新的檢測方法被用來檢測信號分子的存在[11]，有關利用此技術測定反硝化顆粒污泥快速啟動厭氧氨氧化反應器過程中信號分子的研究尚未有報道。本研究以7種AHLs(C4、C6、C8、3-OXO-C8、C10、C12、C14)為標樣，在低濃度條件下，建立了HPLC-MS對復雜菌群信號分子的快速檢測和定量分析方法，對厭氧氨氧化菌和反硝化菌分泌的信號分子進行檢測，通過顆粒污泥群體感應規(guī)律，揭示反硝化顆粒污泥快速啟動厭氧氨氧化反應器的機制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6410B液質聯(lián)用儀，美國安捷倫公司； RE-5203旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

N-丁基高絲氨酸內酯(C4-HSL),N-己基高絲氨酸內酯(C6-HSL),N-辛基高絲氨酸內酯(C8-HSL)，N-OXO-辛基高絲氨酸內酯(3-OXO-HSL),N-癸?；呓z氨酸內酯(C10-HSL), N-十二烷基高絲氨酸內酯(C12-HSL),N-十四基高絲氨酸內酯(C14-HSL)(7種信號分子結構式見圖1)的標準品均購自美國Sigma公司；甲醇、甲酸(色譜純)，乙酸乙酯(分析純)，購自天津市化學試劑供銷公司。用甲醇溶解標準品，配制成250mg/L的標準儲備液，-20℃存儲備用。實驗用水為超純水。

圖1 7種AHLs結構式

1.2 樣品前處理

實驗樣品取自本實驗室利用UASB反應器培養(yǎng)馴化的厭氧氨氧化污泥[13]，此污泥利用反硝化顆粒污泥摻雜少量的厭氧氨氧化污泥的馴化方法培養(yǎng)。取30mL顆粒污泥與出水的混合樣品用研缽搗碎后超聲破碎2min，在17000g/min離心10min，取上清液過0.45μm的濾膜后，用等量的乙酸乙酯萃取3次，取上層有機相旋轉蒸干[14, 15]，用甲醇定容至2mL，HPLC-MS/MS分析。

1.3 實驗方法

1.3.1色譜條件

C18色譜柱(安捷倫公司，50mm×4.6mm,1.8μm)，柱溫35℃，流速300μL/min，進樣體積10μL，分析時間8.5min；流動相：A為甲醇，B為含有0.1%甲酸的超純水。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫參數(shù)

1.3.2 質譜條件

采用電噴霧正離子掃描模式(ESI+)，多反應離子監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：4000V；離子源溫度：350℃；霧化氣壓力：40psi,載氣為N2，流量9L/min。粉碎電壓：60～105V；碰撞能：10eV；倍增電壓：200 V。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別選用甲醇-水和乙腈-水作為流動相，實驗結果表明，以甲醇-水為流動相得到的色譜圖分離效果較好。同時，在流動相中加入0.1%的甲酸提高了檢測的靈敏度，降低了檢出限和定量限。在上述選定的條件下對AHLs分析檢測，得到7種AHLs的色譜圖(圖2)，樣品在8.5min可完全分離。

圖2 7種AHLs色譜圖

2.2 質譜條件的優(yōu)化

采用MRM模式對粉碎電壓、碰撞能、母離子和兩對子離子等條件進行優(yōu)化，7種信號分子優(yōu)化后的條件見表2。

表2 多反應監(jiān)測(MRM)模式下7種AHLs優(yōu)化后的質譜條件

2.3 線性關系和檢出限

用甲醇配制7種信號分子的混合標準液，設置6個質量濃度梯度，標準系列分別為10、20、50、 100、500和1000μg/L。以質量濃度為橫坐標，定量離子m/z102的峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。結果表明，在10～1000μg/L的范圍內，7種信號分子濃度與對應的峰面積有良好的線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.997。以S/N=3計算出的檢出限為2～3μg/L，以S/N=10計算出的定量限為6.7～20μg/L(見表3)。

表3 7種AHLs的線性關系和檢出限及定量限

2.4 方法的準確度和精密度

向待測樣中分別加入20μg/L、100μg/L和500μg/L的混合標準液，對低、中、高3個加標水平平行測量6次，根據(jù)峰面積計算回收率，結果如表4。7種信號分子的平均回收率為96.6%～122.7%，相對標準偏差為0.21%～5.87%。

表4 7種AHLs的回收率與相對標準偏差

2.5 實際樣品的分析

從實際運行的厭氧氨氧化反應器和反硝化反應器中取20g濕污泥，按1.2所述的方法對泥樣進行前處理后，檢測兩種微生物分泌的信號分子，檢測結果表明Anammox確實存在群體感應系統(tǒng)。如圖3所示，利用反硝化污泥摻雜少量的厭氧氨氧化污泥培養(yǎng)馴化的厭氧氨氧化顆粒污泥與反硝化顆粒污泥分泌相同種類的信號分子，通過圖3可以看出兩種微生物分泌的C8-HSL與3-OXO-C8-HSL的量基本相同。但是對于C10-HSL和C12-HSL，反硝化菌的分泌量明顯高于厭氧氨氧化菌，由此推測可能是C10-HSL和C12-HSL兩種信號分子共同起作用，觸發(fā)某種群體感應系統(tǒng)，實現(xiàn)了反硝化菌與厭氧氨氧化菌之間的“語言交流”，促進了厭氧氨氧化反應器的快速啟動，此推論需進一步實驗進行驗證。

圖3 Anammox與反硝化菌釋放的AHLs的含量

3 結論

本研究建立高效液相色譜-質譜法檢測高絲氨酸內酯類信號分子。通過對檢測條件的優(yōu)化，能夠對信號分子進行快速、準確的定量分析。同時，應用此檢測方法對反應器中實際的厭氧氨氧化和反硝化顆粒污泥樣品進行分析測定，證明anammox確實存在群體感應系統(tǒng)，而且兩種微生物能夠分泌相同種類的信號分子，為進一步揭示二者協(xié)同作用關系提供了理論依據(jù)，也為其它種類信號分子的檢測提供了技術支撐。

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SimultaneousdeterminationofsevenN-acyl-homoserinelactone(AHLs)secretedusingbacteriabyHPLC-MS/MS.

LiuYunman1,LiYajing2,ZhangYan2,SongYuanyuan2,NiuWenyu1,LianJing1*,GuoJianbo2

(1.HebeiUniversityofScienceamp;Technology,Shijiazhuang050018,China；2.TianjinChengjianUniversity,Tianjin300384,China)

The activated sludge from the reactor was separated by centrifugation and extracted with ethyl acetate, and the sample was directly measured by dissolution of methanol after the rotary drying. C18- (50mm × 4.6mm, 1.8μm) column was selected as a HPLC column while methanol and water (containing 0.1% formic acid) were used as the mobile phase for gradient elution. Electrospray ionization mode (ESI _+) ionization and multiple reaction monitoring (MRM ) model were used for qualitative and quantitative determination.The analysis time was 8.5min. The results of the seven AHLs showed that the detection limit was 3-10μg/L, and the recoveries were 96.57%-122.70% at the three levels of low, medium and high. The relative standard deviations (RSDs) were 0.21%-5.87%. The linearship was good in the range of 10-1000μg/L.

anammox; signal mocelule; acyl-homoserine lactones;HPLC-MS/MS

國家自然科學基金資助項目(No. 51678387)；天津市自然科學基金重點項目，

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.005

2017-05-08

劉云曼，女，1993年出生，研究生，E-mail:ydmb1993@163.com。