文/王靜波 賈麗 徐立蒲 王小亮 張文 王姝 曹歡

引起虹鱒魚苗大量死亡病因分析

文/王靜波 賈麗 徐立蒲 王小亮 張文 王姝 曹歡

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊專欄

2017年3月～4月，北京懷柔一家虹鱒魚養(yǎng)殖場虹鱒魚苗發(fā)病，且出現大量死亡?；疾◆~主要表現為無活力，漂浮水面，集中于池子四角；鰓蓋張開，嚴重患病魚鰭條和尾柄出現潰爛。為確定病因，將患病魚分別進行傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、細菌以及寄生蟲檢測。檢測結果顯示：IHNV陰性；未分離到細菌；在患病魚鰓和體表均發(fā)現大量三代蟲，且體表數量最多，經PCR檢測和序列比對確定為細鱗鮭三代蟲。故判斷導致該場虹鱒魚苗大量死亡的病因是感染了細鱗鮭三代蟲。

鮭鱒魚是優(yōu)質的冷水魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，國際貿易頻繁，病害也凸顯，如傳染性造血器官壞死?。↖HN），已給全國乃至世界虹鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重影響，成為目前制約鮭鱒魚產業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。另外，因感染三代蟲造成鮭鱒魚苗大量死亡也有報道，如大西洋鮭三代蟲病是必須向OIE申報的疾病，該病僅兩年就使挪威野生大西洋鮭科魚幼魚數量下降50%。2017年3月～4月，北京市懷柔區(qū)一家虹鱒魚養(yǎng)殖場虹鱒魚苗出現大量死亡，且持續(xù)時間較長，累計死亡率達80%以上，死亡30余萬尾。針對這一情況，本文作者對患病魚分別進行了IHNV、細菌和寄生蟲檢測。經檢測，IHNV陰性，未分離到細菌，卻在患病魚鰓和體表均發(fā)現大量細鱗鮭三代蟲?，F將結果報告如下。

一、材料方法

1.材料

患病虹鱒魚來自北京懷柔一家虹鱒魚養(yǎng)殖場。魚體規(guī)格4cm～5cm。

2.主要試劑

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋生物技術有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購于北京威泰科生物技術有限公司。DNA抽提試劑盒及PCR相關試劑購于上海生物工程有限公司。

3.病原菌分離

取具典型癥狀的患病虹鱒魚苗，無菌操作從肝、脾和腎劃線分離于腦心浸液瓊脂（BHIA）平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

4.IHNV檢測

依據GB/T 15805.2-2008的要求，進行細胞分離和PCR檢測。

5.寄生蟲檢測

顯微鏡檢：取鰓組織制作水浸片，同時刮體表粘液壓片，進行觀察。

分子技術：依據OIE水生動物診斷試驗手冊提供方法。在解剖鏡下，挑去單個蟲體，放入無水酒精中固定，備用DNA抽提。PCR擴增內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列。引物5′-TTTCCGTAGGTGAACCT-3′和5′-TCCTCCGCTTAGTGATA-3′擴增1300bp的ITS區(qū)域。PCR反應體系50ul，PCR反應條件95 ℃ 預變性5分鐘； 94 ℃變性1分鐘、50℃退火1分鐘、72℃ 延伸2分鐘，循環(huán)30次；最后72℃延伸7分鐘。PCR產物由上海生物工程有限公司進行測序。

二、結果

1.發(fā)病情況

發(fā)病漁場虹鱒魚苗2017年3月初出現死亡，且持續(xù)死亡，累計死亡率達80%以上，死亡30余萬尾。患病魚主要表現為無活力，漂浮水面，集中于池子四角；鰓蓋張開；嚴重患病魚鰭條和尾柄出現潰爛。在此期間，養(yǎng)殖水溫11℃～12℃。

2.IHNV檢測和細菌分離

IHNV檢測結果為陰性；未從患病魚內臟中分離到細菌。

3.寄生蟲檢測

（1）形態(tài)觀察：在鰓組織水浸片和體表粘液壓片中均發(fā)現大量活蟲體，形態(tài)類似三代蟲（見圖1）。在體表粘液中的蟲體很快降解，很多蟲體僅剩下一對大鉤（見圖2）。在解剖鏡下，可見在患病魚體表和鰭條遍布密密麻麻的活體三代蟲，蟲體不斷伸縮（由于解剖鏡無拍照功能，本文中未提供照片）。

圖1 體表粘液蟲體

圖2 蟲體固著器-大鉤

（2）三代蟲ITS基因序列分析：樣品經PCR擴增出三代蟲屬基因片段約1300bp。序列經測序后，在NCBI上經Blast同源性檢索，發(fā)現其與GeneBank登記的編碼為KP325622細鱗鮭三代蟲的同源性最高，基因序列一致性99.43%。（見圖3）

三、討論

通過對具有典型臨床癥狀的患病虹鱒魚苗寄生蟲檢測，在其鰓和體表發(fā)現大量活體三代蟲，尤其是體表，蟲體密密麻麻遍布全身。寄生蟲病的確診主要是依據感染強度來判斷，當大量的三代蟲寄生魚苗體時，即可診斷為該魚苗已患三代蟲病。為進一步確定三代蟲種類，對蟲體核酸進行PCR檢測與基因比對序列分析，結果顯示與GeneBank登記的編碼為KP325622（細鱗鮭三代蟲）的基因序列一致性達99.43%，故判斷該場虹鱒魚苗感染的三代蟲為細鱗鮭三代蟲。根據檢測結果和結合臨床癥狀綜合分析，引起漁場虹鱒魚苗大量死亡原因為感染了細鱗鮭三代蟲。

根據中華人民共和國農業(yè)部發(fā)布的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中規(guī)定，將三代蟲病列為三類疫病。三代蟲主要寄生在魚體表和鰓，廣泛分布于世界各地海水和淡水水域，能寄生于絕大多數野生及養(yǎng)殖魚類，已報道的有400余種。三代蟲隸屬于單殖吸蟲，胎生，繁殖和傳播迅速，容易大面積爆發(fā)，尤其對魚苗影響較大，易造成魚苗大批量死亡。據報道大西洋鮭三代蟲僅兩年就使挪威野生大西洋鮭科魚幼魚數量下降了50%，對養(yǎng)殖業(yè)有較大的危害。上世紀九十年代末，我國黑龍江寧安渤海冷水魚試驗站養(yǎng)殖的細鱗鮭爆發(fā)細鱗鮭三代蟲病，12天死亡率達47%；2005年在陜西一家虹鱒魚養(yǎng)殖也暴發(fā)過細鱗鮭三代蟲病。

防治三代蟲有效的方法是使用菊酯類的藥物，如敵百蟲等。但是由于虹鱒魚對敵百蟲非常敏感，不適合用它進行治療。OIE水生動物診斷試驗手冊介紹了用高鹽度水，福爾馬林及含有氯和碘的化合物治療大西洋鮭三代蟲病的方法，結合本地情況作者建議該場使用高鹽度水進行治療，病情迅速得到控制。根據養(yǎng)殖者對發(fā)病史的敘述，作者分析本場發(fā)病原因可能與放養(yǎng)密度大，投飼量高，導致環(huán)境變差，而引發(fā)該病的暴發(fā)，因此還需要合理放養(yǎng)和投食。

近些年，國內外報道虹鱒魚苗因感染IHNV等病毒造成大量死亡病例較多，而因感染寄生蟲造成大量死亡的病例較少。因此，在今后虹鱒魚苗病害診斷與防控中也要注意寄生蟲病等。

圖3 ITS部分核酸序列比對結果（僅為部分截圖）

作者單位：北京市水產技術推廣站