穆方申 苗 亮 李明云 侯紅紅 李笑萌 徐玉敏

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室 寧波 315211)

光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)Leptin基因克隆及禁食-再投喂對其表達的影響*

穆方申 苗 亮①李明云①侯紅紅 李笑萌 徐玉敏

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室 寧波 315211)

瘦素(Leptin)是在動物攝食和能量代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用的一種蛋白。為研究光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)中Leptin基因(AfLep)的結(jié)構(gòu)和功能, 作者克隆了其cDNA序列全長。結(jié)果顯示AfLep由1315個核苷酸組成, 含1個長度為516bp的開放閱讀框, 預(yù)測編碼蛋白由171個氨基酸殘基組成并具有長度為20aa的信號肽。系統(tǒng)進化樹中AfLep與其他鯉科魚類的Leptin蛋白聚為一簇, 與齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)進化相關(guān)性最高。多重序列比對顯示AfLep與齊口裂腹魚Leptin蛋白相似性最高(86.7%), 與鯉科其他魚類間的相似性均在 80%以上。AfLep具有脊椎動物L(fēng)eptin蛋白的4個保守α螺旋結(jié)構(gòu), 其三級結(jié)構(gòu)與人Leptin相似。AfLep在光唇魚肝臟中的表達量最高, 其次是腦和腎, 其他組織中僅有微弱表達。實時熒光定量PCR檢測顯示禁食后光唇魚肝臟AfLep表達量降低(P＜0.05), 禁食1d、3d、7d時的表達量分別比與禁食前降低了58.25%、73.82%和92.05%;禁食1d和3d的魚經(jīng)再投喂后肝臟AfLep表達量均顯著升高(P＜0.05), 但禁食7d的魚再投喂后AfLep表達量僅略有升高(P＞0.05)。上述結(jié)果表明AfLep參與了光唇魚的攝食管理和能量代謝調(diào)控。

光唇魚; Leptin基因; 組織表達; 禁食-再投喂

由于天然餌料的季節(jié)性豐度變化以及人工養(yǎng)殖中的限制性投餌, 魚類無論在野生還是養(yǎng)殖條件下都可能會經(jīng)歷一定的食物匱乏期。饑餓狀態(tài)導(dǎo)致的魚體生理生化、代謝變化會影響攝食行為、能量代謝、物質(zhì)組成及生長發(fā)育、生殖等生命活動(王婷等, 2015;賀詩水等, 2016)。Leptin又稱瘦素, 是在動物攝食和能量平衡的調(diào)節(jié)中有重要的作用一種蛋白質(zhì)激素,并在生殖和發(fā)育、免疫、心血管功能調(diào)節(jié)等方面有重要作用(Klok, 2007)。在哺乳動物中, Leptin可通過下丘腦-垂體軸的反饋調(diào)節(jié)使動物攝食減少、能量消耗增加(Sahu, 2004)。目前已獲得了斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、大西洋鮭(Salmo salar)等多種魚類的Leptin基因序列, 雖然魚類的Leptin蛋白有著相似的高級結(jié)構(gòu), 但各科、目之間氨基酸序列卻有較大差異, 關(guān)于魚類中Leptin的功能也存在爭議(Copelandet al, 2011)。就攝食調(diào)節(jié)方面而言, 鯉(C.carpio)和草魚(C.idella)均為禁食后 Leptin基因表達上調(diào)、攝食表達后下調(diào)(盧榮華等, 2015), 且對金魚(Carassius auratus)和虹鱒(O.mykiss)側(cè)腦室注射Leptin蛋白后可以抑制攝食、導(dǎo)致體重降低(de Pedroet al, 2006; Aguilaret al, 2010); 但在點帶石斑魚(Epinephelus coioides)、虹鱒(O.mykiss)中則發(fā)現(xiàn)饑餓狀態(tài)下Leptin基因表達上調(diào)(Klinget al, 2009; Zhanget al, 2013)。魚類中Leptin的功能可能比哺乳動物復(fù)雜,要弄清 Leptin在魚類攝食管理和能量代謝調(diào)控中的功能及作用機制還需要進行更加廣泛和深入的研究。

光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)俗稱淡水石斑魚,屬鯉形目、 鯉科、鲃亞科、光唇魚屬, 不但有較高的營養(yǎng)價值, 還可作為小型觀賞魚(潘娜等, 2015)。近年來光唇魚的人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟, 養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大, 但在攝食調(diào)控、能量代謝調(diào)節(jié)等方面鮮有研究報道。本研究克隆光唇魚Leptin基因(AfLep),并檢測禁食期間及恢復(fù)投喂后AfLep的表達變化, 以期為研究魚類 Leptin的功能及其光唇魚的攝食和能量代謝調(diào)節(jié)中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及禁食-再投喂實驗

光唇魚由浙江省新昌縣新漁水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供, 為人工繁育、養(yǎng)殖的12月齡光唇魚, 共450尾, 平均體重(3.13±1.14)g、平均體長(6.82±0.64)cm。將魚隨機分配到9個容積為50L的塑料桶中, 每桶50尾, 暫養(yǎng)4天后開始實驗。暫養(yǎng)期間每天投喂2次通威牌顆粒飼料, 每次投喂量為魚體重的 2%。每 3個桶為1組, 處理如下: 第1組禁食1d后恢復(fù)投喂, 第2組禁食3d后恢復(fù)投喂, 第3組禁食7d后恢復(fù)投喂。

1.2 樣品采集

在禁食前(0d)和禁食后 1d、3d、7d以及再投喂后3h分別采樣1次, 每次每桶隨機取樣5尾。取樣時將魚用丁香酚麻醉后立即解剖, 其中禁食前取肌肉、鰓、心、肝臟、脾、腸、腎、腦等組織, 用于AfLep基因克隆、組織表達分析和表達量檢測; 禁食及再投喂后取肝臟, 用于檢測AfLep基因表達變化。樣品經(jīng)液氮速凍后–80℃保存, 用 Trizol法提取各組織總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 AfLep基因克隆

檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中鯉科魚類Leptin蛋白序列, 經(jīng)序列比對后根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計 3對兼并引物(lep1, lep2和lep3, 見表1)對光唇魚AfLep基因cDNA序列進行擴增。用 ExTaq?Hot Start Version聚合酶體系(TaKaRa)進行PCR擴增, 50μL反應(yīng)體系包括: 5U/μL的ExTaqHS 0.25μL, 10×ExTaqBuffer (Mg2+Plus) 5μL,dNTP Mixutre 4μL, 上、下游引物各0.5μL, cDNA模板1μL, dH2O 38.75μL。反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性5min;94℃變性 30s、退火(引物退火溫度見表 1)30s、72℃合成30s, 循環(huán)30次; 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后連接入 pMD-19T載體,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌, 挑選陽性克隆菌落送測序。引物合成和測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司進行。對測得的序列進行拼接后獲得光唇魚AfLep基因核心序列。

根據(jù)所獲核心序列設(shè)計引物 lep-3′-RACE和lep-5′-RACE(表 1), 用 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit (TaKaRa)擴增光唇魚AfLep基因cDNA的3′端和5′端序列, 擴增體系及反應(yīng)程序均按照說明書進行。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后連接入pMD-19T載體, 轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌,挑選陽性克隆菌落送測序, 拼接后獲得光唇魚AfLep基因cDNA序列全長。

表1 引物信息Tab.1 Information of the primers

1.4 AfLep序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

對獲得的AfLep基因cDNA序列, 用在線ORF Finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析開放讀碼框(open reading frame, ORF); 用SingalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測信號肽; 用 SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)的 ProMod II功能對 AfLep蛋白進行二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的人 Leptin結(jié)構(gòu)作為參照); 從 GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索魚類及其他脊椎動物的 Leptin序列(表 2), 經(jīng) Cluastal X1.83軟件進行多重比對后用MEGA5.0軟件構(gòu)建基于氨基酸序列的 NJ法(Neighbor-joining)系統(tǒng)進化樹, 設(shè)置 bootstraps驗證次數(shù)為1000次。

表2 多重序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹所用序列Tab.2 Sequences that used for multiple alignment and phylogenetic tree construction

1.5 AfLep組織表達及禁食-再投喂后表達變化

根據(jù)獲得的AfLep基因cDNA序列設(shè)計1對表達檢測引物q-lep、并以β-actin作為內(nèi)參(表1), 檢測AfLep基因在光唇魚各組織中的表達情況及禁食-再投喂后的表達變化。

以提取的正常投喂健康光唇魚各組織 cDNA為模板, 通過半定量RT-PCR檢測各組織中AfLep基因的表達情況。20μL反應(yīng)體系包括: 2×TaqPremix-Dye酶 10μL, 正反向引物各 1μL, 模板 cDNA 1μL, dH2O 7μL。程序為: 94℃預(yù)變性 5min: 94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s, 循環(huán)30次; 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后凝膠成像。

對禁食期間及再投喂后光唇魚肝臟中 AfLep基因的表達變化進行實時熒光定量 PCR (real-time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測。反應(yīng)使用 SYBR?PremixEx TaqTM試劑盒(TaKaRa), 20μL反應(yīng)體系包括: SYBR?Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus) 10μL,正、反向引物各1μL, cDNA模板 1μL, ddH2O 7μL。反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性2min; 94℃變性15s、58℃退火15s、72℃延伸30s, 循環(huán)40次并記錄CT值。反應(yīng)完成后, 系統(tǒng)在 65—94℃、每次升溫 0.5℃生成溶解曲線。以β-actin 為內(nèi)參、用 2–ΔΔCt法(Livaket al, 2001)計算AfLep基因相對表達量。用Excel2007軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計, 計算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差; 用 SPSS16.0軟件對不同時間點的基因相對表達量進行單因素方差(One way ANOVA)分析, 以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 AfLep序列特征

經(jīng)測序和拼接, 獲得 AfLep基因序列全長1315bp, 其中 5′端 175bp, 3′端 699bp; 該序列含有 1個長度為516bp的開放閱讀框(ORF), 編碼171個氨基酸; 經(jīng)SignalP4.1預(yù)測, 編碼蛋白有長度為20aa的信號肽(圖1)。

基于各種動物 Leptin氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中(圖 2), 魚類 Leptin獨立于兩棲類、鳥類、哺乳類等其他脊椎動物而聚為一個大簇; 在魚類Leptin中鯉科、鰻鱺科、石首魚科、鮭科魚類均單獨聚為一個小簇; AfLep位于鯉科魚類的分支中, 優(yōu)先與齊口裂腹魚 Leptin相聚。多重序列比對顯示AfLep與齊口裂腹魚 Leptin相似性最高(86.7%), 與鯉科其他魚類 Leptin的相似性均在 80%以上, 與非鯉科魚類Leptin的相似性較低(30%左右), 而與兩棲類、鳥類和哺乳類等其他脊椎動物L(fēng)eptin相似性僅約20%。

圖1 AfLep基因cDNA核苷酸序列及預(yù)測編碼的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequences of AfLep cDNA and deduced amino acid sequence

圖2 Leptin系統(tǒng)進化樹(NJ法, bootstraps=1000)Fig.2 The phylogenetic tree of Leptin (neighbor-joining method, bootstraps=1000)

序列比對(圖 3)顯示光唇魚、齊口裂腹魚、鯉等鯉科魚類的 Leptin氨基酸序列較為保守, 而與非鯉科魚類以及其他脊椎動物的Leptin序列差異較大; 但各種動物L(fēng)eptin蛋白的二級結(jié)構(gòu)高度保守, 均有4個α螺旋(Helix A-D), 且具有長度約 20aa的信號肽。預(yù)測的AfLep蛋白三級空間結(jié)構(gòu)也與人Leptin蛋白相似(圖4)。

圖3 AfLep與其他生物L(fēng)eptin氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment among AfLep and Leptin of other species

圖4 Leptin蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 The tertiary structures of Leptin protein

2.2 組織表達特征

半定量RT-PCR檢測顯示了AfLep基因在光唇魚肝臟中的表達量最高, 其次是腦和腎, 在肌肉、脾、心臟、鰓和腸等組織中僅有微弱表達(圖5)。

圖5 AfLep基因在光唇魚各組織中的表達Fig.5 The expression of AfLep gene in various tissues of A.fasciatus

2.3 禁食及再投喂后光唇魚肝臟AfLep基因的表達變化

經(jīng)實時熒光定量PCR檢測(圖6), 禁食后光唇魚肝臟中 AfLep基因表達顯著下調(diào)(P＜0.05), 且表達水平隨禁食時間延長而逐漸降低: 禁食 1d、3d、7d后AfLep基因表達量分別比禁食前(0d)降低了58.25%、73.82%和92.05%。禁食-再投喂后AfLep基因表達上調(diào), 其中禁食1d組和禁食3d組分別顯著升高了1.79倍和2.65倍(P＜0.05), 而禁食7d組的表達水平僅略有升高、差異不顯著(P＞0.05)。

圖6 禁食及再投喂后光唇魚肝臟中AfLep基因表達變化Fig.6 Changes in expression of AfLep in liver of A.fasciatus during fasting and after refeeding

3 討論

自Zhang等(1994)率先在小鼠中得到Leptin基因以來, 已在包括魚類在內(nèi)的脊椎動物各類群中都發(fā)現(xiàn)有與哺乳類Leptin同源的基因存在。在哺乳動物及非洲爪蟾的基因組中Leptin基因僅有1個拷貝、編碼1種蛋白, 而在某些魚類中則發(fā)現(xiàn)存在多個拷貝以及不同的Leptin蛋白亞型(Kurokawaet al, 2009; Angotziet al, 2013; 盧榮華等, 2015), 這可能與魚類在進化過程中發(fā)生過基因組復(fù)制有關(guān)(周莉等, 2006)。另外,魚類中Leptin基因的起源進化關(guān)系也比較復(fù)雜, 例如鯉(C.carpio)2個Leptin基因拷貝所編碼的蛋白相似性較高(84%), 而斑馬魚(D.rerio)中2個Leptin蛋白亞型的相似性卻僅有 24%(盧榮華等, 2015)。本研究通過同源克隆從光唇魚中獲得了一個 Leptin基因(AfLep), 但不能確定光唇魚基因組中是否還存在該基因的其他拷貝。

在本研究構(gòu)建的Leptin系統(tǒng)進化樹中, 包括光唇魚AfLep在內(nèi)的各種鯉科魚類Leptin聚為一簇, 其氨基酸序列相似性在80%以上, 而與非鯉科魚類Leptin的相似性僅 30%左右。魚類不同科、目之間 Leptin氨基酸序列有較大差異, 這可能與魚類種系發(fā)生和系統(tǒng)進化關(guān)系復(fù)雜有關(guān); 但研究顯示在各種脊椎動物基因組中Leptin基因有著相似的線性排列, 表明它們可能有相同的起源; 并且各類動物L(fēng)eptin蛋白二級結(jié)構(gòu)高度保守, 均含2個半胱氨酸和形成4個α螺旋(盧榮華等, 2015; 張沛等, 2016); 本研究預(yù)測的光唇魚AfLep蛋白的空間結(jié)構(gòu)也與人類Leptin蛋白相似。結(jié)構(gòu)上的保守可能對 Leptin蛋白的穩(wěn)定性和活性有重要影響, 而氨基酸序列的低相似性則反映了Leptin基因在物種進化中的差異, 這種差異可能導(dǎo)致該基因在不同生物中功能的多樣化。

小鼠等哺乳動物中 Leptin基因主要在脂肪組織表達(Trayhurnet al, 1995), 兩棲類Leptin則是腦和心臟中表達量較高。在光唇魚肝臟中AfLep基因高表達,斑馬魚(D.rerio)、花鱸(Lateolabrax maculatus)、鱖魚(Siniperca chuatsi)、點帶石斑魚(E.coioide)等魚類中也是肝臟中 Leptin基因表達量最高(Gorissenet al,2009; Zhanget al, 2013; 張沛等, 2016; Yuanet al,2016); 但也有些魚類在其他組織中出現(xiàn) Leptin的高表達, 如團頭魴(Megalobrama amblycephala)腎臟、鰓、腸、性腺中 Leptin的表達量遠均高于肝臟(趙鴻昊等, 2016), 大西洋鮭(S.salar)Leptin則是在腦中表達量最高、肌肉中也有較高表達(Ronnestadet al,2010); Leptin基因組織表達的這種差異性提示該基因在魚類中可能有多種功能, 并且在不同魚類中的功能可能有較大差異。

在人、小鼠等哺乳動物中的實驗顯示饑餓后Leptin基因表達量和血漿Leptin蛋白水平顯著降低、進食后升高(Kolaczynskiet al, 1995; Saladinet al,1995; Trayhurnet al, 1995; Weigleet al, 1997)。本研究中 AfLep在光唇魚肝臟中的表達也表現(xiàn)為禁食后顯著降低、恢復(fù)喂食后升高, 提示該基因有降低食欲的作用, 在草魚(C.idella)、金魚(C.auratus)、鱸魚(Morone saxatilis)、虹鱒(O.mykiss)等魚類中也得到了相似的結(jié)果(盧榮華等, 2015), 但在點帶石斑魚(E.coioides)和虹鱒(O.mykiss)中則發(fā)現(xiàn)禁食后Leptin基因表達上調(diào)、血漿Leptin蛋白含量升高(Klinget al,2009; Zhanget al, 2013)。這可能與不同魚類在攝食和糖、脂代謝管理方式上有著很大的差異有關(guān), 例如通常情況下機體處于饑餓狀態(tài)時會分解脂肪提供能量,但真鯛(Pagrus major)幼魚經(jīng)過短期饑餓后卻出現(xiàn)了脂肪含量的升高(Kaneko, 2016); 而肉食性和植食性魚類在糖代謝上也有很大不同(Moon, 2001)。另外,本研究中禁食1d和3d的光唇魚在攝食后肝臟AfLep基因表達量均顯著升高, 提示此時魚體的能量儲備可能消耗不大; 而禁食7d組攝食后肝臟AfLep基因表達仍處于較低水平, 提示魚體脂肪消耗過多、需攝取更多食物進行補充。賀詩水等(2016)也發(fā)現(xiàn)鯽魚(Carassius auratus)饑餓 4d后脂肪含量僅下降了約10%, 而饑餓6d后已減少了50%以上。雖然本研究表明AfLep基因參與了光唇魚的攝食管理, 但要弄清其作用機制以及在能量代謝中的功能仍需進一步研究。

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CLONING AND EXPRESSION OF LEPTIN GENE INACROSSOCHEILUS FASCIATUSDURING FASTING AND REFEEDING

MU Fang-Shen, MIAO Liang, LI Ming-Yun, HOU Hong-Hong, LI Xiao-Meng, XU Yu-Min
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo University,Ningbo315211,China)

Leptin plays an important role in regulation of food intake and energy expenditure in animals.To study the structure and function of Leptin gene in commercial fishAcrossocheilus fasciatus, we cloned the cDNA sequence of Leptin gene inA.fasciatus, named AfLep.The full-length of AfLep cDNA sequence was 1315bp, contained an open reading frame(ORF) of 516bp encoding 171 amino acids; and the initiative 20 amino acid consisted of signal peptide.In the phylogenetic tree, AfLep gathered with Leptin of other Cyprinidae fish and was most closely related to Leptin ofSchizothorax prenanti.The multiple sequence alignment showed that AfLep shared the highest amino acid sequence identify (86.7%) with Leptin ofS.prenanti, and had more than 80% sequence identity to other Cyprinidae fish.The predicted protein of AfLep has four α helices regions, which is conserved in vertebrates.The predicted tertiary structure of AfLep is similar to human Leptin.AfLep gene had the highest expression level in liver, followed by brain and kidney, and weakly expressed in other tissues.Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) showed that the expression of AfLep decreased significantly in liver after being fasted (P＜0.05), and reduced by 58.25%, 73.82%, and 92.05% after fasting 1d, 3d, and 7d, respectively,compared to pre-fasting.When the fish were refed 1d and 3d after fasting, the expression level of AfLep in liver significantly increased (P＜0.05), but in the group of fasting 7d the AfLep expression was slightly elevated after refeeding(P＞0.05).All these results indicate that AfLep participates in the adjustment of feeding regulation and energy metabolism.

Acrossocheilus fasciatus; Leptin gene; tissue expression; fasting and refeeding

Q346

10.11693/hyhz20170100023

* 浙江省海洋與漁業(yè)項目, 浙海漁計[2012]83號; 國家星火計劃項目, 2011GA701001號。穆方申, E-mail: mufangshen@126.com

① 通訊作者: 苗 亮, 博士, 碩士生導(dǎo)師, E-mail: miaoliang@nbu.edu.cn; 李明云, 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail:limingyun@nbu.edu.cn

2017-01-26, 收修改稿日期: 2017-03-03