胡曉悅，周峻崗，2，余 垚，呂 紅，2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438)

馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)菊粉酶啟動(dòng)子的改造及活性研究

胡曉悅1，周峻崗1，2，余 垚1，呂 紅1，2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438)

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)作為一種食品安全級(jí)酵母，具有生長(zhǎng)快，生物量高等特點(diǎn)，是一種新型的重組蛋白表達(dá)的宿主系統(tǒng)．啟動(dòng)子是供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，調(diào)控著轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程，直接影響基因的表達(dá)水平．本文通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)馬克斯克魯維酵母菊粉酶啟動(dòng)子Pinu進(jìn)行兩輪突變，以阿魏酸酯酶(Est1E)作為報(bào)告基因，經(jīng)篩選、鑒定獲得了5個(gè)可以顯著提高外源蛋白表達(dá)量的突變型啟動(dòng)子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47，報(bào)告蛋白Est1E的酶活性是啟動(dòng)子改造前的2.31，2.65，5.01，5.40，5.43倍．隨后測(cè)試了啟動(dòng)子Pm2X47對(duì)外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表達(dá)的影響，結(jié)果顯示這兩種酶的表達(dá)量均有提高，分別是啟動(dòng)子改造前的3.57倍和4.13倍．上述結(jié)果提示，改造后的菊粉酶啟動(dòng)子在提高外源蛋白表達(dá)水平方面具有一定的通用性，可作為新型候選表達(dá)元件，以提升馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)外源蛋白的能力．

馬克斯克魯維酵母； 表達(dá)系統(tǒng)； 啟動(dòng)子； 優(yōu)化改造

基因表達(dá)涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工等多個(gè)方面．轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的早期階段，直接影響蛋白表達(dá)量的多少．轉(zhuǎn)錄效率受到轉(zhuǎn)錄元件的調(diào)控．轉(zhuǎn)錄元件包括啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子等，其中啟動(dòng)子是供RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合的DNA序列，通過(guò)活化RNA聚合酶和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程．啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征決定了它與RNA聚合酶的親和力，進(jìn)而影響目的基因的表達(dá)水平．

常見(jiàn)的啟動(dòng)子基本元件有： 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription Start Site, TSS)、TATA框(TATA-box)、GGGCGG框(GC-box)、CAAT框(CAAT-box)等[1]．轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是與RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)的DNA鏈上的堿基，通常為一個(gè)嘌呤(A或G)，該處序列能夠與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，促使DNA鏈在此解開(kāi)并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[2]．TATA-box在真核生物中一般位于TSS上游25～35bp處，序列通常表現(xiàn)為T(mén)ATAWTAW(W代表A或T)．研究顯示含有TATA-box的基因?qū)D(zhuǎn)錄調(diào)控更加敏感，其能夠與RNA聚合酶和多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(transcription Pre-Initiation Complex, PIC)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始[3-4]．當(dāng)PIC持續(xù)結(jié)合在TATA-box，能重復(fù)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而提高基因的表達(dá)水平．CAAT-box一般位于TSS上游51～169bp處，其一致性序列為GGCTCAATCT．研究發(fā)現(xiàn)，CAAT-box對(duì)堿基突變十分敏感，一旦缺失或突變將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率急劇下降[5-6]．除此之外，啟動(dòng)子上還存在些保守序列如GC-box和增強(qiáng)子．GC-box主要與轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)，而增強(qiáng)子能夠強(qiáng)化基因的轉(zhuǎn)錄起始，無(wú)方向性可位于基因的5’端和3’端．基于啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造，篩選強(qiáng)啟動(dòng)子，是提高外源基因表達(dá)水平的一種重要方法[7]．因此，利用易錯(cuò)PCR(Error Prone PCR, EP-PCR)技術(shù)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行改造構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，已經(jīng)在微生物代謝工程中得到成功應(yīng)用[8-10]．Nevoigt等[11]通過(guò)篩選EP-PCR突變的溶氧敏感型啟動(dòng)子DAN1突變體文庫(kù)，獲得了在微氧條件下能夠誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子突變體，其啟動(dòng)子活性在微氧條件下是野生型啟動(dòng)子的1.8～2.9倍．

馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)是一種食品安全級(jí)酵母，它具有生長(zhǎng)快、生物量高、耐高溫、可利用多種碳源等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域[12-15]．研究發(fā)現(xiàn)，K.marxianus可大量分泌菊粉酶，占胞外蛋白分泌量的50%以上[16]．Bergkamp在該系統(tǒng)中利用菊粉酶啟動(dòng)子成功分泌表達(dá)α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)，表達(dá)量為153mg/L，而來(lái)源于釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK或GAL7，其表達(dá)量平均為2mg/L[17]．本研究利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)菊粉酶啟動(dòng)子進(jìn)行突變改造，優(yōu)化馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)，提高重組蛋白表達(dá)能力，為分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

馬克斯克魯維酵母尿嘧啶缺陷菌株KluyveromycesmarxianusFim1(ura3Δ)，大腸桿菌E.coliDH5α、阿魏酸酯酶Est1E重組質(zhì)粒表達(dá)載體pUKDN112-Est1E(本研究中命名為Pinu-Est1E)、赤霉烯酮降解酶ZHD101重組質(zhì)粒表達(dá)載體pUKDN112-ZHD101(本研究中命名為Pinu-ZHD101)和甘露聚糖酶Mannase330重組質(zhì)粒表達(dá)載體pUKDN112-Mannase330(本研究中命名為Pinu-Mannase330)均由本實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建．

1.1.2 主要試劑

Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme公司)，限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶、Carrier DNA(TaKaRa公司)，GeneMorph II random mutagenesis kit(Agilent公司)，膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒(Simgen公司)，ZR Fungal/Bacterial RNA Mini PrepTM(ZYMO Research公司)，PCR引物和DNA測(cè)序(上海杰李生物技術(shù)有限公司)，多片段DNA一步酶連法[18]所需試劑來(lái)自New England Biolabs、TaKaRa、Inc和Epicentre．其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基： 1%蛋白胨(Polypeptone)，1%氯化鈉(NaCl)，0.5%酵母提取物(Yeast Extract)，pH為7.0，氨芐抗性需加入100μg/mL氨芐西林(Amp)；酵母完全培養(yǎng)基(YPD)： 2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖；SD-Uracil培養(yǎng)基： 0.67%YNB，2%葡萄糖，不含Uracil(尿嘧啶)的混合氨基酸；YD培養(yǎng)基： 2%酵母提取物，4%葡萄糖；若需要固體培養(yǎng)基，可在配制時(shí)加入2%瓊脂糖.

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增菊粉酶啟動(dòng)子Pinu片段

根據(jù)馬克斯克魯維酵母K.marxianus中菊粉酶序列(GenBank AB621573.1)，其翻譯起始密碼子第一個(gè)堿基的前1216bp為啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子易錯(cuò)PCR擴(kuò)增引物Pinu-F(5’-CGCTGCAACGGCATGCCGA-TCGAAAAGGTAAAC-3’)和Pinu-R(5’-AGTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATC-3’)．加樣按GeneMorph II random mutagenesis kit(Agilent公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，突變頻率為每100～500ng模板，其1kb內(nèi)堿基的突變個(gè)數(shù)為4.5～9個(gè)．每50μL反應(yīng)體系為： 5μL 10× MutazymeII reaction buffer；1μL 40mmol/L dNTP Mix；1U MutazymeII DNA polymerase；引物Pinu-F和Pinu-R各15pmol；質(zhì)粒模板Pinu-Est1E為150～200ng，加無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL．反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 3min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min 20s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min．反應(yīng)完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收產(chǎn)物．

1.2.2 啟動(dòng)子突變體文庫(kù)的構(gòu)建

采用特長(zhǎng)引物全質(zhì)粒擴(kuò)增法(Mega-WHOP)[19-20]，以隨機(jī)突變后的目標(biāo)基因Pinu作為雙鏈互補(bǔ)的引物對(duì)，表達(dá)載體Pinu-Est1E作為模板(此模板質(zhì)粒甲基化)，采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出質(zhì)粒的全長(zhǎng)片段；再用DpnⅠ酶處理甲基化質(zhì)粒模板，新擴(kuò)增出的質(zhì)粒因?yàn)闆](méi)有甲基化而被保留．每50μL反應(yīng)體系為： 25μL 2× Phanta Max Buffer；1.5μL 10mmol/L dNTP Mix；PCR產(chǎn)物Pinu大于600ng；質(zhì)粒模板Pinu-Est1E大于100ng；1.5U Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，加無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL．反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃ 5min；95℃ 50s，60℃ 50s，72℃ 10min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min．反應(yīng)完成后，加入1UDpnⅠ，37℃ 2h，消化模板．產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α細(xì)胞，涂布LB(含100μg/mL Amp)平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑單克隆至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每個(gè)孔對(duì)應(yīng)一個(gè)樣本)，送公司進(jìn)行質(zhì)粒抽提，然后采用96孔板酵母化學(xué)轉(zhuǎn)化方法(將Fim1接入到50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，220r/min培養(yǎng)過(guò)夜，次日將過(guò)夜菌轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，全部離心8000r/min 10min，棄上清．用無(wú)菌水洗滌菌體一次，8000r/min 10min棄上清；1× LiAc/TE洗兩遍，8000r/min 10min棄上清；先用排槍吸取5μL已抽提質(zhì)粒加入96孔板中，然后在處理好的菌體中加入200μL載體DNA、25mL PEG溶液和20μL 1mol/L DTT．充分混勻后，排槍吸取200μL混合液加入96孔板中，30℃ 15min，47℃ 15min后，3700r/min 3min離心，棄上清，100μL無(wú)菌水懸浮菌體，然后用釘板將菌體涂布SD-Ura固體平板，30℃倒置培養(yǎng)48h．)，轉(zhuǎn)化至Fim1細(xì)胞，用釘板打點(diǎn)在SD-Ura固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)平板篩選出的陽(yáng)性克隆作為突變株進(jìn)行后續(xù)篩選．菊粉酶啟動(dòng)子部分測(cè)序引物為Pinu-CX-R1(5’-GATTCGCACAGAAACGCCGGATGAC-3’)和Pinu-CX-R2(5’-CTATGTCCTGTAAAGCCATGAATGATG-3’)

1.2.3 高效啟動(dòng)子重組菌株篩選方法

質(zhì)粒Pinu-Est1E的報(bào)告基因是阿魏酸酯酶，以重組菌在YD培養(yǎng)基中發(fā)酵72h后Est1E的酶活作為檢測(cè)對(duì)象，比較啟動(dòng)子突變型菌株與野生型菌株的Est1E酶活．初篩挑單克隆于含600μLYD培養(yǎng)基的24孔板中進(jìn)行發(fā)酵，復(fù)篩挑單克隆于含50mL YD培養(yǎng)基的150mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵．實(shí)驗(yàn)選用阿魏酸-2-氯-對(duì)硝基苯酚酯(CNPF)作為阿魏酸酯酶高通量篩選體系的反應(yīng)底物，它可以真實(shí)反映Est1E的酶活，且410nm處吸光值與Est1E酶活呈劑量依賴(lài)型，即能夠體現(xiàn)各樣本間酶活的差異[21-22]．每200μL反應(yīng)體系： 20μL發(fā)酵液上清，10μL 20mmol/L CNPF，170μL 1×PBST(1×PBS Buffer pH 6.4；2.5% Triton X-100)；37℃ 25min．阿魏酸酯酶相對(duì)酶活=(樣本OD410-陰性對(duì)照OD410)/(野生型OD410-陰性對(duì)照OD410)．

1.2.4 Real-Time PCR檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平

將菌體接種于含YD的試管中過(guò)夜培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)接至150mL搖瓶中，起始OD600=0.1，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期OD600=0.6～0.8時(shí)收菌．用ZR Fungal/Bacterial RNA Mini PrepTM(ZYMO Research)試劑盒抽提RNA，利用反轉(zhuǎn)試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，隨后采用SYBR premix Ex-Taq(TaKaRa)和LightCycler480(Roche)進(jìn)行定量PCR分析，以KmActin作為內(nèi)參，RT-PCR引物序列參見(jiàn)表1．

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 The sequence of RT-PCR primers

1.2.5 高效啟動(dòng)子通用性檢測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建

啟動(dòng)子篩選是以報(bào)告基因Est1E相對(duì)酶活的高低作為篩選依據(jù)，為檢測(cè)高效突變型啟動(dòng)子是否適用于其他外源蛋白，將啟動(dòng)子后報(bào)告基因替換為甘露聚糖酶(Mannase330)和赤霉烯酮降解酶(ZHD101)．用SmaⅠ和NotⅠ雙酶切含有高效突變型啟動(dòng)子的質(zhì)粒，回收大片段．同時(shí)用高保真酶以Pinu-Mannase330和Pinu-ZHD101為模板，克隆兩種外源基因Mannase330和ZHD101并回收，采用一步法重組技術(shù)[18]將質(zhì)粒大片段和目的基因連接起來(lái)．外源基因擴(kuò)增及測(cè)序引物序列均為N112-Gene-F(5’-CA-GTGATCAATTACAAGAGAGACGGTGAC-3’)和N112-Gene-R(5’-GTAAGCAGATCAGATCAAA-GCTTGCGGCC-3’)．

1.2.6 重組菌中甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表達(dá)分析

挑鑒定后的陽(yáng)性重組菌單克隆于50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，220r/min，培養(yǎng)72h，吸取發(fā)酵上清液檢測(cè)酶活．

甘露聚糖酶(Mannase330)酶活檢測(cè)方法——DNS法[23]： 5μL發(fā)酵上清液與145μL 0.5%槐豆膠溶液混合，70℃反應(yīng)10min，立即加入150μL DNS，沸水浴反應(yīng)10min，冷卻后在570nm處測(cè)定吸光度．Mannase330相對(duì)酶活=(樣本OD570-陰性對(duì)照OD570)/(野生型OD570-陰性對(duì)照OD570)．

赤霉烯酮降解酶(ZHD101)酶活檢測(cè)方法——高效液相色譜法分析(HPLC)： 10μL發(fā)酵上清液與90μL 50ng/μL ZEN底物混合，37℃反應(yīng)30min，立即加入100μL乙腈，4℃ 14000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)．HPLC檢測(cè)選用Agilent XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，色譜流動(dòng)相條件： 0～8min(甲醇20%～80%)；8～12min(甲醇80%)；12～16min(甲醇80%～20%)；流速為1mL/min．ZHD101相對(duì)酶活=(陰性對(duì)照峰面積-樣本峰面積)/(陰性對(duì)照峰面積-野生型樣本峰面積)．

2 結(jié) 果

2.1 啟動(dòng)子Pinu突變改造及突變體文庫(kù)的構(gòu)建

利用Agilent隨機(jī)突變?cè)噭┖?，以含有菊粉酶啟?dòng)子序列的載體Pinu-Est1E為模板，模板量為135ng，對(duì)全長(zhǎng)1216bp的菊粉酶啟動(dòng)子進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果如圖1(a)所示．易錯(cuò)PCR產(chǎn)物純化后作為引物，用PCR方法擴(kuò)增表達(dá)載體Pinu-Est1E全序列，產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶消化處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞．隨機(jī)挑取10個(gè)克隆對(duì)啟動(dòng)子段進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)每1kb平均有7個(gè)堿基發(fā)生突變，達(dá)到構(gòu)建突變體文庫(kù)的要求．抽提大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母Fim1細(xì)胞，所有轉(zhuǎn)化子構(gòu)成突變體文庫(kù)(圖1(b))．

圖1 Pinu突變體文庫(kù)在Fim1酵母細(xì)胞中的構(gòu)建Fig.1 Construction of Pinu mutant library in Fim1(a) 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增菊粉酶啟動(dòng)子，M: 1kb DNA marker；1,2: 菊粉酶啟動(dòng)子易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(b) 在96孔板中用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化Fim1酵母細(xì)胞，構(gòu)建啟動(dòng)子突變體文庫(kù)，第一個(gè)為陰性對(duì)照．

2.2 高效菊粉酶啟動(dòng)子突變體的篩選

為得到高效的啟動(dòng)子Pinu，以外源蛋白Est1E的表達(dá)作為報(bào)告蛋白，以其酶活高低作為篩選依據(jù)．本研究對(duì)啟動(dòng)子Pinu進(jìn)行兩輪易錯(cuò)PCR，在第一輪易錯(cuò)PCR中，以野生型啟動(dòng)子Pinu作為模板，在Fim1酵母細(xì)胞中構(gòu)建了第一輪的啟動(dòng)子突變體文庫(kù)，并篩選了3500個(gè)突變體，分析了突變株中Est1E相對(duì)于含野生型菊粉酶啟動(dòng)子菌株(WT)中Est1E的表達(dá)水平(圖2(a)，見(jiàn)第442頁(yè))．經(jīng)初篩和復(fù)篩，獲得2個(gè)阿魏酸酯酶酶活相對(duì)較高的突變株D81和F138，其表達(dá)量是野生型啟動(dòng)子介導(dǎo)的Est1E表達(dá)量的2.31，2.65倍(圖2(c))．

為進(jìn)一步得到更強(qiáng)啟動(dòng)效率的啟動(dòng)子，以D81和F138含有的突變啟動(dòng)子作為混合模板，再次用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段，并在Fim1酵母菌株中構(gòu)建了第二輪易錯(cuò)PCR的啟動(dòng)子突變體文庫(kù)，篩選了3000個(gè)突變體，報(bào)告蛋白Est1E的相對(duì)表達(dá)量如圖2(b)所示．經(jīng)初復(fù)篩后，最終獲得3個(gè)Est1E酶活相對(duì)較高的突變株Q89、M73、X47，其表達(dá)量分別是野生型啟動(dòng)子介導(dǎo)作用下的5.01，5.40，5.43倍(圖2(c))．

同時(shí)，利用RT-PCR對(duì)高效表達(dá)菌株中的Est1E轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株D81、F138、Q89、M73、X47的Est1E的轉(zhuǎn)錄水平較野生型均有很大的提高，分別是野生型的3.8，5.0，5.6，17.7，35.6倍(圖2(d))．說(shuō)明啟動(dòng)子序列發(fā)生的突變，提高了外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而使蛋白的分泌表達(dá)量提高．

圖2 高效菊粉酶啟動(dòng)子的篩選Fig.2 Screening of highly efficient Inulinase promoter(a) 第一輪易錯(cuò)PCR的Pinu突變體庫(kù)篩選，熱譜圖表示了Pinu改造后Est1E酶活變化情況；(b) 第二輪易錯(cuò)PCR的Pinu突變體庫(kù)篩選，熱譜圖表示了Pinu第二次改造后Est1E酶活變化情況；(c) 啟動(dòng)子突變對(duì)Est1E酶活水平的影響；(d) 啟動(dòng)子突變對(duì)Est1E轉(zhuǎn)錄的影響．

2.3 高效啟動(dòng)子序列分析

通過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR改造和篩選，共獲得了5個(gè)阿魏酸酯酶表達(dá)量較高的菌株，其對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子分別為Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47．利用引物Pinu-CX-R1和Pinu-CX-R2對(duì)上述啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序，并與原始的啟動(dòng)子序列(菊粉酶序列GenBankAB621573.1，啟動(dòng)子范圍為331～1546)進(jìn)行對(duì)比，突變體堿基變化如表2所示．結(jié)果表明，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)成功的在Pinu中引入突變，第一輪易錯(cuò)PCR改造后，獲得高效突變型啟動(dòng)子Pm1D81和Pm1F138，突變位點(diǎn)隨機(jī)分布，堿基突變率為0.53%．啟動(dòng)子Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47是在突變啟動(dòng)子Pm1D81和Pm1F138基礎(chǔ)上進(jìn)行第二輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增得到的，其中Pm2Q89有4個(gè)突變點(diǎn)與Pm1F138相同，卻屏蔽了第951位的點(diǎn)突變；Pm2M73、Pm2X47既兼具了Pm1F138的突變位點(diǎn)，同時(shí)也引入了新的突變點(diǎn)，其中Pm2X47有部分突變位點(diǎn)與Pm1D81相同．從總體測(cè)序結(jié)果來(lái)看，突變位點(diǎn)主要集中在啟動(dòng)子序列的1～200bp、600～800bp、900～1200bp區(qū)域內(nèi)．

表2 突變型啟動(dòng)子的突變位點(diǎn)Tab.2 The mutation sites of mutant promoters

注： 菊粉酶啟動(dòng)子全長(zhǎng)1216bp，將第一個(gè)堿基A記為+1，表中A32G表示啟動(dòng)子第32位堿基A突變?yōu)閴A基G．

2.4 高效啟動(dòng)子通用性檢測(cè)

為檢測(cè)突變后的啟動(dòng)子是否可以提高其他蛋白的表達(dá)量，我們抽提了阿魏酸酯酶表達(dá)量最高菌株X47的質(zhì)粒，用SmaⅠ和NotⅠ酶切，回收不含有Est1E編碼基因的質(zhì)粒載體大片段，隨后分別將甘露聚糖酶編碼基因Mannase330(GenBank JQ796716.1)和赤霉烯酮降解酶編碼基因zhd101(GenBank KR363960.1)克隆到回收的載體大片段上，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒Pm2X47-Mannase330和Pm2X47-ZHD101．測(cè)序正確后將質(zhì)粒Pm2X47-Mannase330和Pm2X47-ZHD101分別轉(zhuǎn)入Fim1菌株中，挑取單克隆接種搖瓶，發(fā)酵72h后，取上清分別檢測(cè)酶活．結(jié)果顯示，在突變啟動(dòng)子Pm2X47的介導(dǎo)下，Mannase330和ZHD101的酶活明顯高于野生型啟動(dòng)子Pinu介導(dǎo)下表達(dá)的酶活(圖3(a))，分別是野生型的3.57和4.13倍．

圖3 高效啟動(dòng)子通用性研究Fig.3 Study on the universality of highly efficient promoter(a) 突變啟動(dòng)子Pm2X47對(duì)不同外源蛋白表達(dá)水平提高的影響；(b) 甘露聚糖酶野生型菌株和重組菌株發(fā)酵液上清SDS-PEG，M: pageruler prestained protein ladder；1. Fim1/Pinu-Mannase330發(fā)酵液上清；2. Fim1/Pm2X47-Mannase330發(fā)酵液上清．

同時(shí)，對(duì)Fim1/Pinu-Mannase330和Fim1/Pm2X47-Mannase330表達(dá)的甘露聚糖酶進(jìn)行SDS-PEG電泳檢測(cè)．從蛋白質(zhì)凝膠電泳的結(jié)果來(lái)看，兩株重組菌都能分泌表達(dá)甘露聚糖酶，38kDa處蛋白條帶明顯，且與甘露聚糖酶理論分子量一致．同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)Fim1/Pm2X47-Mannase330菌株甘露聚糖酶的表達(dá)量明顯高于Fim1/Pinu-Mannase330(圖3(b))．這一結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)易錯(cuò)PCR獲得的突變啟動(dòng)子Pm2X47能夠很好地提高外源蛋白的表達(dá)水平，突變啟動(dòng)子Pm2X47具有更高的轉(zhuǎn)錄效率；同時(shí)這種高效的突變啟動(dòng)子也擁有一定的普適性，具有提高多種外源蛋白表達(dá)水平的能力，為馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化提供了高效表達(dá)元件．

3 討 論

蛋白質(zhì)的高效表達(dá)一直是生物研究和工業(yè)應(yīng)用的熱點(diǎn)．蛋白質(zhì)高效表達(dá)系統(tǒng)主要包含兩個(gè)方面： 宿主和載體．馬克斯克魯維酵母比畢赤氏酵母、釀酒酵母、乳酸克魯維酵母等的生長(zhǎng)速率快，同時(shí)具有高生物量、耐高溫、可利用多種碳源等優(yōu)良特性，因此在重組蛋白的工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景[24-27]．調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)的核心元件由啟動(dòng)子、外源基因、信號(hào)肽和終止子等構(gòu)成，外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度有密切的關(guān)系．啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要元件，在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用下與RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合，并指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始．啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)構(gòu)影響其與RNA聚合酶的結(jié)合能力，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)效率．

本研究為獲得效率更高的菊粉酶啟動(dòng)子以提高外源蛋白的表達(dá)水平，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)，在原始Pinu序列中引入隨機(jī)突變，以Est1E作為報(bào)告基因．經(jīng)過(guò)兩輪的易錯(cuò)PCR改造，最終獲得了5個(gè)高效啟動(dòng)子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47，Est1E的酶活分別是啟動(dòng)子改造前的2.31、2.65、5.01、5.40、5.43倍．經(jīng)酶活檢測(cè)和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，第二輪易錯(cuò)PCR改造后產(chǎn)生的有益突變并不如第一輪的多，并且每一輪改造后產(chǎn)生的突變位點(diǎn)隨機(jī)，突變頻率也相對(duì)較高．兩輪易錯(cuò)PCR的反應(yīng)條件及程序雖完全一致，但在相同條件下也可能存在偏好突變位點(diǎn)的情況．真核啟動(dòng)子有些保守區(qū)域如GC-box，該區(qū)域堿基的變化可以控制轉(zhuǎn)錄水平的高低[5-6]．菊粉酶啟動(dòng)子的GC-box在+621～+838bp范圍內(nèi)，5個(gè)突變型啟動(dòng)子在這些區(qū)域均有突變產(chǎn)生，且Est1E酶活上升，可以認(rèn)為是該區(qū)域的點(diǎn)突變提高了啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)了報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄效率．同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47在+112bp處均存在堿基A變?yōu)門(mén)，形成了一個(gè)TATA-box序列(TATATTA)．有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(PIC)持續(xù)結(jié)合在TATA-box上時(shí)，可以使轉(zhuǎn)錄重復(fù)進(jìn)行[3-4]．上述4種啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的促進(jìn)作用可能受該處點(diǎn)突變形成的TATA-box與PIC重復(fù)結(jié)合作用的影響．由于啟動(dòng)子序列上的點(diǎn)突變相對(duì)較為分散且規(guī)律性不強(qiáng)，其對(duì)轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用很有可能是各處點(diǎn)突變及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子共同作用的結(jié)果，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)．

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)易錯(cuò)PCR作為基因工程改造技術(shù)可以有效地優(yōu)化啟動(dòng)子，并且獲得的高效啟動(dòng)子具有一定的普適性．我們用高效啟動(dòng)子Pm2X47介導(dǎo)甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶在Fim1菌株中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與野生型啟動(dòng)子Pinu相比，兩種酶的表達(dá)量都有提高，分別是野生型啟動(dòng)子介導(dǎo)作用下的3.57和4.13倍．這為高效菊粉酶啟動(dòng)子適用于其他異源蛋白高效表達(dá)提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)．通過(guò)對(duì)菊粉酶啟動(dòng)子進(jìn)行改造，馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)在外源基因表達(dá)上有了提升，為該系統(tǒng)在食品醫(yī)藥及工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)．

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StudyontheTransformationandActivityoftheInulinasePromoterinKluyveromycesmarxianus

HUXiaoyue,HUXiaoyu1,2,ZHOUJungang1,2,YUyao1,LüHong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai, 200438,China;2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai, 200438,China)

As a food safety grade yeast,Kluyveromycesmarxianusis a new host system for recombinant protein expression, which has the characteristics of fast growth and high biomass. The promoter is a DNA sequence which is recognized and bound by RNA polymerase that regulates the initiation of transcription and gene expression level. In this study, two rounds of random mutagenesis of the inulinase promoter have been carried out by the error-prone PCR technique. Finally, we got five highly efficient mutant promoters by screening and identification of the expression level of ferulic acid esterase(Est1E). The results showed that the mutant promoters Pm1D81, Pm1F138, Pm2Q89, Pm2M73, Pm2X47 can improve the reporter protein Est1E activity, which were 2.31,2.65,5.01,5.40,5.43 times as much as that of the wild-type promoter. The effect of promoter Pm2X47 on the expression of other exogenous proteins mannanase and zearalenone-degrading enzyme has been tested. The results showed that the Pm2X47-mediated expression of two enzymes were both significantly improved, respectively, 3.57 times and 4.13 times before the transformation of the inulinase promoter. These results indicate that the modified inulinase promoter has a certain universality in improving the expression level of exogenous protein and provides a novel candidate expression element for enhancing the ability of expression of recombinant protein inKluyveromycesmarxianusexpression system.

Kluyveromycesmarxianus; expression system; promoter; transformation and optimization

0427-7104(2017)04-0438-08

2017-01-25

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102803B，2014AA021301)；上海市科委基地項(xiàng)目(13DZ2252000)

胡曉悅(1992—)，女，碩士研究生；呂 紅，女，教授，通信聯(lián)系人，E-mail: honglv@fudan.edu.cn.

Q814

A