劉辰庚++郝婷+楊婷婷++孟雙+王培昌

[摘要] 目的 初步研究外泌體內(nèi)microRNA-135a（miR-135a）跨血腦屏障和細胞轉(zhuǎn)運的現(xiàn)象。 方法 提取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦脊液（CSF）的高miR-135a外泌體，將其注射入野生型小鼠腦室并干預(yù)SH-SY5Y細胞，檢測小鼠外周血和培養(yǎng)基外泌體內(nèi)miR-135a水平及SH-SY5Y細胞β分泌酶-1（BACE-1）的表達和活性。 結(jié)果 高miR-135a外泌體腦室注射能使野生型小鼠CSF和血漿外泌體miR-135a顯著升高（P < 0.05）；經(jīng)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)的SH-SY5Y細胞，其細胞內(nèi)的miR-135a含量顯著高于其他干預(yù)組和對照組（P < 0.05）；SH-SY5Y細胞的BACE-1活性顯著降低（P < 0.05），且其mRNA表達水平的變化趨勢與活性變化趨勢一致。 結(jié)論 外泌體可將腦脊液中的“高miR-135a”這一生物信號跨越血腦屏障傳遞至外周血，這為將血漿外泌體miR-135a作為阿爾茨海默病診斷生物標志物提供了更堅實的實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默??；MicroRNA；外泌體

[中圖分類號] R749 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0022-05

A preliminary study on the cross blood-brain-barrier transport of exosomal microRNA-135a

LIU Chengeng1 HAO Ting2 YANG Tingting1 MENG Shuang3 WANG Peichang1

1.Department of Clinical Laboratory， Xuanwu Hospital， Capital Medcial University， Beijing 100053， China； 2.Department of Pathology， Heze Municipal Hospital， Shandong Province， Heze 274000， China； 3.State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control， National Institute for Communicable Disease Control and Prevention， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206， China

[Abstract] Objective To study the effect of microRNA-135a （miR-135a） on blood-brain barrier and cell transport in exocrine. Methods The high miR-135a exosomes were extracted from the cerebrospinal fluid （CSF） of the transgenic mice and injected into the ventricles of the wild type mice and intervened with SH-SY5Y cells. The levels of miR-135a in the peripheral blood of mice and the exosomes of the culture， and the expression and activity of β-secretase-1 （BACE-1） in SH-SY5Y cells were determined. Results Intraventricular injection of miR-135a exosomes resulted in a significant increase in CSF and plasma exosomal miR-135a in wild-type mice （P < 0.05）. The activity of BACE-1 in SH-SY5Y cells treated with exosomes harvest from the CSF of APP/PS1 double transgenic mice was significantly lower than that in other intervention group and control group （P < 0.05）， and the mRNA expression level of SH-SY5Y cells was significantly lower than that of control （P < 0.05）. The trend of change is consistent with the trend of activity. Conclusion The signal of "high miR-135a" can be transferred from CSF to blood through the blood-brain barrier， which provides a more solid experimental basis for the use of exosomal miR-135a as a biomarker of Alzheimer's disease.

[Key words] Alzheimer′s disease； MicroRNA； Exosome

微小核糖核酸（microRNA，miR）在發(fā)育、分化和衰老等方面都扮演了重要角色[1]。作為重要的神經(jīng)退行性變疾病之一，阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）的發(fā)生發(fā)展也不乏相關(guān)miR的參與[1-2]。本課題組的前期研究表明，miR-135a可抑制重要的AD相關(guān)蛋白——β分泌酶-1（β-site APP cleaving enzyme，BACE-1）的蛋白表達并降低其在細胞內(nèi)的活性，且這種作用是通過其與BACE-1 mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）直接結(jié)合而實現(xiàn)的[1，3]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠具有較典型的AD樣病理學(xué)和行為學(xué)改變，是應(yīng)用較多的AD模型。本課題組研究表明，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和AD患者的腦脊液（cerebro spinal fluid，CSF）中總體miR-135a水平顯著升高，且小鼠和AD患者CSF和血清中泌體（exosome）內(nèi)miR-135a亦升高，提示其可作為AD的潛在生物標志物[3]。但外周血中的核酸來源復(fù)雜，主要包括組織細胞的病理/生理釋放以及細胞死亡/凋亡釋放等來源[4-6]，在前期研究中被檢測到升高的外泌體內(nèi)miR-135a是否主要來自腦脊液，抑或腦脊液中的高miR-135a狀態(tài)是否能直接導(dǎo)致外周血中相應(yīng)指標的改變并未明確[1，3]。本研究主要就腦脊液外泌體內(nèi)miR-135a跨血腦屏障向外周血轉(zhuǎn)運的現(xiàn)象進行初步研究。endprint

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

外泌體提取試劑盒、Trizol、Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國加利福尼亞）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國加利福尼亞）；PBS、小牛血清、蛋白濃度測定試劑盒、引物合成（生物工程公司，中國上海）；miR-135a擬似物、Ce_miR-39（Tiangen，中國北京）；QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen，德國威斯特法倫）；BACE-1活性測定試劑盒（Sigma，美國威斯康星）；立體定位儀（Stoelting，美國伊利諾斯）；羅氏480 PCR儀（Roche，瑞士巴塞爾）；D-8紫外可見分光光度計（菲勒公司，中國江蘇）。

1.2 外泌體提取

9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[SPF級飼養(yǎng)，合格證號：SYXK（京）2014-0036]和9月齡野生型小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，使用立體定位儀抽取CSF；使用眼球摘除法留取肝素抗凝血，于4℃下3000 r/min離心7 min，留取血漿。在無菌環(huán)境下，使用外泌體提取試劑盒分別提取CSF，提取出的外泌體經(jīng)PBS重懸混勻后，再次提取，以去除其他影響因素，再次提取出的外泌體混合物經(jīng)miR-135a濃度測定后使用PBS重懸成105 copy/mL備用。使用立體定位儀將提取自轉(zhuǎn)基因小鼠CSF的外泌體（105 copy/mL miR-135a）注射入野生型小鼠的第三腦室（定位為前囟前2.0 mm，中縫旁2.0 mm，硬膜下4 mm）作為實驗組（5只），使用等體積的PBS注射作為對照組（5只）。6 h和12 h后抽取CSF和血漿標本，提取外泌體[7]。本實驗方案已經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，分別使用來自轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠CSF和血漿的外泌體干預(yù)（miR-135a終濃度為105 copy/L），同時使用miR-135a擬似物及Lipofectamine 2000包裹的miR-135a擬似物作用上述細胞作為對照組，干預(yù)6 h和12 h后提取細胞總RNA，同時提取培養(yǎng)基的外泌體。根據(jù)干預(yù)物的名稱進行分組，實驗組和對照組實驗均重復(fù)5次。

1.4 BACE-1活性測定

使用試劑盒檢測BACE-1的活性，嚴格按照試劑盒說明書操作：使用PBS將提取并經(jīng)離心的細胞總蛋白調(diào)整至5～7 g/L，加入檢測液，使用標準曲線法檢測BACE-1的相對活性（相對熒光值）[1]。

1.5 BACE-1 mRNA定量測定

使用Trizol試劑提取SH-SY5Y細胞總RNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，以GAPDH為內(nèi)參，分別使用qPCR檢測外泌體干預(yù)組和各個對照組BACE-1的mRNA。BACE-1上游引物：3′-AGGCAGTCTCTGGTATACACCCATC-5′，下游引物：3′-T？鄄GCCACTGTCCACAATGCTC-5′，產(chǎn)物長度137 bp；GAP？鄄DH上游引物：3′- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-5′，下游引物：3′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-5′，產(chǎn)物長度138 bp；反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，35個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法進行相對定量[5]。

1.6 小RNA提取及miR-135a定量測定

20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中含RNA模板0.4 ng，20 μL miR檢測體系中含miR cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95℃ 25 s，62℃ 35 s，72℃ 25 s，35個循環(huán)。以提取小RNA前向標本中加入的Ce_miR-39為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計算并統(tǒng)計miR-135a組間表達的差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物標本外泌體內(nèi)miR-135a檢測結(jié)果

提取自9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF外泌體內(nèi)的miR-135a水平顯著高于提取自野生型小鼠CSF和血漿外泌體水平（P = 0.000）。提取自9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠血漿外泌體內(nèi)的miR-135a水平顯著高于提取自野生型小鼠CSF和血漿外泌體水平（P = 0.000）。見表1。

2.2 外泌體干預(yù)動物實驗結(jié)果

經(jīng)高miR-135a外泌體注射的野生型小鼠，其6 h的CSF和血漿外泌體內(nèi)miR-135a水平均顯著高于對照組（P < 0.05）；12 h后，實驗組CSF和血漿外泌體內(nèi)miR-135a水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

與同時間對照組CSF比較，*P < 0.05；與同時間對照組血漿比較，#P < 0.05；CSF：腦脊液

2.3 外泌體干預(yù)細胞實驗結(jié)果

干預(yù)6 h后，使用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)的SH-SY5Y細胞，其細胞內(nèi)miR-135a含量顯著高于其他干預(yù)組和對照組（P < 0.05）；干預(yù)12 h后，細胞內(nèi)miR-135a水平恢復(fù)到基線水平（圖2）。干預(yù)6 h和12 h后，使用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)的SH-SY5Y細胞，其培養(yǎng)基外泌體內(nèi)miR-135a水平與其他來源外泌體干預(yù)組及miR-135a擬似物組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。endprint

與同時間轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)比較，*P < 0.05；與同時間轉(zhuǎn)基因小鼠血漿源外泌體干預(yù)比較，#P < 0.05；CSF：腦脊液

圖2 外泌體干預(yù)細胞實驗結(jié)果（n = 5）

2.4 BACE-1活性和表達

干預(yù)6 h后，經(jīng)提取自9月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF外泌體和Lipofectamine 2000包裹miR-135a擬似物干預(yù)的SH-SY5Y細胞的BACE-1活性顯著低于經(jīng)提取自轉(zhuǎn)基因小鼠血漿及提取自野生型小鼠CSF和血漿外泌體干預(yù)的SH-SY5Y細胞（P < 0.05），且前兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖3）。SH-SY5Y細胞BACE-1 mRNA表達水平的變化趨勢與其活性的變化趨勢一致（圖4）。

與同時間轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)比較，*P < 0.05；與同時間轉(zhuǎn)基因小鼠血漿源外泌體干預(yù)比較，#P < 0.05；CSF：腦脊液

3 討論

作為發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性變疾病，AD在全世界范圍內(nèi)的檢出率均呈上升趨勢。2011年以前，在AD各版診斷標準中涉及的診斷方法主要為行為、精神量表評分和較為昂貴的影像學(xué)檢查；2011年3月，發(fā)布的AD診斷標準中，首次納入了CSF tau蛋白和β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）檢測[8-9]。但CSF tau蛋白和Aβ檢測面臨的現(xiàn)實問題是，作為已經(jīng)出現(xiàn)典型癡呆癥狀A(yù)D患者而言，目前尚無有效的治療手段，患者和家屬往往不配合CSF抽??；而對于AD的早期診斷和篩查而言，受試者也很難同意采用抽取CSF這種有創(chuàng)檢查的方式進行診斷[10-13]。故CSF tau蛋白和Aβ檢測在國內(nèi)開展并不多見。隨著AD生物標志物研究的不斷進展，越來越多的學(xué)者認為應(yīng)尋找可用于AD診斷，特別是早期診斷的無創(chuàng)檢查生物標志物[14]。目前，小分子核酸和特定蛋白在AD診斷中價值的研究逐漸成為熱點。

腦組織中的淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）可通過α和β兩種分泌酶代謝，通過β分泌酶（BACE-1）代謝時，將產(chǎn)生可導(dǎo)致AD的Aβ[15]。有研究表明，AD患者腦組織中的BACE-1表達和活性均顯著升高，提示其可能參與了AD的發(fā)生發(fā)展[16]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a可通過與BACE-1 mRNA的3′-UTR相結(jié)合從而抑制其表達和酶活性；同時，CSF和血清外泌體中miR-135a水平顯著升高，提示miR-135a的升高可能是AD患者腦細胞自我保護的機制之一[17]。

血腦屏障并不允許核酸分子自由通過，為何血清與腦脊液中會出現(xiàn)miR-135a同方向的變化趨勢，該問題尚待解答。已有研究預(yù)測，外泌體可作為細胞間信息傳導(dǎo)及旁分泌的載體[7，18]。本研究通過將提取自AD模型小鼠腦脊液中的高miR-135a外泌體轉(zhuǎn)入正常小鼠腦室，以此觀察高miR-135a外泌體的出現(xiàn)對腦組織BACE-1表達和酶活性的影響，及外泌體是否能將“高miR-135a”這一生物學(xué)信號跨越血腦屏障傳達至外周血。結(jié)果表明，注射入腦室的高miR-135a外泌體可使野生型小鼠腦脊液和血漿內(nèi)外泌體內(nèi)miR-135a均升高，提示外泌體能跨越血腦屏障，且能將高miR-135a這一生物信息傳達至外周血；同時，也能將這一信號傳入腦細胞內(nèi)并發(fā)揮miR-135a的生物學(xué)作用。

有研究提示，外泌體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能將某些病理生理狀態(tài)在細胞間傳遞[19-20]。本研究的細胞實驗結(jié)果表明，使用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CSF源外泌體干預(yù)的SH-SY5Y細胞，其培養(yǎng)基外泌體內(nèi)miR-135a水平與其他干預(yù)組和對照組間無顯著性差異，提示高miR-135a不能改變傳代腦細胞系向外界分泌外泌體內(nèi)的miR-135a水平。如將高miR-135a外泌體的分泌看做細胞發(fā)出的保護信號，那么接收到這些信號的細胞可能并未將其進行再傳遞。

綜上所述，本研究表明，外泌體可將腦脊液中的“高miR-135a”這一生物信號跨越血腦屏障傳遞至外周血，這為將血漿外泌體miR-135a作為AD診斷生物標志物提供了更可靠的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-10 本文編輯：程 銘）endprint