韓長志，趙惠誼

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

昆明市山茶炭疽病菌生物學(xué)特性研究

韓長志，趙惠誼

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

對山茶炭疽病菌Gloeosporiumtheae-sinensisMiyaka生物學(xué)特性進(jìn)行研究。該病菌最適生長條件為PDA、28 ℃、pH7；能在多種碳源和氮源條件下生長，碳源以可溶性淀粉最適，氮源以蛋白胨最適。

茶炭疽盤長孢菌；山茶炭疽病；生物學(xué)特性；昆明市

炭疽病是山茶CamelliajaponicaL.上最常見和發(fā)生最為嚴(yán)重的病害之一，不僅為害其幼嫩葉片和枝梢，而且還可以危害老葉，受害植株出現(xiàn)落葉、落蕾、落花以及枝條枯死等現(xiàn)象，嚴(yán)重降低了山茶的觀賞價值。云南山茶原產(chǎn)云南，作為昆明市的市花，具有較高的觀賞價值。2014年7—8月，調(diào)查昆明市曇華寺公園內(nèi)植物病害的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)山茶炭疽病的發(fā)病率高達(dá)96.8%、病情指數(shù)為30.20，對其病原菌分離鑒定，確定是由茶炭疽盤長孢Gloeosporiumtheae-sinensisT.Miyake引起[1]。學(xué)術(shù)界多從發(fā)病因素[2-3]、防治方法[4-5]等方面開展山茶炭疽病的研究，也有學(xué)者對采自浙江金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院引起該病的病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究[6]。鑒于炭疽病菌在不同地區(qū)具有小種分化等特性[7]，有必要對引起云南山茶炭疽病的病菌開展生物學(xué)特性研究，因此，作者對前期所獲得的山茶炭疽病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行試驗(yàn)，以期為進(jìn)一步開展該病菌遺傳關(guān)系以及防治該病提供重要的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 菌種 山茶炭疽病菌(茶炭疽盤長孢)分離于昆明市曇花寺公園的山茶葉片，將獲得的純培養(yǎng)菌株保存在試管斜面，4 ℃冰箱中保存。菌種保藏于云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，菌種編號SCCG-1。

1.2 病原菌生物學(xué)特性研究 生物學(xué)特性的研究選擇常規(guī)培養(yǎng)基PDA進(jìn)行病菌培養(yǎng)。即，用直徑7 mm的打孔器將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(28 ℃恒溫培養(yǎng)箱、黑暗條件)的病原菌菌落打成菌絲塊接種PDA培養(yǎng)基上(不同的培養(yǎng)基、碳源和氮源測試分別見1.2.1，1.2.5，1.2.6)，28 ℃恒溫培養(yǎng)(不同溫度測試除外)，每種處理5個重復(fù)，培養(yǎng)5 d。觀察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)分析病原菌生長差異。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 選擇5種培養(yǎng)基做比較。

①馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；②馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；③燕麥培養(yǎng)基(OA)：燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；④清水洋菜培養(yǎng)基(WA)：瓊脂粉20 g、水1000 mL；⑤玉米粉培養(yǎng)基(CMA)：玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 將病原菌分別置于5，11，20，25，28，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 在無菌條件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)滅菌的PDA培養(yǎng)基pH值，設(shè)pH值為3，4，5，6，7，8，9，10，11等9個梯度。

1.2.4 不同密封條件對病原菌菌絲生長的影響 采用培養(yǎng)皿Parafilm膠帶封口和不封口兩種方法。

1.2.5 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加碳源為對照，用含有相當(dāng)量碳的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多種碳源代替查氏培養(yǎng)基中蔗糖，做成不同碳源的固體培養(yǎng)基。

1.2.6 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加氮源為對照，用含有相當(dāng)量氮的硝酸銨、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多種氮源代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，做成不同氮源的固體培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用Excel 2007對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理和作圖。所有圖形中的正負(fù)偏差均表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在PDA上生長速度最快，且菌絲最密集；其次為PSA、CMA、WA以及OA(表1、圖1)。

表1 不同培養(yǎng)基對山茶炭疽病菌菌絲生長的影響

注：“+”一般；“++”密；“+++”較密；“++++”緊密。

圖1 不同培養(yǎng)基上病原菌生長對比

2.2 不同溫度對病原菌生長的影響 在20，25，28 ℃條件下，山茶炭疽病菌能正常生長，以28 ℃時菌絲生長速率最大(圖2)，而在5，11，37 ℃條件下，病原菌不能生長。將此3種溫度下培養(yǎng)的病原菌轉(zhuǎn)移至28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)后，菌絲又能恢復(fù)生長，該現(xiàn)象表明山茶炭疽病菌可以暫時忍受5，11 ℃的低溫以及37 ℃的高溫，待外界環(huán)境條件恢復(fù)后依然可以正常生長。

2.3 不同pH對病原菌菌絲生長的影響 以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH3條件下山茶炭疽病菌不能生長，pH4～10時病原菌均能生長，尤以pH為7時菌絲生長速率最大，其次為pH 6，8(圖3)。

圖2 不同溫度對病原菌生長速率的影響

圖3 不同pH培養(yǎng)基上病原菌生長速率

2.4 不同密封條件對病原菌的生長影響 使用parafilm封口膜對培養(yǎng)皿封口條件下，山茶炭疽病菌的生長較不封口好、生長速度更快，平均生長速率為10.44 mm/d。這個結(jié)果表明，不通氣條件更加適宜山茶炭疽病菌的生長。

2.5 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在6種供試碳源的培養(yǎng)基上均能快速生長，尤以可溶性淀粉作為碳源的條件下生長最快，其次是葡萄糖；值得關(guān)注的是，在不加碳源的對照培養(yǎng)基上，盡管該菌菌絲生長速率與添加乳糖、果糖等碳源的培養(yǎng)基的生長速率差別不大，但其所形成的菌落較為稀疏、菌絲顏色較淺(圖4)。

圖4 不同碳源對病原菌生長速率的影響

2.6 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在不同的氮源培養(yǎng)基上生長速率不盡相同，在6種所供試的氮源培養(yǎng)基上，蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基上病原菌生長最快，且菌絲白色、密集，菌落較厚；其次是甘氨酸和酵母膏；硫酸銨和磷酸二氫銨作為氮源不適宜該病原菌生長，出現(xiàn)抑制生長現(xiàn)象(圖5)。與缺乏碳源相似，病原菌在缺乏氮源的培養(yǎng)基上所形成的菌落稀疏，顏色也較淺。

3 結(jié)論與討論

本研究從不同培養(yǎng)基、溫度、pH、密封情況、碳源以及氮源等方面對山茶炭疽病菌的菌絲生長影響進(jìn)行了研究，明確該病原菌生長適宜溫度為28 ℃，溫度低至5 ℃或達(dá)到37 ℃時不能生長；最適pH為7，適合較寬的酸堿度范圍；密封有利于該病原菌生長；能在多種碳源和氮源情況下生長，碳源以可溶性淀粉最適，氮源以蛋白胨最適。該結(jié)果除溫度與前人研究結(jié)果較相似外[6]，其他指標(biāo)均具有較大的差異性，即菌絲生長的最適溫度為25～30 ℃，最適pH為5～6，最適碳源則為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖。

圖5 不同氮源對病原菌生長速率的影響

上述研究結(jié)果為進(jìn)一步開展山茶炭疽病菌的致病基因功能研究提供了重要的培養(yǎng)條件，也為該病菌可危害多種植物提供了重要的理論解釋。盡管如此，尚缺乏開展上述不同條件對山茶炭疽病菌孢子的影響情況分析，有待于今后進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

[1] 韓長志，趙惠誼.昆明市山茶炭疽病病原菌鑒定初報(bào)[J].中國森林病蟲，2016，35(5)：5-6.

[2] 何美仙,羅軍,賈春蕾,等.山茶炭疽病發(fā)病的影響因素研究[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2006(12):22-23.

[3] 何美仙，羅軍，賈春蕾，等.山茶炭疽病發(fā)病因素的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006(10):137-138.

[4] 李景蕻.山茶炭疽病的發(fā)生和防治[J].農(nóng)村實(shí)用技術(shù)，2004,(1):21.

[5] 趙東,徐進(jìn)才.山茶炭疽病發(fā)生及防治技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)，2003(6):24.

[6] 何美仙.山茶炭疽病菌生物學(xué)特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(4):316-318.

[7] 韓長志.炭疽菌屬真菌分類研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].中國植保導(dǎo)刊，2015(6):24-30.

BiologicalcharacteristicsofthepathogenofGloeosporiumtheae-sinensisinCamelliajaponica/

HAN Changzhi,et al.

(Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province;College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

The biological characteristics ofGloeosporiumtheae-sinensis，the pathogen of camellia anthracnose were studied.The results showed that the optimal conditions for the growth of the pathogen was PDA media,28 ℃,pH 7,with carbon source as soluble starch,nitrogen source as peptone.

Gloeosporiumtheae-sinensis;camellia anthracnose;biological characteristics;Kunming city

2015-10-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560211)，云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(50097505)，云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2014015)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(ZK150004)，云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2014Y330)

韓長志(1981—)，男，博士，講師，河北省石家莊人，從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)的科研工作，E-mail:hanchangzhi2010@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0026-03

(責(zé)任編輯 楊靜莉)