陳楊芳，張林松，陳曉風(fēng)，閆麗麗

HPLC法同時測定墓頭回中齊墩果酸和熊果酸的含量

陳楊芳1，張林松1，陳曉風(fēng)1，閆麗麗2

目的建立高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定墓頭回藥材中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。方法采用HPLC色譜法，色譜柱為SilGreen C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（85∶15）為流動相，檢測波長為210 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸分別在0.02510～1.0041 mg/ml、0.02527～1.0109 mg/ml濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系（r=0.99999），平均回收率分別為95.71% [相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）=0.92%，n=6]、96.19%（RSD=1.16%，n=6）。結(jié)論HPLC測定墓頭回藥材中齊墩果酸和熊果酸含量具有靈敏度高、快速、簡便、專屬性強、準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點，可為墓頭回藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

墓頭回；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法；含量測定

墓頭回別名箭頭風(fēng)、九頭鳥、追風(fēng)箭、腳汗草、臭腳跟等，為敗醬科敗醬屬植物糙葉敗醬或異葉敗醬的根。除西藏、青海、新疆外，墓頭回在我國大部分地區(qū)均有分布，其具有燥濕止帶、收斂止血、清熱解毒之功，主治赤白帶下，泄瀉痢疾，瘡瘍腫毒[1]。墓頭回含揮發(fā)油、黃酮、皂苷、萜類等多種化學(xué)成分。主要有效成分為三萜皂苷類，其苷元有齊墩果酸、熊果酸[2]。臨床藥理活性證明，齊墩果酸、熊果酸都具有抗菌消炎、利尿抗水腫、抑制腫瘤細胞生長、保肝、降酶、抗糖化、抗氧化、提高機體免疫力作用[3-10]。目前，關(guān)于墓頭回三萜皂苷成分含量測定的研究主要針對齊墩果酸和總皂苷[11,12]，且報道較少，尚未見關(guān)于墓頭回中熊果酸含量測定的報道。本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），首次建立了同時測定墓頭回中齊墩果酸、熊果酸兩種成分的方法，為墓頭回的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 安捷倫1260 型高效液相色譜儀，XSE205型電子天平（梅特勒-托利多公司），KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ZM200型超離心研磨儀（德國）。

齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110709-201607），熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110742-201622）；收集了不同購買地的墓頭回樣品，其藥材均經(jīng)鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心中藥室陳曉風(fēng)老師鑒定。甲醇為色譜純試劑，水為超純化水，其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：SilGreen C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（85∶15）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μl。

1.2.2對照品溶液的配制 分別精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品適量，加甲醇制成齊墩果酸濃度為1.0041 mg/ml、熊果酸濃度為1.0109 mg/ml的對照品溶液，作為儲備液。臨用時精密吸取適量各對照品溶液混勻，即得混合對照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備 取墓頭回藥材粉末（過4號篩）約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，超聲提取60 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，20 ml/次，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇20 ml，鹽酸4 ml，水浴加熱水解4 h,放冷，加水10 ml，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 ml。合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4方法學(xué)考察

1.2.4.1方法的專屬性 將按上述方法配制的齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液及制備好的墓頭回藥材樣品按1.2.1色譜條件進樣，考察齊墩果酸和熊果酸色譜峰的情況，樣品中是否有相應(yīng)峰的出現(xiàn)及分離度是否良好。

1.2.4.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取1.2.2項下齊墩果酸、熊果酸對照品儲備液適量，分別依次稀釋1、2、10、20、40倍，配制成齊墩果酸對照品濃度分別為：1.0041 mg/ml、0.5020 mg/ml、0.1004 mg/ml、0.0502 mg/ml、0.0251 mg/ml，熊果酸對照品濃度分別為：1.0109 mg/ml、0.5054 mg/ml、0.1011 mg/ml、0.0505 mg/ml、0.0253 mg/ml，進樣20 μl，按1.2.1項色譜條件記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程。

1.2.4.3精密度試驗 精密吸取齊墩果酸濃度為0.1004 mg/ml、熊果酸濃度為0.0505 mg/ml的混合對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.4.4重復(fù)性試驗 取同一批次墓頭回樣品（2號樣品）6份，每份約4 g，分別精密稱定，按照1.2.3項下操作，按上述色譜條件測定,計算墓頭回樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量，算出RSD。

1.2.4.5穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進樣，記錄峰面積，計算RSD，考察樣品放置一段時間后的穩(wěn)定性。

1.2.4.6加樣回收率試驗 取已知含量的墓頭回樣品（2號樣品）6份，每份約2 g，精密稱定，分別精密加入齊墩果酸和熊果酸對照品溶液適量，照1.2.3項下方法操作制備所需溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率。

2 結(jié) 果

2.1方法的專屬性 齊墩果酸、熊果酸對照品色譜峰保留時間與墓頭回樣品相應(yīng)色譜峰保留時間一致，齊墩果酸、熊果酸分離度良好，無雜質(zhì)峰干擾，見圖1。

圖1 對照品與墓頭回藥材中齊墩果酸和熊果酸的高效液相色譜圖

2.2線性關(guān)系考察 齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為Y=490.36802X+11.88715（r=0.99999），Y=401.10999X+1.82674（r=0.99999），分別在0.0251～1.0041 mg/ml，0.0253～1.0109 mg/ml范圍內(nèi)，具有良好線性關(guān)系。

2.3精密度試驗 按照1.2.4.3精密度試驗的方法，齊墩果酸和熊果酸對照品6次峰面積的RSD分別為0.60%、0.80%。

2.4重復(fù)性試驗 按照1.2.4.4重復(fù)性試驗的方法，墓頭回樣品中齊墩果酸和熊果酸的RSD分別為1.10%、1.30%。

2.5穩(wěn)定性試驗 墓頭回樣品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，齊墩果酸和熊果酸的峰面積RSD分別為1.30%、1.50%。

2.6加樣回收率試驗 如表1所示，齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為95.71%（RSD=0.92%，n=6）、96.19%（RSD=1.16%，n=6）。

2.7樣品測定 取所收集的墓頭回樣品，按供試品溶液制備方法制備供試液，按上述高效液相色譜條件測定，計算含量。如表2所示，不同購買地的墓頭回樣品中齊墩果酸、熊果酸的含量均相差較大。

表2 7 批不同購買地的墓頭回樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1流動相的選擇 齊墩果酸與熊果酸為同分異構(gòu)體，分離測定較為困難[13]。本試驗在參考了文獻[14-17]的基礎(chǔ)上對乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺這幾種流動相系統(tǒng)進行了比較篩選，結(jié)果均未得到良好的分離，經(jīng)反復(fù)試驗，以甲醇-0.2%乙酸銨水溶液（85∶15）為流動相，齊墩果酸和熊果酸分離較好。

3.2提取方法的選擇 筆者曾參考文獻[18]，分別用甲醇和乙醇對樣品進行超聲1 h及回流2 h后進樣，齊墩果酸和熊果酸無法有效分離；后改用鹽酸水解的方法，分別對甲醇超聲提取、回流提取、索氏回流提取3種提取方式進行了考察，結(jié)果表明，采用超聲提取時，齊墩果酸和熊果酸的提取率最高，因此建立本文中的提取方法，經(jīng)試驗證實該方法簡單易行。

筆者測定了7批不同購買地的墓頭回樣品的含量，發(fā)現(xiàn)不同購買地的墓頭回藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量存在較大的差異，可能受種屬、采摘時間、存放時間等因素的影響。總之，本試驗首次建立同時測定墓頭回藥材中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，具有準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、特征性強、方法簡便等特點，對墓頭回藥材的質(zhì)量評價具有重要的意義。

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Simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in P. heterophylla by HPLC

CHEN Yangfang1, ZHANG Linsong1, CHEN Xiaofeng1, and YAN Lili2. 1. Zhenjiang Institute for Food and Drug Control, Zhenjiang 212002,China; 2. Jiangsu EHAI Pharmaceutical CO., LTD., Xuzhou 221004, China

CHEN Yangfang, E-mail: 346300606@qq.com

ObjectiveThe objective of this study was to establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous measuring of the concentration of oleanolic acid and ursolic acid in P. heterophylla.MethodsThe analysis was performed on a SilGreen C18(5 μm，4.6 mm×250 mm) chromatographic column with mobile phase consisting of methanol-0.2% ammonium acetate water(85∶15). The detected wavelength was set at 210 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was at 30℃.ResultsThe linearity was good in the ranges of 0.02510～1.0041 mg/ml and 0.02527～1.0109 mg/ml respectively for oleanolic acid and ursolic acid(r=0.99999).The average recovery rates of oleanolic acid and ursolic acid were 95.71% [relative standard deviation (RSD=0.92%,n=6] and 96.19% (RSD=1.16%,n=6) respectively.ConclusionsThe method of HPLC features high sensitivity, time efficiency, simplicity, strong specificity, high accuracy and good repeatability, which can be used for the quality control of P. heterophylla.

R284.2

Key wordsP. heterophylla; oleanolic acid; ursolic acid; high performance liquid chromatography; content determination

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.11.008

1. 212002，江蘇省鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心；2. 221004 徐州，江蘇頤海藥業(yè)有限責(zé)任公司

陳楊芳，E-mail: 346300606@qq.com

（2017-08-28收稿2017-10-13修回）

（本文編輯 付 輝）

國際權(quán)威醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》聚焦創(chuàng)傷救治“中國模式”

近日，國際權(quán)威醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》 （Lancet）刊載了北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科姜保國教授團隊關(guān)于中國交通和公共衛(wèi)生發(fā)展現(xiàn)狀的綜述類文章“中國交通和公共衛(wèi)生：通往健康未來之路”（Transport and public health in China: the road to a healthy future）。這是繼2015年《柳葉刀》刊登中國交通醫(yī)學(xué)文章之后，再一次將目光聚焦到中國交通發(fā)展與嚴重創(chuàng)傷救治體系建設(shè)上。

研究表明，中國交通事故發(fā)生率高，且多為嚴重創(chuàng)傷，常涉及多器官、多系統(tǒng)的損傷，因此就需要多學(xué)科聯(lián)合進行科學(xué)、規(guī)范的整體性救治。但是，在我國整體創(chuàng)傷救治中，存在著院前急救不規(guī)范、院前救治人員缺乏規(guī)范化培訓(xùn)等問題。該綜述指出，隨著城市路網(wǎng)的擴大和個人機動交通工具保有量的增加，應(yīng)急響應(yīng)系統(tǒng)及創(chuàng)傷救治系統(tǒng)的不完備使事故致傷風(fēng)險進一步加劇，因此，亟待建立完善的道路交通事故創(chuàng)傷緊急救治系統(tǒng)。

姜保國教授于2005年創(chuàng)建了北京大學(xué)交通醫(yī)學(xué)中心（現(xiàn)為北京大學(xué)創(chuàng)傷救治中心），并提出在我國建立“以綜合醫(yī)院為核心的閉環(huán)式區(qū)域性創(chuàng)傷救治體系”的創(chuàng)新核心理念，制定嚴重創(chuàng)傷救治規(guī)范及自主研發(fā)信息聯(lián)動系統(tǒng)，率先提出在城市區(qū)域綜合醫(yī)院建立創(chuàng)傷救治團隊替代獨立創(chuàng)傷救治中心的新模式。在此框架下救治創(chuàng)傷患者7萬余人，從根本上改變了中國嚴重創(chuàng)傷救治的現(xiàn)狀和流程，使創(chuàng)傷平均救治時間縮短了50%，嚴重創(chuàng)傷救治的院內(nèi)平均病死率下降了40%。

據(jù)了解，該嚴重創(chuàng)傷救治“中國模式”已申請并獲得教育部中國創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)“十三五”規(guī)劃“嚴重創(chuàng)傷區(qū)域性救治體系建設(shè)”項目課題立項，并授權(quán)成立“中國創(chuàng)傷救治聯(lián)盟”。北京大學(xué)創(chuàng)傷救治中心、北京大學(xué)人民醫(yī)院聯(lián)合全國百余家大型醫(yī)院啟動了“安全中國，百縣工程”，該工程在以全國超過100個縣域為主的城市建立區(qū)域性嚴重創(chuàng)傷救治體系，帶動縣域醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)水平和公共衛(wèi)生應(yīng)急能力的提升，讓更多基層百姓受益。

（宋昕）