狄桂蘭，張朝霞，孔祥會，虞晉晉，陳海陽，柯才煥

( 1. 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007; 2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005 )

方斑東風(fēng)螺“脫殼病”病原及病理初步研究

狄桂蘭1，張朝霞2，孔祥會1，虞晉晉2，陳海陽2，柯才煥2

( 1. 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007; 2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005 )

為明晰方斑東風(fēng)螺“脫殼病”的病原或病理，對東風(fēng)螺“脫殼病”進(jìn)行了病原分離純化、病原菌形態(tài)觀察、組織病理觀察、人工感染試驗，并對病原菌16S rDNA 序列進(jìn)行 PCR 擴增和測序，以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。試驗中分離純化了3種純菌W、B、Y。致病菌W桿狀，端生單鞭毛。致病菌Y桿狀，兩端略尖，周生菌毛。致病菌B短桿狀，無鞭毛。結(jié)果顯示，患病個體和人工感染個體的腹足及連殼肌肉組織均出現(xiàn)明顯病變，肌纖維受損，出現(xiàn)空腔，并存在細(xì)菌；肝胰腺組織無明顯病變，但血細(xì)胞顯著減少。腹足肌注射人工感染試驗結(jié)果表明，致病菌W在3種細(xì)菌中毒力最強?；旌暇腥镜亩玖υ诨旌媳壤咏急壤龝r達(dá)到最大。致病菌B與報道的鮑希瓦氏菌相似度為99%；致病菌Y與報道的哈維弧菌相似度為98%；致病菌W與報道的變形假單胞菌相似度為99%。推測致病菌W、B、Y可能是此次方斑東風(fēng)螺脫殼病的重要病原菌。

方斑東風(fēng)螺；脫殼?。?6S rDNA 序列分析；病原；組織病理

方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)屬腹足綱、新腹足目、蛾螺科，是熱帶、亞熱帶種類，在我國主要分布在福建、廣東和廣西沿海，為名貴貝類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、口味鮮美、營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值高。近年來，因過度捕撈使方斑東風(fēng)螺的自然資源大大減少，需要對方斑東風(fēng)螺進(jìn)行人工養(yǎng)殖以滿足人們的需要。福建、廣東、廣西及海南的東風(fēng)螺養(yǎng)殖已具規(guī)模，尤其在海南省形成了較大的養(yǎng)殖規(guī)模， 現(xiàn)有養(yǎng)殖水池面積約3.0×105m2， 產(chǎn)值超過2億元[1]。隨著方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，病害相隨而至，常給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成毀滅性的破壞[2]。疾病的種類越來越多，危害也日益嚴(yán)重，已報道的方斑東風(fēng)螺疾病病原已有近10種，如浮游期纖毛蟲病[3-4]，稚螺和幼螺養(yǎng)殖期肉殼分離病[5]，養(yǎng)成期單孢子蟲(Haplosporidiumsp.)病[6]、吻管水腫病[7]、腫吻病[8],除此之外，還存在弧菌(Vibrio)爆發(fā)癥、膿皰病、足部腫大癥和呼吸管炎等疾病[9-10]。2005—2006年20%以上的養(yǎng)殖場爆發(fā)疾病，部分養(yǎng)殖場甚至絕收，造成的經(jīng)濟損失達(dá)千萬元以上[11]。2011年4月，海南文昌等地工廠化養(yǎng)殖的方斑東風(fēng)螺大面積爆發(fā)疾病[12]，養(yǎng)殖病害已成為影響我國南方沿海省市東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的“瓶頸”問題。其中脫殼病(肉殼分離疾病)就是最常見、最嚴(yán)重的一種，造成的經(jīng)濟損失占60%以上，是目前制約東風(fēng)螺人工養(yǎng)殖規(guī)?；a(chǎn)的主要因素[2，11]。病螺癥狀為軟體自行脫離螺殼，離開螺殼后軟體外觀完整，能正常爬行，能吸附池壁或潛埋于底沙，但不攝食，主要發(fā)生在殼高0.5 cm以下的稚、幼螺階段，嚴(yán)重時可造成螺苗在短時間內(nèi)大量死亡[2]。針對東風(fēng)螺稚螺常見的脫殼性流行病，羅杰等[13-14]提出主要原因是水溫升高、底質(zhì)惡化；黃進(jìn)光等[15]認(rèn)為鹽度下降、營養(yǎng)不良也可造成該流行病爆發(fā)；楊章武等[2]認(rèn)為，東風(fēng)螺脫殼病存在生物性病原的可能性比較小，東風(fēng)螺水泥池人工養(yǎng)殖脫殼病的病因?qū)儆诰C合性因素，是綜合性因素造成的不適環(huán)境條件長期作用的結(jié)果。裴琨[9]認(rèn)為該病屬于腸胃炎病。根據(jù)鄭雅友等[16]的研究，多種常用水產(chǎn)藥物對該病并無明顯的治療效果，對病螺的初步檢測，未發(fā)現(xiàn)異常菌群。黃郁蔥[17]自脫殼病螺分離到3株弧菌(Vibrio)，感染試驗結(jié)果是東風(fēng)螺未被感染，據(jù)此認(rèn)為“脫殼病”并非細(xì)菌感染造成。王國福等[11]從病害微生物角度對患病螺進(jìn)行了病毒和細(xì)菌的分離培養(yǎng)，結(jié)果并未分離到病毒；細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定為弧菌，但分離獲得的弧菌應(yīng)用于健康螺未見感染癥狀，筆者認(rèn)為病毒和弧菌并不是方斑東風(fēng)螺肉殼分離病的原發(fā)性誘因。

目前，對東風(fēng)螺脫殼病的研究還不夠深入，而對東風(fēng)螺“殼肉分離癥”有防治方法報道，但尚未找到確切病原[1-2,11]，確定東風(fēng)螺脫殼病的病因或病原還有待于進(jìn)一步的研究。筆者通過對福建晉江爆發(fā)的東風(fēng)螺脫殼病進(jìn)行病原分析，探索該病的病原和病理，為東風(fēng)螺脫殼疾病研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 方斑東風(fēng)螺

病螺樣品取自晉江養(yǎng)殖廠，殼長(2.04±0.31)cm，體質(zhì)量(2.18±1.18) g。在同一養(yǎng)殖場取相同規(guī)格健康螺作為對照。

人工感染試驗所用健康螺，購于廈門海滄養(yǎng)殖廠，平均殼長(1.6±0.2) cm，平均肉質(zhì)量(0.5±0.03) g。暫養(yǎng)于廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院生態(tài)養(yǎng)殖基地，水溫20.0～30.0 ℃，鹽度28.3～35.1，pH 7.8～8.5，充氣，投喂牡蠣、魚等。

1.1.2 培養(yǎng)基

硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

剪取瀕死病螺的肌肉、肝胰腺等組織小塊(2 mm×3 mm×3 mm)，用無菌海水沖洗，于1.5 mL無菌離心管中剪碎后進(jìn)行組織勻漿，提取勻漿液，用涂布法接種于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板。28 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落顏色和菌落特征。挑取菌落分離純化3次，編號后接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上。

用無菌生理鹽水將28 ℃培養(yǎng)24 h的菌從斜面上沖下，制成菌懸液。菌懸液和無菌甘油以5∶4配比后分裝于1.5 mL的無菌離心管中，于-70 ℃存放。

1.2.2 病原的觀察

菌懸液制備同1.2.1。將菌懸液滴在取樣板上，將覆有Foumovar膜的銅網(wǎng)反扣在懸液上。10 min后吸去多余液體，置2%的磷鎢酸液滴上負(fù)染5 min，用濾紙吸去余液，室溫晾干，JEM-100CX電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 組織病理觀察

挑取瀕死病螺，無菌剪取肝胰腺、連殼肌、腹足肌等組織小塊(2 mm×3 mm×3 mm)，浸于波恩氏液中，固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片5～7 μm，蘇木素—伊紅對染，用Leica自動染色機對制片進(jìn)行復(fù)水、染色、脫水，中性樹脂封片保存。用健康螺的同樣組織做對照。用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4 回歸感染

養(yǎng)殖條件：試驗用紅色小桶體積為4.5 L，海水鹽度30，pH 8.0～8.4，水溫為22～25 ℃，不投喂。

制作病原菌的密度標(biāo)準(zhǔn)曲線：菌懸液制備同1.2.1。采用光電比濁計數(shù)法[18]制作病原菌密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將一部分菌懸液原液稀釋為不同倍數(shù)，用721型分光光度計測其在波長為560 nm下的吸光值A(chǔ)。另一部分原液用平板計數(shù)法[18]求出原液中細(xì)菌密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.1 純菌懸液及混合菌懸液的制備

純菌懸液：以菌株W為例，將分離純化的菌株W接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，制成菌懸液。用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出原液密度。原液分別稀釋1.25倍、1.43倍、1.67倍、2倍、2.5倍、3.3倍、5倍，待用。菌株B原液稀釋后測吸光值，原液分別稀釋2倍、12.5倍、14.3倍、16.7倍、25倍、33.3倍、50倍。菌株Y原液稀釋后測吸光值，原液分別稀釋2.9倍、3.5倍、4.4倍、8.8倍。

混合菌懸液：以菌株W與菌株B混合為例，兩株菌的純菌懸液制備同上。取菌株W的2.5倍和5倍稀釋液，分別與菌株B的12.5倍、14.3倍、16.7倍、25倍、33.3倍、50倍稀釋液等體積混勻，待用。菌株W與菌株Y混合時，同樣取菌株W的2.5倍和5倍稀釋液，分別與菌株Y的2.9倍、3.5倍、4.4倍、8.8倍稀釋液等體積混勻。

1.2.4.2 菌懸液的回歸感染

以足部注射方式對健康螺進(jìn)行感染，每個螺肉平均質(zhì)量0.5 g，各注射25 μL樣品液，注射后前24 h每6 h觀察一次，24～48 h每小時觀察一次，48～72 h每6 h觀察一次，72 h以后每24 h觀察一次。試驗持續(xù)14 d。

純菌感染：以純菌W感染為例，共設(shè)11組試驗組，每組20個螺(設(shè)置3個平行)。注射配制好的純菌懸液共9組，設(shè)2組對照，1組為原液密度滅活菌株W的菌懸液(沸水浴20 min滅活)，1組注射0.9%無菌生理鹽水。觀察病螺的病癥，記錄螺的死亡時間，取剛死東風(fēng)螺的肝胰腺、腹足肌等組織，制作組織切片，操作同1.2.3。純菌B、Y感染各設(shè)8組試驗組，每組10個螺(設(shè)置3個平行)，菌株B對照為原液密度的滅活菌株B的菌懸液，菌株Y對照為原液密度的滅活菌株Y的菌懸液。

混合菌感染：以菌株B、W混合感染為例，共設(shè)12組，每組注射20個螺(設(shè)置3個平行)，11組分別注射不同密度比例的混合菌懸液，對照組注射生理鹽水。觀察病螺的癥狀，記錄螺的死亡時間，取剛死螺的內(nèi)臟，制作組織切片，操作同1.2.3。菌株W、Y混合感染共設(shè)9組，每組10個螺(設(shè)置3個平行)。

充氣影響：共設(shè)4組，每組10個螺(設(shè)置3個平行)。兩組注射純菌W的3.3倍稀釋液，兩組注射0.9%無菌生理鹽水，其中一組純菌W感染和一組無菌生理鹽水不充氣。記錄螺的死亡時間和數(shù)量。

1.2.5 16S rDNA序列測定與分析

1.2.5.1 細(xì)菌模板 DNA的提取

用1.0 mL TE緩沖液收集菌懸液于1.5 mL EP管中，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，用0.6 mL TE緩沖液重懸；將菌液沸水浴10 min，置于-20 ℃冰箱20 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸上清液1 mL做為PCR模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 PCR的擴增和測序

選擇通用引物進(jìn)行PCR擴增。引物由上海生物工程公司合成。

Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

Primer B：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物按DNA 凝膠回收試劑盒說明書回收和純化，將所得菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，對于出現(xiàn)雜合的樣品進(jìn)行克隆后再測序。

1.2.6 菌株 16S rDNA 序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

所測序列用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的 BLAST 程序進(jìn)行16S rDNA 序列比對，分析其與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性。選取相似性相對較高且代表性較好的序列，使用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建Fasta格式數(shù)據(jù)文件。用Mega 6.0軟件，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并通過自舉法進(jìn)行置信度檢測，使用1000次的自展測試進(jìn)化樹的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 病螺癥狀

發(fā)病養(yǎng)殖場患病螺癥狀為腹足發(fā)硬，觸覺反應(yīng)遲鈍，黏液分泌增多，部分個體吻伸出或腫大，少數(shù)個體脫殼，脫殼個體占患病螺數(shù)的20%以下(圖1)。

圖1 正常(a)和發(fā)病(b)的方斑東風(fēng)螺

2.2 病原的分離與觀察

2.2.1 病原菌的分離純化

通過分離純化得到3株純菌，根據(jù)菌落在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上的顏色，將其編號為B(黑色)、W(白色)、Y(黃色)(圖2)。在平板面積上，菌落B 40個，菌落W 14個，菌落Y 1204個(圖2)。

B菌落大小0.5～2.5 mm，圓形，不透明，黑色，邊緣光滑。W菌落大小2～6 mm，近似圓形，不透明，乳白偏粉紅色，邊緣不光滑，細(xì)鋸齒狀。Y菌落大小1～2 mm，近似圓形，不透明，黃色，邊緣不光滑，細(xì)鋸齒狀。

圖2 分離病原菌的培養(yǎng)基平板

2.2.2 病原的觀察

在電鏡下可清晰看到3株菌的形態(tài)。菌株W桿狀，端生單鞭毛，大小為0.6～1 μm×2～2.5 μm(圖3a)。菌株Y桿狀，兩端略尖，周生菌毛，大小為0.8～1 μm×3～5 μm(圖3b)。菌株B短桿狀，無鞭毛，大小為0.6～0.8 μm×1～2 μm(圖3c)。

圖3 電鏡下的3種菌的形態(tài)a，菌株W形態(tài)；b，菌株Y形態(tài)；c，菌株B形態(tài).

2.3 組織病理觀察

組織病理觀察見圖4，與健康螺比較，患病螺和感染螺腹足肌肉組織出現(xiàn)明顯病變，并能觀察到大量細(xì)菌。健康螺腹足肌組織較致密，主要由大量橫縱排列的肌纖維組成，最外面一層為致密上皮細(xì)胞，具少量皺襞。肌纖維排列有序，細(xì)胞核圓形或長條形，散布在肌纖維之間(圖4a)。患病螺腹足肌組織內(nèi)大量小空腔，空腔內(nèi)存在少量細(xì)菌(圖4b)。人工感染螺腹足肌纖維出現(xiàn)裂縫或空腔，其內(nèi)可觀察到成團的細(xì)菌，由于空腔的存在，使肌纖維排列失去規(guī)律而紊亂(圖4c,d)。

圖4 正常和發(fā)病方斑東風(fēng)螺腹足肌組織學(xué)變化a，正常東風(fēng)螺腹足肌組織，較致密，肌纖維排列有序；b，患病東風(fēng)螺腹足肌組織，存在小空斑，內(nèi)可見細(xì)菌；c、d，人工感染東風(fēng)螺腹足肌組織，存在小空斑，內(nèi)可見細(xì)菌.箭頭示細(xì)菌，V示空斑.

患病螺和感染螺的連殼肌組織內(nèi)均可觀察到較為明顯的病變，健康螺的連殼肌組織同腹足肌，較致密，由大量橫縱排列的肌纖維組成，肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列有序，細(xì)胞核圓形或長條形，散布在肌纖維之間(圖5a)?；疾÷葸B殼肌組織均出現(xiàn)小裂縫或小空腔，附近存在少量細(xì)菌(圖5b)，感染螺的組織中癥狀與患病螺類似，但更為明顯，肌纖維被細(xì)菌腐蝕斷裂，繼而擴大為空腔(圖5c,d)。

對比患病螺、感染螺和健康螺的肝胰腺組織，健康螺肝胰腺細(xì)胞形狀雖大小不一，但排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可見眾多血細(xì)胞存在于結(jié)締組織中和肝胰腺組織細(xì)胞間(圖6a)?；疾÷莞我认俳M織無明顯病變，但組織內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量極少，未觀察到細(xì)菌(圖6b)。感染螺癥狀與患病螺相似，血細(xì)胞數(shù)量極少，未觀察到明顯病變，但可觀察到少量細(xì)菌(圖6c,d)。

圖5 正常和發(fā)病方斑東風(fēng)螺的連殼肌組織學(xué)變化a，正常東風(fēng)螺連殼肌組織，肌纖維結(jié)構(gòu)完整；b，患病螺連殼肌組織，肌纖維受到腐蝕；c、d，人工感染螺連殼肌組織.箭頭示細(xì)菌，V示空斑.

圖6 正常和發(fā)病方斑東風(fēng)螺的肝胰腺組織學(xué)變化 a，正常螺的肝胰腺組織，存在大量血細(xì)胞；b，患病螺的肝胰腺組織；c，回歸感染死亡的螺的肝胰腺組織；d，為c的放大圖.箭頭示細(xì)菌, CA示結(jié)締組織.

2.4 菌懸液的回歸感染

2.4.1 純菌懸液的回歸感染

純菌W回歸感染死亡結(jié)果見表1。當(dāng)注射密度低于2×107cfu/g時，無死亡。隨著注射密度的增大，死亡率由2×107cfu/g時的10%逐步提至8×107cfu/g時的70% (表1)。同時，最初死亡時間呈現(xiàn)提前趨勢，由2×107cfu/g時的33 h提前至6×107cfu/g時的17 h，并穩(wěn)定在17 h，不再隨注射密度的增加而提高(表1)。死亡出現(xiàn)在17～46 h，并集中出現(xiàn)在17～33 h，即螺在2 d內(nèi)死亡，2 d后螺不再出現(xiàn)死亡。對照組無死亡。

純菌B回歸感染死亡結(jié)果見表2。當(dāng)注射密度低于6×107cfu/g時，無死亡。注射密度6×107cfu/g時，最初死亡時間為60 h。當(dāng)注射密度5×108cfu/g時，27 h出現(xiàn)死亡，并于63 h全部死亡。隨著注射密度增加，死亡率上升，死亡時間提前。對照組無死亡。

純菌Y回歸感染死亡結(jié)果見表3。當(dāng)注射密度低于4×107cfu/g時，沒有死亡發(fā)生，注射密度4×107cfu/g時，最初死亡時間為33 h，當(dāng)注射密度1.75×108cfu/g時，最初死亡時間為45 h。對照組無死亡。

表1 純菌W菌懸液回歸感染結(jié)果

注：表中死亡數(shù)為3組的平均值，余同.

表2 純菌B菌懸液回歸感染結(jié)果

表3 純菌Y菌懸液回歸感染結(jié)果

2.4.2 混合菌懸液回歸感染

混合菌懸液W∶B回歸感染的死亡結(jié)果見表4。W菌懸液注射密度5×106cfu/g時無死亡，與B菌懸液的混合密度比高于1∶8時，無死亡，達(dá)到1∶8時，死亡率20%，混合密度比為1∶12時，死亡率50%。故隨著混合懸液中菌株B的密度比例的增加，死亡率呈上升趨勢。同時，最初死亡時間由混合密度比1∶8時的36 h提前至1∶12時的27 h。W菌懸液注射密度為2×107cfu/g時，死亡率為10%，W、B菌懸液混合感染與純菌感染不同，隨著混合菌懸液中B菌懸液密度比例的增加，死亡率先升后降，死亡率達(dá)到最大值60%時對應(yīng)的密度混合比為1∶3，最接近原始比例(表4)。最初死亡時間也與純菌感染不同，沒有呈現(xiàn)與注射密度的正比關(guān)系。B菌懸液注射密度6×107cfu/g時死亡率20%，當(dāng)與W菌懸液混合以密度比例為12∶1時，死亡率增加至50%，當(dāng)混合密度比例達(dá)3∶1時，死亡率增加至60%，可見當(dāng)B菌懸液密度不變時，死亡率隨W菌懸液密度的增加而略有上升。死亡集中出現(xiàn)在24～42 h，晚于W菌懸液感染。對照組無死亡。

表4 混合菌懸液W∶B致病性分析結(jié)果

注：為方便數(shù)據(jù)比較，表中純菌感染試驗數(shù)據(jù)參考表1、表2純菌感染試驗，余同.

混合菌懸液W∶Y回歸感染的死亡結(jié)果見表5。當(dāng)致病菌W菌懸液注射密度為5×106cfu/g時，混合密度比為1∶4時有一例死亡，隨致病菌Y菌懸液比例增加，未發(fā)現(xiàn)死亡，混合密度比達(dá)1∶35時死亡率90%。當(dāng)致病菌W菌懸液注射密度為2×107cfu/g時，隨著致病菌Y菌懸液密度比例的增加，死亡率呈上升趨勢，死亡率達(dá)90%時混合密度比約為1∶9，最接近原始比例。最初死亡時間呈提前的趨勢，由混合密度比1∶1時的21 h提前到1∶3時的18 h，但隨著致病菌Y菌懸液比例的增加，死亡時間不再提前。當(dāng)致病菌Y菌懸液密度不變時，死亡率隨致病菌W菌懸液密度的增加有不等上升。而致病菌W菌懸液感染注射密度2×107cfu/g時，死亡率為10%，最初死亡時間30 h；致病菌Y感染注射密度1.75×108cfu/g時，死亡率為20%，最初死亡時間45 h；兩者混合感染死亡率達(dá)90%，大于前兩者死亡率之和，同時最初死亡時間18 h，分別提前了12 h和27 h，表明混合了致病菌W菌懸液的致病菌Y菌懸液的死亡率比同等密度的純菌感染有明顯提高，且死亡時間提前。死亡時間集中在18～48 h，對照組無死亡。

2.4.3 充氣對W菌懸液回歸感染的影響

充氣對W菌懸液回歸感染的影響結(jié)果見表6。充氣的致病菌W菌懸液感染死亡率為40%，不充氣的致病菌W菌懸液感染死亡率為70%，比前者提高30%，生理鹽水對照組均無死亡。試驗表明，缺氧降低了東風(fēng)螺對細(xì)菌的耐受性，提高螺的死亡率，但充氣不是決定性因素。

表5 混合菌懸液W∶Y致病性分析結(jié)果

表6 充氣與否對W致病菌回歸感染試驗的影響

2.5 16S rDNA序列測定結(jié)果

利用細(xì)菌16S rDNA通用引物對分離的3株菌進(jìn)行PCR擴增，挑選陽性克隆菌落送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序，得到DNA序列。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將序列提交至GenBank進(jìn)行同源性比對，致病菌B與報道的鮑希瓦氏菌(Shewanellahaliotis)相似度為99%；致病菌Y與報道的哈維弧菌(V.harveyi)相似度為98%；致病菌W與報道的變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)相似度為99%。選擇了19個同源性較高的典型菌株序列,利用Clustal X進(jìn)行多序列比對,再利用Mega 6.0繪制進(jìn)化樹(圖7～圖9)。

圖7 菌株B的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖8 菌株Y的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖9 菌株W的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討 論

3.1 東風(fēng)螺脫殼病癥狀及流行性分析

東風(fēng)螺本次發(fā)病癥狀為不鉆入底質(zhì)，食量減小，腹足發(fā)硬，觸覺反應(yīng)遲鈍，黏液分泌增多，部分個體吻伸出或腫大，少數(shù)個體脫殼，脫殼個體占患病螺數(shù)的近20%。與養(yǎng)殖戶所說的弧菌爆發(fā)病癥狀食量減小、不鉆沙、無力狀、吻伸出類似。與裴琨[9]描述的腸胃炎也有一定相似性：食道發(fā)炎、紅腫、伸縮困難、不能收回內(nèi)臟；腸胃充血、發(fā)炎、潰爛；死螺的肉與殼分離[9]。但此次試驗未觀測病螺腸胃，故無法判斷是否為腸胃炎，而裴琨[9]并未找到腸胃炎的病因。感染試驗的死亡螺癥狀與患病螺相似，注射后主要表現(xiàn)為不鉆入底質(zhì)、腹足僵硬、吻伸出、觸覺反應(yīng)遲鈍，黏液分泌增多，但不出現(xiàn)脫殼，而是少量個體出現(xiàn)足部膿皰。不出現(xiàn)脫殼癥狀的原因可能是由于季節(jié)差異，脫殼性流行病大多發(fā)生在秋冬季[19]，而回歸感染試驗則是在4月、5月進(jìn)行。在方斑東風(fēng)螺的養(yǎng)殖過程中，腫吻病和脫殼病常共同存在，可能是分離的3種致病菌為腫吻病的致病菌。也可能殼肉分離與非生物因素和非細(xì)菌性的因素等綜合因素有關(guān)[20-21]。

3.2 東風(fēng)螺脫殼病組織病理分析

東風(fēng)螺肝胰腺組織切片病理觀察發(fā)現(xiàn)，患病螺和感染螺與健康螺的區(qū)別主要在于組織內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量的多寡，健康螺肝胰腺組織中存在一定數(shù)量的血細(xì)胞，而患病螺和感染螺肝胰腺組織內(nèi)血細(xì)胞稀少。在腹足類免疫中，血細(xì)胞具有重要的作用，主要有吞噬、囊化、組織修復(fù)等功能[22]。因此，患病螺和感染螺肝胰腺組織內(nèi)的血細(xì)胞可能集中到病灶處行使吞噬、囊化等免疫功能而受到損傷，從而造成肝胰腺組織內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量劇減。

3.3 純菌懸液的回歸感染

在病原分離的硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖—瓊脂培養(yǎng)基平板面積上，致病菌B菌落40個，致病菌W菌落14個，致病菌Y菌落1204個，致病菌W菌落的比例最小。同時對比純菌回歸感染試驗結(jié)果，致病菌W菌懸液注射密度4×107cfu/g時，死亡率40%，最初死亡時間18 h；致病菌Y菌懸液注射密度4×107cfu/g時，死亡率20%，最初死亡時間33 h；致病菌B菌懸液注射密度6×107cfu/g時，死亡率20%，最初死亡時間60 h。在同等密度或更低密度下，致病菌W菌懸液感染的死亡率均比致病菌Y菌懸液和致病菌B菌懸液高，最初死亡時間均較早。綜上推測，W菌懸液是3株菌中對東風(fēng)螺毒力最強的一株。

3.4 混合菌懸液的回歸感染

致病菌W菌懸液回歸感染試驗結(jié)果在3株菌中最為典型，死亡率與注射密度成正比，最初死亡時間與菌懸液密度成反比，符合一般的線性規(guī)律。而兩種混合菌組合感染結(jié)果均呈現(xiàn)非線性關(guān)系，在致病菌W、B菌懸液組合中，致病菌W菌懸液注射密度為1.2×107cfu/g時，死亡率為10%，隨著混合菌懸液中致病菌B菌懸液密度比例的增加，死亡率先升后降，最大值60%對應(yīng)的密度混合比例1∶3，最為接近原始比例(14∶40)。在致病菌W、Y菌懸液組合中，死亡率最高值90%分別在致病菌W菌懸液低密度組的1∶35密度混合比例處和菌W高密度組的1∶9密度混合比例處出現(xiàn)，最為接近原始比例(14∶1204)。據(jù)此可以推測，各株致病菌可能存在協(xié)同作用，且在混合密度比例接近原始比例時對東風(fēng)螺的毒力達(dá)到最大。分離得到的3株優(yōu)勢菌是此次東風(fēng)螺流行病的重要致病菌。

3.5 東風(fēng)螺脫殼病的優(yōu)勢病原菌

致病菌B與報道的鮑希瓦氏菌的相似度為99%；致病菌Y與報道的哈維弧菌的相似度為98%；致病菌W與報道的變形假單胞菌的相似度為99%。

部分希瓦氏菌[如腐敗希瓦氏菌(S.putrefacens)和海藻希瓦氏菌(S.algae)]是人類和其他生物的潛在病原，可引起多種疾病。希瓦氏菌屬感染海水養(yǎng)殖動物的宿主包括金帶籃子魚(Siganusrivulatus)、歐洲海鱸(Dicentarchuslabrax)、大黃魚、大菱鲆 (Scophthalmusmaximus)、方斑東風(fēng)螺和海馬(Hippocampussp.)。對東風(fēng)螺海藻希瓦氏菌和鮑魚希瓦氏菌(S.abalone)的生物學(xué)特性與致病性的研究發(fā)現(xiàn)[25]，海藻希瓦氏菌對東風(fēng)螺均具有較強的致病性，而鮑魚希瓦氏菌對東風(fēng)螺無明顯致病作用。

變形假單胞菌曾在帶有細(xì)菌性出血性腹水的養(yǎng)殖香魚(Plecoglossusaltivelis)中分離得到[26]。變形假單胞菌已被證明是閩東地區(qū)大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌[27-28]。

本試驗中，致病菌W是3株菌中對東風(fēng)螺毒力最強的一株。各株菌可能存在協(xié)同作用，并且在混合密度比例接近原始比例時對東風(fēng)螺的毒力達(dá)到最大。

3.6 溶解氧對致病菌W回歸感染的影響

溶解氧是養(yǎng)殖水質(zhì)的指標(biāo)之一，對東風(fēng)螺的免疫也有重要影響。研究充氣對致病菌W回歸感染的影響時發(fā)現(xiàn)，不充氣的致病菌W感染組死亡率比充氣的致病菌W高30%，而生理鹽水對照組均無死亡。表明溶解氧充足有利于東風(fēng)螺發(fā)揮自身免疫功能，提高對外界異物的抵抗性；溶解氧不足，則降低螺對病原菌的抵抗力。在生產(chǎn)上，東風(fēng)螺放養(yǎng)密度很高，造成養(yǎng)殖螺活動空間小，溶解氧消耗大，易造成東風(fēng)螺免疫力下降，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化，海水中的病原微生物繁殖加速、數(shù)量劇增、毒性加強，即引發(fā)了東風(fēng)螺細(xì)菌性疾病。

4 結(jié) 論

本研究從方斑東風(fēng)螺患病個體中分離出3種致病菌W、B和Y。患病個體和感染個體的腹足及連殼肌肉組織均出現(xiàn)明顯病變，并存在細(xì)菌；肝胰腺組織無明顯病變，但血細(xì)胞顯著減少。致病菌W在3種細(xì)菌中毒力最強。致病菌混合感染的毒力在混合比例接近原始比例時達(dá)到最大。推測致病菌W、B、Y是此次方斑東風(fēng)螺流行病的重要病原菌。增加水體溶解氧可提高方斑東風(fēng)螺機體免疫和降低疾病的發(fā)生。

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PathogenandPathologyofShellandFleshSeparatingDiseaseinIvoryShell,Babyloniaareolata

DI Guilan1, ZHANG Zhaoxia2, KONG Xianghui1, YU Jinjin2, CHEN Haiyang2, KE Caihuan2

( 1.College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China;2. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China )

The pathogens in shell and flesh separating disease in Fujian were isolated and purified from ivory shellBabyloniaareolata, and artificially infected, whose sequences were analized by 16S rDNA, and whose histopathology was observed. Three dominant bacterial strains (B, W and Y) were isolated from the proboscis, muscle and hepatopancreas of moribund ivory shell collected from a farm in Jinjiang, Fujian by aseptic methods, physiological and biochemical methods combined with molecular biology methods to classify and identify the pathogen. The results showed that the organs of ivory shell including foot muscle, connecting shells muscle, digestive gland, and hepatopancreas were severely damaged and a series of serious lesions were caused, with muscle fibers arranged disorderly, hollow myofibers, and blood cell decrease in hepatopancreas and connective tissue. The bacterial pathogen B was postulated to beShewanellahaliotis, the bacterial pathogen Y was postulated to beVibrioharveyi, and the bacterial pathogen W was postulated to bePseudomonasplecoglossicida. It was shown that the bacterial pathogen W has strong toxiferous to ivory shell, and the maximum toxicity in mixed bacteria when the proportion of the mixed bacteria was close to the original proportion. In summary, the findings provide the theoretical basis and guide in preventing and controlling of the shell and flesh separating disease in ivory shell.

Babyloniaareolata; shell and flesh separating disease; 16S rDNA sequence; pathogeny; histopathology

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.003

S968.31

A

1003-1111(2017)04-0411-10

2016-03-28；

2016-06-03.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31640085)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS-48)；河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目(152300410206).

狄桂蘭(1974—)，女，博士；研究方向：水產(chǎn)動物疾病與免疫.E-mail：gldi123@163.com.通訊作者： 柯才煥(1962—)，男，教授；研究方向：貝類遺傳育種. E-mail：chke@xmu.edu.cn.