張 思，李 明，張建清，盧亞楠，翟 鈺，張 峰

( 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023 )

仿刺參補(bǔ)體AjC3部分基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

張 思，李 明，張建清，盧亞楠，翟 鈺，張 峰

( 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023 )

通過制備仿刺參補(bǔ)體C3(AjC3)多克隆抗體，為進(jìn)一步研究仿刺參補(bǔ)體AjC3免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增AjC3部分基因片段(4556～5110 bp)，將該片段與原核表達(dá)載體pGS-21a連接。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Transetta(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，作為抗原免疫小鼠制備AjC3多克隆抗體。分別用間接ELISA，Western blot檢測(cè)抗體的效價(jià)和特異性。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增得到約555 bp的目的片段，重組蛋白分子量大小約56 ku；間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)1∶25600，Western blot結(jié)果顯示，多克隆抗體具有良好的特異性。該試驗(yàn)成功的制備了補(bǔ)體AjC3多克隆抗體，為補(bǔ)體AjC3的進(jìn)一步研究提供了檢測(cè)工具。

仿刺參；AjC3；多克隆抗體；原核表達(dá)

仿刺參(Apostichopusjaponicus)不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且在制藥及醫(yī)療保健等方面也得到了廣泛應(yīng)用[1]。近年來隨著仿刺參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷壯大，養(yǎng)殖病害問題日趨嚴(yán)重。而在我國(guó)大多使用抗生素和消毒劑等方法來解決仿刺參的疾病問題，這些傳統(tǒng)方法不僅對(duì)環(huán)境造成了污染，而且還會(huì)帶來藥物殘留等食品安全問題[2-3]。因此有必要更加深入的探索仿刺參的免疫防御機(jī)制，從免疫學(xué)角度降低病害發(fā)生的幾率。

研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)是由多種蛋白參與的復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，包括補(bǔ)體固有成分、調(diào)節(jié)因子以及補(bǔ)體受體等，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的重要橋梁[4-5]。補(bǔ)體系統(tǒng)通過經(jīng)典途徑，凝集素途徑，替代途徑發(fā)揮免疫功能，補(bǔ)體C3分子處于3條激活途徑的交匯處[6]。C3分子通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與免疫防御及免疫調(diào)節(jié)等多種應(yīng)答反應(yīng)。C3分子具有8個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域，一個(gè)過敏毒素結(jié)構(gòu)域，6個(gè)α2巨球蛋白結(jié)構(gòu)域，一個(gè)NTR結(jié)構(gòu)域[7]。C3通過水解斷裂成不同的活性片段，C3a和C3b，來發(fā)揮免疫功能，C3a為過敏毒素，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，C3b對(duì)替代途徑中的C3/C5轉(zhuǎn)化酶的形成具有重要作用，并能提高吞噬細(xì)胞的吞噬作用[8-10]。α2巨球蛋白功能類似于纖維蛋白溶解抑制劑，很多蛋白酶能與α2巨球蛋白結(jié)合形成復(fù)合物而被吞噬細(xì)胞清除[11]。NTR結(jié)構(gòu)域上包含了許多與神經(jīng)生長(zhǎng)因子相似的物質(zhì)[7]。

仿刺參主要通過非特異性免疫來完成對(duì)病原體的清除，而補(bǔ)體是非特異性免疫系統(tǒng)中重要的組成部分[12]。張峰等[13]證明了仿刺參體內(nèi)也存在著類似于補(bǔ)體C3的物質(zhì)。張斯等[14]克隆得到仿刺參補(bǔ)體AjC3的cDNA全長(zhǎng)6281 bp，開放閱讀框5217 bp，編碼1738個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小約為195 ku。翟鈺等[15]篩選出了與仿刺參補(bǔ)體AjC3活性相關(guān)的miRNA(spu-miR-133、spu-miR-137、spu-miR-2006)，spu-miR-133、spu-miR-137抑制補(bǔ)體AjC3基因表達(dá)，spu-miR-2006在免疫反應(yīng)中對(duì)靶基因具有調(diào)控作用。多克隆抗體是研究生物免疫機(jī)制的一種重要檢測(cè)工具。馬雪云等[16]通過人工合成C3分子的21肽制備了雞補(bǔ)體C3的多克隆抗體。張玉純等[17]利用菊糖吸附小鼠血清的方法獲得了C3多克隆抗體。馬寧[18]通過原核表達(dá)技術(shù)獲得了日本七鰓鰻(Lampetrajaponica)C3的多克隆抗體。而關(guān)于仿刺參補(bǔ)體AjC3的多克隆抗體的制備尚未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)通過克隆仿刺參補(bǔ)體AjC3部分基因序列，經(jīng)原核表達(dá)，鎳柱純化得到重組蛋白，免疫小鼠制備AjC3多克隆抗體。以期為進(jìn)一步研究仿刺參補(bǔ)體AjC3免疫學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)；pGS-21a菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；Trans5K DNA Marker、Trizol、TransTaq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、pEASY-T1克隆載體、Trans1-T1克隆感受態(tài)、Transetta(DE3)表達(dá)感受態(tài)、BamHI、XhoI、IPTG、氨芐青霉素、T4 DNA Ligase、Ni柱、AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、抗HiS標(biāo)簽抗體、BCIP/NBT底物顯色試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LB、瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank(NO.HQ214156)公布的仿刺參補(bǔ)體AjC3全長(zhǎng)基因設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。其中一對(duì)引物擴(kuò)增AjC3基因上的4067～5317 bp(1251 bp)片段。另一對(duì)引物擴(kuò)增AjC3基因上的4556～5110 bp(555 bp)，并在上下游引物中分別加入酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI(帶下劃線)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物如下：

1-F：5′-GAAGAAACTGGTCTCCGCTAT-3′

1-R：5′-TGATACCCAAAATTGTCGAAC-3′

2-F：5′-CGCGGATCCACCATCGAGATTAA

TGCCAG-3′

2-R：5′-CCGCTCGAGTTCAGCACAGAGAC

AGACAC-3′

1.2.2 目的基因的克隆

參照Trizol法提取仿刺參體腔細(xì)胞總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用引物1-F，1-R擴(kuò)增長(zhǎng)度為1251 bp的片段。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序。以測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物為模板，用引物2-F，2-R擴(kuò)增長(zhǎng)度為555 bp的目的片段。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，并與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至Trans1T-1感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pEASY-T1-AjC3。將陽(yáng)性質(zhì)粒送至上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.2.3 pGS-21a-AjC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取pEASY-T1-AjC3和表達(dá)載體pGS-21a質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切。膠回收雙酶切產(chǎn)物，T4 DNA Ligase 4 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans1T-1中，涂板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為pGS-21a-AjC3。將重組質(zhì)粒pGS-21a-AjC3送至上海生工生物有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGS-21a-AjC3轉(zhuǎn)入到表達(dá)感受態(tài)Transetta(DE3)中，涂板，37 ℃培養(yǎng)16 h，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.4 重組菌pGS-21a-AjC3的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot分析

將鑒定正確的重組菌接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖到OD值為0.8，加入不同濃度的IPTG(0、0.2、0.5、1.0 mmol/L)，30 ℃，誘導(dǎo)6 h。超聲破碎法裂解菌體，離心后分別收集上清液和沉淀，確定重組蛋白的表達(dá)形式。

收集超聲破碎后的沉淀，分別用2、3、4、5、6、8 mol/L尿素平衡緩沖液進(jìn)行處理，摸索平衡緩沖溶液最佳洗滌濃度和最佳溶解濃度。收集尿素處理后的上清液，按全式金鎳柱說明書進(jìn)行純化。將純化得到的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，與抗HiS標(biāo)簽抗體反應(yīng)，加入AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，BCIP/NBT底物進(jìn)行顯色。

1.2.5 多克隆抗體的制備

第1次免疫每只小鼠100 μg重組蛋白加等體積的弗氏完全佐劑，混合后腹腔注射。首次免疫后的第20 d和第27 d分別進(jìn)行第2次和第3次免疫，每只小鼠50 μg重組蛋白加等體積的弗氏不完全佐劑。首次免疫后的第34 d進(jìn)行第4次免疫，不加佐劑直接注射100 μg重組蛋白，7 d后取眼放血，收集血清。分裝后于冰箱-80 ℃保存。

1.2.6 間接ELISA檢測(cè)效價(jià)

用包被緩沖液將重組蛋白稀釋，包被過夜；加入PBS梯度稀釋后的多抗血清和對(duì)照血清作為一抗；加入PBS按1∶2000稀釋的AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗；加入配制好的PNPP-Na顯色20 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A405)值，計(jì)算效價(jià)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)多抗特異性

將重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將制備的多克隆抗體按1∶500倍稀釋為一抗，以AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，BCIP/NBT底物進(jìn)行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的克隆

利用PCR擴(kuò)增獲得約1251 bp的片段。以此PCR產(chǎn)物為模板再次擴(kuò)增獲得約555 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相同。測(cè)序后與GenBank中收錄的仿刺參AjC3全長(zhǎng)基因比對(duì)，結(jié)果顯示全長(zhǎng)基因上的第4867位核苷酸由C變成了T，但編碼的氨基酸仍是絲氨酸。

圖1 AjC3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DNA Marker；1.AjC3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.2 pGS-21a-AjC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

膠回收雙酶切后的目的片段和pGS-21a，T4 DNA Ligase 連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans1T-1中，測(cè)序結(jié)果正確。提取重組質(zhì)粒pGS-21a-AjC3，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示雙酶切產(chǎn)物大小分別約為555 bp和6000 bp，證明pGS-21a-AjC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pGS-21a-AjC3 PCR和雙酶切鑒定1：pGS-21a-AjC3 PCR鑒定；2：BamHI、Xhol雙酶切； M：DNA Marker；3：重組質(zhì)粒pGS-21a-AjC3.

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot分析

收集不同濃度的IPTG誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示在56 ku處出現(xiàn)重組蛋白條帶，與預(yù)期蛋白分子量一致；IPTG濃度為0.5 mmol/L和0.2 mmol/L時(shí)表達(dá)量較多。收集超聲破碎裂后的上清液與沉淀進(jìn)行SDS-PAGD電泳分析，結(jié)果顯示重組蛋白大部分在沉淀中，因此確定重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。

重組蛋白經(jīng)3 mol/L尿素平衡緩沖溶液洗滌后可除去大部分雜蛋白，經(jīng)8 mol/L尿素平衡緩沖溶液處理可使大部分重組蛋白溶于上清液中。上清液經(jīng)鎳柱純化后，在160 mmol/L的咪唑洗脫下可獲得純度和濃度較高的重組蛋白。Western blot結(jié)果顯示獲得單一條帶，且條帶位置與重組蛋白一致(圖3)。

圖3 不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)、純化及Western blot分析

M：蛋白Marker；1：誘導(dǎo)空載體pGS-21a； 2：未誘導(dǎo)的重組表達(dá)載體pGS-21a-AjC3；3～5：30 ℃條件下分別以終濃度1.0、0.5、0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h的重組菌；6：未誘導(dǎo)的空載體pGS-21a；7～9：100、160、160 mmol/L的咪唑洗脫時(shí)的重組蛋白； 10：pGS-21a空載體的Western blot分析； M：蛋白Marker； 11：重組蛋白Western blot分析.

2.4 多克隆抗效價(jià)的檢測(cè)

間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)多克隆抗體稀釋到1/25600時(shí)P/N比值仍大于2.1，當(dāng)稀釋到1/51200時(shí)P/N比值小于2.1，因此判斷多克隆抗體效價(jià)為1/25600。

表1 間接ELISA檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)

2.5多克隆抗體特異性的檢測(cè)

以重組蛋白為抗原，以制備的多克隆抗體為一抗，在56 ku處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。

圖4 多克隆抗體Western blot分析M:蛋白Maker； 1:多克隆抗體檢測(cè)重組蛋白.

3 討 論

3.1 目的基因克隆

仿刺參AjC3基因全長(zhǎng)6281 bp，蛋白分子大小約195 ku，分子量較大[14]。原核表達(dá)系統(tǒng)受原核細(xì)胞選擇偏性的影響，所以蛋白分子量過大不易表達(dá)，然而從免疫學(xué)角度可知，蛋白能否產(chǎn)生相應(yīng)的抗體與蛋白分子量并無直接關(guān)系，只有當(dāng)?shù)鞍妆砻婢哂锌乖砦粫r(shí)，才能被識(shí)別產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[19]。因此，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[20-22]關(guān)于分析蛋白抗原表位的方法，截取主要抗原表位區(qū)基因進(jìn)行克隆。用primer 5設(shè)計(jì)引物時(shí)發(fā)現(xiàn)在靠近截取目的片段上下游附近并未找到特異性高的引物，但在距離目的片段上下游較遠(yuǎn)處能找到合適引物，因此本試驗(yàn)先克隆一段包含目的片段在內(nèi)的長(zhǎng)度為1251 bp的片段，以此片段為模板擴(kuò)增獲得目的片段，從而減少了錯(cuò)配的幾率，提高了引物的特異性。

3.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

本試驗(yàn)最初選用表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLysS，但重組蛋白未表達(dá)。分析原因可能是這段基因含有較多的稀有密碼子，改換Transetta(DE3)后重組蛋白大量表達(dá)。為了獲得可溶性蛋白，試驗(yàn)過程中曾嘗試降低溫度，更換表達(dá)載體等方法，但均未提高上清液中重組蛋白的表達(dá)量。分析原因可能是由于存在含硫氨基酸導(dǎo)致二硫鍵錯(cuò)配，其次原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏糖基化、?；确g后加工系統(tǒng)，中間體會(huì)大量積累，容易形成包涵體。

3.3 多克隆抗體的制備

本試驗(yàn)共免疫了5只小鼠，其中1只小鼠二次免疫后死亡，有3只小鼠效價(jià)達(dá)到1∶25600，另1只小鼠效價(jià)只有1∶800。分析原因可能是不同的小鼠體質(zhì)不同或者免疫失敗造成的。多克隆抗體在蛋白鑒定和定量檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如ELISA、western、免疫組化等[23-24]。目前市面上有關(guān)補(bǔ)體AjC3商業(yè)化抗體和檢測(cè)試劑盒都是針對(duì)哺乳動(dòng)物的，而且價(jià)格昂貴，阻礙了對(duì)仿刺參補(bǔ)體AjC3的相關(guān)研究。本試驗(yàn)成功的制備了仿刺參補(bǔ)體AjC3的多克隆抗體，為檢測(cè)仿刺參補(bǔ)體AjC3在各組織中的分布以及病毒侵染下表達(dá)含量的變化等研究提供了工具。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過克隆，原核表達(dá)，鎳柱純化等技術(shù)獲得了AjC3重組蛋白。將獲得的重組蛋白作為抗原免疫小鼠制備多克隆抗體。間接ELISA及Wstern blot分析多克隆抗體具有較高的效價(jià)及良好的特異性。為今后更進(jìn)一步的研究AjC3蛋白的功能以及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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ProkaryoticExpressionofGeneFragmentsofAjC3andPreparationofPolyclonalAntibodyinSeaCucumberApostichopusjaponicus

ZHANG Si, LI Ming, ZHANG Jianqing, LU Yanan, ZHAI Yu, ZHNAG Feng

( Fisheries and Life College, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

The polyclonal antibody of complement component C3(AjC3) was prepared to provide references for further research on immunologic mechanism in sea cucumberApostichopusjaponicus. The gene fragments of AjC3 was amplified by PCR and inserted into the prokaryotic expression vector pGS-21a. The recombinant plasmid was transformed into the transetta(DE3) and induced to express by IPTG. The expression products were purified by Ni-NTA. The recombinant protein as antigen was employed to immunize mice to prepare the polyclonal antibody. The title and specificity of the polyclonal antibody were determined by indirect ELISA and Western blot. The results showed that the length of PCR product was 555 bp.The size of recombinant protein was 56 ku. The title was 1∶25600 by indirect ELISA. Western blot proved that the polyclonal antibody had good specificity and was successfull prepared, which provided helpful tools for further researches on AjC3.

Apostichopusjaponicus; AjC3; polyclonal antibody; prokaryotic expression

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.016

S968.9

A

1003-1111(2017)01-0094-05

2016-02-01；

2016-04-18.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30471223).

張思(1990—)，女，碩士研究生；研究方向：動(dòng)物免疫學(xué).E-mail：2441645464@qq.com.通訊作者：張峰(1957—)，男，教授，博士；研究方向：動(dòng)物免疫學(xué).E-mail：zhangfeng@dlou.edu.cn.