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(1.寧波方太廚具有限公司,浙江寧波 315336; 2.天津頂育咨詢有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122; 4.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

真菌毒素DON和ZEN的體外聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)

徐慧1,石慧2,張銀志3,*,孫秀蘭3,4,紀(jì)劍4,張入元4

(1.寧波方太廚具有限公司,浙江寧波 315336; 2.天津頂育咨詢有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122; 4.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

選取BEL7402細(xì)胞對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的聯(lián)合毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先將不同濃度的DON、ZEN以及其混合物染毒對(duì)數(shù)期的BEL7402細(xì)胞,刺激24 h后,對(duì)細(xì)胞增殖率、ROS活性氧水平、鈣離子水平、細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)靶點(diǎn)基因的表達(dá)等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析,并對(duì)兩種毒素的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,真菌毒素DON、ZEN均可抑制細(xì)胞活性,IC50分別為9.3、27.2 μg/mL,可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及鈣離子濃度,顯著上調(diào)凋亡關(guān)鍵基因p53、Bax,下調(diào)Bal-2基因,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生早期凋亡甚至壞死,多種毒性指標(biāo)驗(yàn)證了這兩種毒素對(duì)細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為加和作用。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,玉米赤霉烯酮,聯(lián)合毒性,體外毒性,加和作用

隨著真菌毒素的危害在全球范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注,并成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)后,單種真菌毒素對(duì)人體和動(dòng)物的毒性評(píng)價(jià)研究已經(jīng)有大量的科技論文報(bào)道,而多種真菌毒素的共同作用則是最近才引起注意[1-2]?，F(xiàn)實(shí)生活和環(huán)境相對(duì)復(fù)雜,從一些報(bào)道中可以發(fā)現(xiàn),食品往往受到不止一種真菌毒素的污染[3-5],脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)都是由鐮刀菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,尤其是在南方多雨潮濕日照短的亞熱帶濕潤(rùn)氣候地區(qū),霉菌污染非常嚴(yán)重,DON和ZEN在飼料中的檢出率達(dá)100%[6]。此外,現(xiàn)實(shí)環(huán)境中能夠引起家畜出現(xiàn)不適或?qū)е轮卸景Y狀所需要的單種真菌毒素的劑量,往往相較于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所需要的劑量要低得多。這是由于攝入混合真菌毒素后,毒素之間會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用,且與染毒宿主、作用時(shí)間以及劑量等因素相關(guān)。關(guān)于相互作用效應(yīng)并沒有統(tǒng)一明確的定義,政府部門也沒有發(fā)布關(guān)于毒素聯(lián)合作用的相關(guān)法規(guī)[7]。相互作用的情況一般可以分類為:協(xié)同作用、加和作用、亞加和性效應(yīng)以及拮抗作用[8]。由此可見,在真菌毒素混合污染普遍嚴(yán)重的情況下,除了對(duì)真菌毒素單獨(dú)的毒性危害進(jìn)行評(píng)價(jià)外,也要考慮多種真菌毒素聯(lián)合毒性作用的危害評(píng)估[9]。本文通過(guò)對(duì)DON和ZEN單獨(dú)以及聯(lián)合染毒細(xì)胞后活性氧ROS的水平,鈣離子通道,細(xì)胞凋亡率,凋亡靶點(diǎn)基因等指標(biāo)的測(cè)定來(lái)研究其毒性以及聯(lián)合作用,從細(xì)胞水平,離子水平,基因水平對(duì)兩種真菌毒素的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行了評(píng)價(jià),為進(jìn)行更多指標(biāo)的深入研究提供了有用的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BEL7402人肝癌細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰蛋白酶(250 U/mg) Gibco公司;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品(DON,純度≥99%)、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(ZEN,純度≥99%)、二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、鈣離子熒光探針試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;Trizol試劑盒、DNA抽提試劑盒及RNA酶(酶活2 kU) 上海生物工程有限公司;PCR反應(yīng)試劑 TaKaRa(大連)生物公司;實(shí)驗(yàn)中所用試劑 均由超純水配制。

SW-CJ超凈工作臺(tái) 蘇州零三凈化設(shè)備有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientific公司;Universal32R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司;DT5-2低速離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;Petroff-Hausser細(xì)胞計(jì)數(shù)器 上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;倒置式生物顯微鏡 日本Olympus公司;Infinite M1000酶標(biāo)儀 瑞士Tecan;激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)蔡司公司;流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng):將BEL7402細(xì)胞利用含有10%胎牛血清和1%的100 μg/mL青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,于飽和濕度5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。BEL7402細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng),每隔3 d更換培養(yǎng)液一次,當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底面積90%時(shí),可傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)在超凈臺(tái)內(nèi)酒精燈火焰前,小心打開待傳代的細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋,輕微灼燒瓶口和后蓋,棄廢液,PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)清洗2次,加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 min,待細(xì)胞變圓細(xì)胞間出現(xiàn)間隙,立刻加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化,用滅菌吹打管輕輕吹打成細(xì)胞懸液,1000 r/min離心5 min,棄上清,用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,將其分裝2瓶。

細(xì)胞凍存:選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生理狀態(tài)良好的細(xì)胞,凍存前一天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞消化離心(條件與細(xì)胞培養(yǎng)相同)后,向離心管中加入2 mL細(xì)胞凍存液(10%的DMSO,20%的胎牛血清,70%的完全培養(yǎng)液)吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至凍存管,密封標(biāo)注細(xì)胞名稱和日期,將凍存管先后按4 ℃ 30 min,-20 ℃ 4 h,-80 ℃ 12 h保存后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。

復(fù)蘇:將含有待復(fù)蘇細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出,置于37 ℃溫水中解凍直至凍存管中溶液全部融化,1000 r/min離心5 min棄上清,加入1 mL 新鮮培養(yǎng)液重懸,再次1000 r/min離心5 min棄上清,加入完全培養(yǎng)液重懸吹打均勻,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中,于飽和濕度5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),24 h后換液棄除未正常貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。操作過(guò)程中應(yīng)注意快速解凍,避免冰晶導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) MTT法是常見的測(cè)定細(xì)胞增殖活性的實(shí)驗(yàn),其原理是活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶化合物甲臜沉積于細(xì)胞中,而死細(xì)胞沒有這種能力,甲臜可溶于二甲基亞颯(DMSO)中,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值(OD值),OD值與活細(xì)胞數(shù)成正比,可間接反映活細(xì)胞的變化,進(jìn)而推算出毒素對(duì)細(xì)胞的抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL7402細(xì)胞消化收集制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度,將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng),待其貼壁小心吸除培養(yǎng)液,加入含有不同濃度的真菌毒素DON,ZEN及其聯(lián)合組的培養(yǎng)液,控制終濃度分別為DON:0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL;ZEN:0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50μg/mL;聯(lián)合染毒組DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,每孔加入藥液200 μL。對(duì)照組每孔加入等體積的含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基,空白組不接種細(xì)胞只加入等體積培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均設(shè)4個(gè)平行。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h后,棄上清，每孔加入100 μL濃度1 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用針管小心吸除上清,每孔加入150 μL的DMSO,振蕩10 min,待孔中的紫色結(jié)晶完全溶解,用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定各孔的吸光度(OD)值。計(jì)算增殖抑制率(%)=[1-(A染毒組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)](100[10],根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定DON、ZEN單獨(dú)染毒的半數(shù)抑制濃度(IC50),再根據(jù)IC50篩選出合適的DON、ZEN單獨(dú)染毒及其聯(lián)合染毒的濃度。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)通過(guò)活性氧試劑盒對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行檢測(cè),活性氧試劑盒的主要試劑成分為DCFH-DA探針,探針本身沒有熒光,它可以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被水解為DCFH,DCFH無(wú)法穿透細(xì)胞膜,因而被滯留于細(xì)胞內(nèi),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高時(shí),DCFH被氧化為可以發(fā)熒光的DCF,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度,從而得出細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。采用DCFH-DA熒光探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞受真菌毒素刺激后體內(nèi)活性氧的水平,實(shí)驗(yàn)按照活性氧檢測(cè)劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將BEL7402細(xì)胞接種到六孔板中,使每孔的細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL,待細(xì)胞貼壁進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,加入含不同組合真菌毒素的完全培養(yǎng)液其中DON染毒濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL;ZEN染毒濃度為0.1、0.2、0.5、1、5、10 μg/mL;聯(lián)合染毒組DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,陰性對(duì)照組為含有0.1% DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組是終濃度為50 μmol/L H2O2的RPMI 1640培養(yǎng)基,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)平行,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h,棄除培養(yǎng)液用PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)離心洗滌并吹懸,加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA混勻,37 ℃避光孵育30 min,每10 min搖勻一次,以促使探針和細(xì)胞充分結(jié)合。最后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次,流式細(xì)胞儀測(cè)定其平均熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。

表1 基因的引物序列及退火溫度Table 1 Sequence of the peimers and annealing temperature

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)定 選用Fluo-3 AM作為監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針,將BEL-7402細(xì)胞鋪于六孔板,每孔細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開始加入與上述1.2.2相同含有不同組合真菌毒素的完全培養(yǎng)基染毒培養(yǎng)24 h,1000 r/min離心5 min,后用PBS洗滌3次,加入含有濃度為1 μmol/L Fluo-3 AM染液的培養(yǎng)基,混勻,于二氧化碳培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,利用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定其平均熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶PI雙染法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,并于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BEL7402細(xì)胞鋪于六孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入與上述1.2.2相同的含有不同組合真菌毒素的培養(yǎng)液孵育24 h,棄除培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)洗滌2次,加入胰酶消化細(xì)胞,2 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化,收集細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,棄上清液,先加入500 μL Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞后,加入5 μL Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻,再加入5 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻,于冰浴避光孵育10 min,隨即利用流式細(xì)胞儀檢測(cè),Annexin V-FITC經(jīng)FL1通道檢測(cè),最大激發(fā)波長(zhǎng)488 nm;最大發(fā)射波長(zhǎng)530 nm,PI經(jīng)FL3通道檢測(cè),最大激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm,采用Cell Quest軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。此外,為了使得凋亡檢測(cè)變得更加直觀,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后以調(diào)整細(xì)胞數(shù)以1×105個(gè)/mL接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中,待貼壁后,吸除培養(yǎng)液,加入500 μL的含有5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide的Binding Buffer輕輕混勻,避光孵育10 min,真菌毒素刺激組作為實(shí)驗(yàn)組,未刺激組作為陰性對(duì)照組,采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)BEL7402細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因mRNA水平 將不同濃度真菌毒素染毒后的細(xì)胞,用Trizol法抽提細(xì)胞中的總mRNA,于260 nm及280 nm處測(cè)定吸光度值,計(jì)算mRNA的純度。計(jì)算公式為:mRNA純度=A260 nm/(A280 nm-本底),確保mRNA純度在1.8～2.0之間。按反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書,配制10 μL反應(yīng)體系,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃冷卻。按實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書配制成20 μL反應(yīng)體系。用熒光定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)強(qiáng)度Ct值,按-ΔΔCt方法計(jì)算[11]。上下游引物和內(nèi)參引物序列如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DON、ZEN分別對(duì)BEL7402細(xì)胞增殖活性的影響

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度水平的DON、ZEN單獨(dú)染毒BEL-7402細(xì)胞,隨著真菌毒素刺激濃度的不斷升高,毒素對(duì)細(xì)胞的抑制率越來(lái)越明顯,在DON染毒濃度范圍低于0.5 μg/mL內(nèi),抑制率在5%左右,當(dāng)染毒濃度超過(guò)10 μg/mL,細(xì)胞抑制率達(dá)到50%以上。ZEN在低濃度染毒范圍內(nèi),細(xì)胞抑制率相對(duì)DON更小,當(dāng)染毒濃度到達(dá)25 μg/mL時(shí),抑制率接近50%,通過(guò)改良寇氏法計(jì)算出DON和ZEN的IC50分別為9.3、27.2 μg/mL。而在聯(lián)合毒性細(xì)胞抑制率研究實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞抑制率達(dá)到50%的時(shí)候,DON濃度為2.5 μg/mL,ZEN濃度為7.5 μg/mL,相比于單一毒素組IC50的毒素劑量,真菌毒素DON和ZEN在本實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置疊加范圍內(nèi),表現(xiàn)出一定程度的加和作用,為后續(xù)聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)選擇合適DON和ZEN的組合濃度奠定基礎(chǔ)。

圖2 DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合作用對(duì)BEL-7402細(xì)胞活性氧的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖(A)和細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)熒光強(qiáng)度值(B)Fig.2 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular ROS production of BEL-7402 cells detceted by flow cytometry(A),and relative fluorescenceintensity of interacellular ROS production(B)

圖1 DON、ZEN以及DON+ZEN對(duì)BEL7402細(xì)胞活性影響Fig.1 Effects of DON,ZEN,and DON+ZEN on the BEL-7402 cell viability注:A:DON對(duì)BEL7402細(xì)胞的抑制率,B:ZEN對(duì)BEL7402細(xì)胞的抑制率,C:DON+ZEN對(duì)BEL7402細(xì)胞的抑制率。

2.2 DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合作用對(duì)BEL7402細(xì)胞活性氧的影響

由圖2可見,隨著DON、ZEN單獨(dú)和聯(lián)合刺激組的濃度不斷增大,細(xì)胞內(nèi)ROS不斷增加,除低濃度組0.1 μg/mL外,各毒素刺激作用組的ROS顯著高于對(duì)照組(p<0.05),DON、ZEN單獨(dú)以及聯(lián)合染毒刺激組的組間差異顯著(p<0.05)。相比于DON在誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS方面,ZEN的作用幅度更大,可能與其各自的毒性作用機(jī)制相關(guān)。DON、ZEN聯(lián)合刺激組的ROS值分別大于相應(yīng)的單獨(dú)刺激組,預(yù)測(cè)值和測(cè)得值之間無(wú)顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響為加和效應(yīng)。

2.3 DON、ZEN單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響

圖3 DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合作用對(duì)BEL-7402細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響的共聚焦成像圖(A)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度值(B)Fig.3 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular[Ca2+]i of BEL-7402 cells detceted by CLSM(A)and Relative fluorescence intensity of interacellular[Ca2+]i(B)

圖4 DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合作用對(duì)BEL7402細(xì)胞凋亡率影響的流式細(xì)胞圖以及共聚焦成像圖(A)和細(xì)胞凋亡百分比(B)Fig.4 Effects of DON ZEN and their combination on the apoptosis rate of BEL7402 cells detceted by flow cytometry and CLSM(A),and the percentage of apoptosis rate(B)

Ca2+作為一個(gè)主要的細(xì)胞內(nèi)信使參與調(diào)控多種細(xì)胞生理活動(dòng),細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)主要靠胞內(nèi)鈣池鈣釋放與重儲(chǔ)來(lái)維持,有賴于Ca2+-ATP酶(鈣泵)的Ca2+外流以及Ca2+跨膜內(nèi)流,一旦這種穩(wěn)態(tài)機(jī)制的被破壞失調(diào)就會(huì)產(chǎn)生一系列反應(yīng),隨之就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[14]。在正常生理狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度總保持在極低水平,如圖3A所示,對(duì)照組顯示出微弱的熒光,而當(dāng)細(xì)胞遇到相應(yīng)刺激時(shí),會(huì)通過(guò)多種途徑提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。利用DON、ZEN單獨(dú)及聯(lián)合刺激細(xì)胞后,細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),表明真菌毒素能夠使細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高。由圖3B可見,DON、ZEN單獨(dú)或聯(lián)合染毒24 h,BEL-7402細(xì)胞[Ca2+]i含量隨毒素濃度的升高而增加,除0.1 μg/mL外各染毒組均顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05)。聯(lián)合組的[Ca2+]i平均值分別均明顯大于相對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染的[Ca2+]i平均值,預(yù)測(cè)值和測(cè)得值之間無(wú)顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i蓄積為加和效應(yīng)。此外,Ca2+水平的升高和ROS水平的提高相關(guān),有研究表明ROS可以從多方面調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào),ROS可以導(dǎo)致鈣離子從細(xì)胞外環(huán)境向細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)流,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高可以激活其他一些酶,從而進(jìn)一步增加氧化自由基的產(chǎn)生。這也驗(yàn)證了之前實(shí)驗(yàn)組真菌毒素刺激BEL7402細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高的現(xiàn)象。

2.4 DON、ZEN單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)之后,如圖4A(a)所示,圖中左下角為正?；罴?xì)胞,不被熒光染料染色;圖中右下角為凋亡早期的細(xì)胞,為Annexin V-FITC染色;圖中右上角為壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞,同時(shí)被Annexin V-FITC和PI染色;圖中左上角出現(xiàn)的細(xì)胞是許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差,其中凋亡率的計(jì)算為:(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)。

DON、ZEN及其聯(lián)合組染毒BEL-7402細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡情況如圖4B可見,對(duì)照組在沒有真菌毒素刺激的條件下,細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都很小,但使用DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合組分別刺激細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率均隨毒素濃度的升高而增加。相比于對(duì)照組,DON單獨(dú)染毒時(shí),細(xì)胞凋亡率除0.1 μg/mL組差異不顯著外,其余各組的細(xì)胞凋亡率均差異顯著,組間差異顯著(p<0.05)。ZEN單獨(dú)染毒時(shí),低濃度組(0.1、0.2 μg/mL)細(xì)胞凋亡率差異不顯著,其余各高濃度組間細(xì)胞凋亡率差異顯著(p<0.05)。其中,DON處理組的凋亡率比ZEN處理組的凋亡率高,DON和ZEN聯(lián)合染毒24 h,細(xì)胞凋亡率組間差異顯著(p<0.05)且分別都大于相對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組,預(yù)測(cè)值和測(cè)得值之間無(wú)顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響為加和效應(yīng)。此外,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)DON、ZEN以及其聯(lián)合染毒細(xì)胞后的熒光水平進(jìn)行直觀觀察,由圖4A(b)可見,染毒組的綠色熒光和紅色熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于對(duì)照組,聯(lián)合染毒組的紅綠熒光強(qiáng)度要強(qiáng)于所對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組。

2.5 DON、ZEN單獨(dú)及聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控基因Bax、Bal-2及p53的mRNA表達(dá)的影響

2.5.1Bax、Bal-2基因mRNA表達(dá)影響 細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程受到基因的嚴(yán)格調(diào)控,其中Bcl-2家族基因是與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中最受關(guān)注的之一。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中起著至關(guān)重要的作用,Bcl-2蛋白主要分布于線粒體膜、核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,維護(hù)線粒體膜完整,防止細(xì)胞色素C的釋放,阻止細(xì)胞凋亡,是細(xì)胞的抗凋亡成員[15]。Bcl-2家族除Bcl-2外,還有Bax,當(dāng)Bax形成Bax-Bax同源二聚體時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,隨著Bcl-2表達(dá)量的上升,Bax二聚體會(huì)漸漸分開與Bcl-2形成比Bax-Bax二聚體更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異二聚體,從而緩解Bax-Bax二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,簡(jiǎn)言之,Bcl-2過(guò)量表達(dá)細(xì)胞存活,Bax過(guò)量表達(dá)則細(xì)胞凋亡[16]。由圖5可見,DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合均可以上調(diào)Bax基因相對(duì)mRNA的表達(dá)。DON單獨(dú)染毒BEL-7402細(xì)胞時(shí),低濃度組0.1 μg/mL與對(duì)照組,0.2 μg/mL與0.5 μg/mL組間差異不顯著,隨著染毒濃度增大,Bax相對(duì)mRNA表達(dá)水平升高,后三組顯著高于前三組(p<0.05)。ZEN單獨(dú)染毒時(shí)低濃度組0.1 μg/mL與對(duì)照組不顯著性,0.5 μg/mL與1 μg/mL組間差異不明顯。聯(lián)合染毒時(shí)各組差異顯著,5+10 μg/mL顯著性低于2+5 μg/mL,說(shuō)明聯(lián)合濃度達(dá)到DON 5 μg/mL+ZEN 10 μg/mL反而降低了Bax的mRNA的表達(dá),DON、ZEN單獨(dú)染毒或聯(lián)合染毒的其余各組差異顯著(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DON和ZEN均可誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的Bax基因的表達(dá),兩者聯(lián)合染毒時(shí)細(xì)胞內(nèi)Bax的mRNA的表達(dá)量大于DON、ZEN單獨(dú)染毒組,表現(xiàn)出加和效應(yīng)。

圖5 DON ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合對(duì)BEL7402細(xì)胞Bax的mRNA表達(dá)水平Fig.5 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bax in BEL7402 cells注:對(duì)所有毒素劑量組分別與空白組進(jìn)行 t-test檢驗(yàn),*表示p<0.05;圖6、圖7同。

由圖6可見,DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合均可以下調(diào)Bcl-2基因相對(duì)mRNA的表達(dá)。DON單獨(dú)染毒時(shí),低濃度組0.1 μg/mL與對(duì)照組差異不顯著,隨著染毒濃度的增大,對(duì)Bcl-2基因下調(diào)越加明顯;ZEN單獨(dú)染毒時(shí)0.1 μg/mL組與對(duì)照組差異不顯著;聯(lián)合染毒時(shí)0.2+0.2 μg/mL、0.5+0.5 μg/mL組兩個(gè)組間差異不顯著。DON、ZEN單獨(dú)染毒或聯(lián)合染毒的其余各組差異顯著(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DON和ZEN在較高濃度范圍可以誘導(dǎo)Bal-2基因的下調(diào),兩者聯(lián)合染毒時(shí)對(duì)Bal-2下調(diào)表現(xiàn)為加和作用。

圖6 DON ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合對(duì)BEL7402細(xì)胞Bcl-2的mRNA表達(dá)水平Fig.6 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bcl-2 in BEL7402 cells

圖7 DON和ZEN單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)BEL7402細(xì)胞p53相對(duì)mRNA表達(dá)水平的影響Fig.7 Effects of individual and combinational treatment of DON and ZEN on the relative mRNA ration of p53 in BEL7402 cells

2.5.2p53基因mRNA表達(dá)的影響 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,p53發(fā)揮著極其重要的作用。p53蛋白主要集中在細(xì)胞核漿中,能夠和DNA發(fā)生特異結(jié)合,具有明顯的細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制作用,檢查DNA損傷,監(jiān)視基因組DNA的完整性。若遭受外界刺激導(dǎo)致DNA發(fā)生損傷,p53可作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞停止在G期,使損傷DNA得以充分修復(fù)。如果DNA遭受不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷無(wú)法修復(fù),則p53啟動(dòng)凋亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。由圖7可見,DON、ZEN單獨(dú)及其聯(lián)合均可以上調(diào)p53基因相對(duì)mRNA的表達(dá)。DON染毒BEL-7402細(xì)胞時(shí),低濃度范圍(<0.5 μg/mL)與對(duì)照組相比p53基因上調(diào)并不明顯,隨著染毒濃度的增大p53上調(diào)幅度有所增大。相對(duì)于ZEN來(lái)說(shuō),高劑量的DON上調(diào)p53幅度更大。ZEN染毒BEL-7402細(xì)胞時(shí),低濃度范圍(<1 μg/mL),p53相對(duì)mRNA表達(dá)水平較空白組隨具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,但是上調(diào)趨勢(shì)不夠明顯,刺激濃度增大,p53相對(duì)mRNA表達(dá)水平大幅度增加,當(dāng)ZEN濃度達(dá)到5 μg/mL后,p53相對(duì)mRNA表達(dá)水平不再增加。DON、ZEN聯(lián)合染毒的所有組較對(duì)照組都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DON、ZEN均能夠誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞的p53基因mRNA的表達(dá),干擾p53凋亡通路的調(diào)控,從而誘使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在兩者聯(lián)合誘導(dǎo)p53活化的程度均大于相應(yīng)DON和ZEN單獨(dú)染毒組,且測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間無(wú)顯著性差異,對(duì)調(diào)控p53基因誘導(dǎo)凋亡表現(xiàn)為加和作用。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)DON和ZEN單獨(dú)以及聯(lián)合染毒細(xì)胞后活性氧ROS的水平,鈣離子通道,細(xì)胞凋亡率,凋亡靶點(diǎn)基因等指標(biāo)的測(cè)定來(lái)研究其毒性以及聯(lián)合作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DON和ZEN均可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及鈣離子濃度,顯著上調(diào)凋亡關(guān)鍵基因p53,Bax下調(diào)Bal-2基因,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生早期凋亡甚至壞死,多種毒性指標(biāo)驗(yàn)證了這兩種毒素作用細(xì)胞具有相似的作用位點(diǎn)和信號(hào)通路使其產(chǎn)生具有加和作用的聯(lián)合毒性作用。

現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道,大多通過(guò)細(xì)胞的存活率單一指標(biāo)來(lái)計(jì)算真菌毒素DON和ZEN的聯(lián)合效應(yīng),如,Kouadio J H 等人發(fā)現(xiàn),DON(10～20 μg/mL)和ZEN(10-20 μg/mL)作用Caco-2細(xì)胞72 h之后,通過(guò)細(xì)胞存活率計(jì)算發(fā)表DON和ZEN存在加和作用[18]。Ficheux A S 等人發(fā)現(xiàn),DON(0.04-0.1 μg/mL)和ZEN(0.2-10 μg/mL)作用CGU-GM 細(xì)胞14 d之后,通過(guò)細(xì)胞存活率計(jì)算發(fā)表DON和ZEN存在加和作用[19]。Wan L Y M 等人發(fā)現(xiàn),DON(0.5-2 μg/mL)和ZEN(10-40 μg/mL)作用IPEC-J2 細(xì)胞48 h之后,通過(guò)細(xì)胞存活率計(jì)算發(fā)表DON和ZEN在低劑量下存在拮抗作用,在高劑量下存在協(xié)同作用[20]。而此次研究從細(xì)胞水平,離子水平,基因水平對(duì)兩種真菌毒素的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行了評(píng)價(jià),為進(jìn)行更多指標(biāo)的深入研究提供了有用的參考價(jià)值。

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CombinativetoxicityassessmentofmycotoxinsDONandZENinvitro

XUHui1,SHIHui2,ZHANGYin-zhi3,*,SUNXiu-lan3,4,JIJian4,ZHANGRu-yuan4

(1.Ningbo Fotile Kitchen Ware Co.,Ltd.,Ningbo 315336,China;2.Tingyi Holding Corp,Central Research Institute-Food Safety,Shanghai 201103,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;4.School of Food Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

BEL-7402 cells were chosen as the cell model in this study to evaluate the indiviual and combined toxicity of Deoxynivalenol(DON)and Zearalenone(ZEN). With the logarithmic phase of BEL7402 cells exposed to different concentrations of DON,ZEN and their mixture for 24 h,the rate of cell proliferation,reactive oxygen species(ROS)and calcium levels,cell apoptosis rate and apoptosis related genes expression were analyzed and the combined effect of the two toxins was evaluated. The results showed that the mycotoxin DON,ZEN could inhibit cell activity with an IC50of 9.3 μg/mL and 27.2 μg/mL,lead to cell damage induced by oxidative stress and increase the intracellular levels of reactive oxygen species and calcium ion concentration. Proapoptotic genep53 was signifigantly up-regulation andBal-2 gene was down-regulated,induce cell apoptosis or necrosis,a variety of toxic index verified that the combined toxicity of these two toxins on cells have an additive effect.

deoxynivalenol;zearalenone;combined toxicity;invitrotoxicity;additive effect

2017-06-16

徐慧(1973-)，女，本科，工程師，主要從事家用電器機(jī)械制造方面的研究，E-mail:xuh@fotile.com。

*通訊作者:張銀志(1975-)，男，碩士，高級(jí)工程師，主要從事食品安全檢測(cè)方面研究，E-mail:yinzhizhang@jiangnan.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0268-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.049