李加林，郭小華，吳艷嬌，黃志偉，劉思齊，吳素珍（.贛南醫(yī)學院藥學院，江西贛州34000；2.贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，江西贛州34000）

二氫楊梅素對高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖及纖維連接蛋白堆積的影響Δ

李加林1＊，郭小華1，吳艷嬌1，黃志偉1，劉思齊1，吳素珍2#（1.贛南醫(yī)學院藥學院，江西贛州341000；2.贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，江西贛州341000）

目的：研究二氫楊梅素（DMY）對高糖（HG）誘導的腎小球系膜細胞（MCs）的增殖及纖維連接蛋白（FN）堆積的影響，探討其對糖尿病腎病腎小球硬化的作用機制。方法：將細胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）和DMY低、中、高濃度組（30 mmol/L葡萄糖+22.5、45、90 μmol/L DMY），培養(yǎng)48 h后采用MTT法檢測細胞的增殖活性[以光密度（OD）值反映]；采用分子對接法對DMY與Smad2的結合狀態(tài)進行模擬分析；將細胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY對照組（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），培養(yǎng)5 h后采用Western blot法檢測細胞中磷酸化Smad2（p-Smad2）及細胞外基質蛋白FN的表達水平。結果：MTT檢測結果顯示，與正常組比較，HG組細胞的OD值顯著升高（P＜0.05）；與HG組比較，DMY各濃度組細胞的OD值均顯著降低（P＜0.05）。DMY與Smad2蛋白分子結合的吉布斯自由能（ΔG）為－5.64 kJ/mol，抑制常數(shù)Ki為73.53 μmol/L，在第465、464、461、458這4個氨基酸殘基位點有氫鍵供體與受體的結合。Western blot結果顯示，與正常組比較，HG組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與HG組比較，DMY組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平顯著降低（P＜0.05）。結論：DMY可抑制HG誘導的MCs增殖，并通過與Smad2結合，抑制Smad2的磷酸化，繼而降低細胞外基質蛋白FN的表達，從而改善糖尿病腎病腎小球硬化。

二氫楊梅素；腎小球系膜細胞；增殖；纖維連接蛋白；分子對接

糖尿病伴有的長期高血糖常會使糖尿病患者發(fā)生全身性臟器組織損害，形成慢性并發(fā)癥，其中糖尿病腎?。―iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病發(fā)展過程中出現(xiàn)的常見而難治的微血管并發(fā)癥。DKD主要病理特征是系膜細胞增生，系膜區(qū)細胞外基質（Extracellu-lar matrix，ECM），特別是纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）過度堆積，是導致終末期腎疾病的主要因素[1-4]。目前臨床治療也只能延緩DKD的發(fā)生和減慢其發(fā)展進程，并不能達到拮抗或逆轉腎病變的目的，因此迫切需要尋找新的治療DKD的藥物。

藤茶來源于葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）WT.Wang]，多生長在我國南方，主要分布在湖北、湖南、江西、福建等地，在民間作為藥食兩用的植物，已經(jīng)有數(shù)百年的歷史[5]。葡萄科蛇葡萄屬的植物中一個比較有特征性的成分就是二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY），其中藤茶的DMY含量高達29%[6]。文獻報道DMY能夠降血糖[7-8]、調節(jié)機體的糖耐受量。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)DMY可以減輕DKD大鼠腎小球硬化[9]，但到目前為止，尚無人報道其抗DKD腎小球硬化的機制。轉化生長因子β（Transforming growth factor beta signaling，TGF-β）/Smads信號通路在DKD動物模型和細胞模型中均被激活，其中Smad2磷酸化水平升高是TGF-β/Smads信號通路激活的一個重要節(jié)點[10-11]。抑制TGF-β/Smads信號通路激活可以延緩DKD的進程，Smad2是TGF-β/Smads信號通路下游一個重要的信號分子，筆者推測DMY可能是通過抑制TGF-β/Smads信號通路對DKD起保護作用的。因此，筆者首先采用分子對接法從理論水平分析DMY與Smad2有結合位點，從而推測DMY能夠抑制Smad2的活化。然后采用細胞試驗進一步驗證DMY能夠抑制高糖（HG）環(huán)境下腎小球系膜細胞（MCs）中Smad2磷酸化，進而抑制FN的表達，為將DMY開發(fā)成治療DKD藥物奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

1510酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；GBOX Chemi XRQ熒光化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）；二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

DMY（贛南醫(yī)學院藥學院自制，批號：20160706，經(jīng)高效液相色譜法測定其純度＞95%）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國Sigma公司）；兔抗大鼠磷酸化Smad2（p-Smad2）一抗（美國CST公司）；小鼠抗大鼠FN抗體（美國BD Biosciences公司）；小鼠抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin）一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；電化學發(fā)光（ECL）液（美國Thermo公司）；二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；其他化學試劑為國產分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♂，體質量200～220 g，購于贛南醫(yī)學院動物實驗中心，生產合格證號：SCXK（贛）2014-0001。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取正常成年SD大鼠，在無菌條件下取出腎組織，去除腎包膜，采用分樣篩法分離出腎小球，通過優(yōu)生選擇法進行MCs分離，經(jīng)免疫熒光細胞化學技術鑒定，原代系膜細胞平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體免疫熒光染色呈陽性，去氧腎上腺素（Nephrin）抗體間接免疫熒光呈陰性[12-13]。將原代培養(yǎng)的MCs置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)基。本研究采用6～16代MCs進行試驗。

2.2 MTT法檢測DMY對HG刺激的MCs增殖的影響

取對數(shù)生長期的MCs，制成密度為1.0×105mL－1的細胞懸液，以每孔180 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后將細胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY低濃度組（30 mmol/L葡萄糖+22.5 μmol/L DMY）、DMY中濃度組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）、DMY高濃度組（30 mmol/L葡萄糖+90 μmol/L DMY）。培養(yǎng)48 h后，向96孔板內加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去掉培養(yǎng)液，向各孔中加入150 μL的DMSO，待藍色結晶物完全溶解后，用酶標儀測量各孔的光密度（OD）值，測定波長為570 nm。細胞存活率（%）＝試驗組OD值/正常組OD值×100%。

2.3 分子對接法分析DMY與Smad2的結合情況

首先采用ISIS Draw軟件來繪制DMY配體的2D結構，再運用Online Demos VIEWDD軟件轉化成3D結構，保存為配體PDB文件。然后下載PDB受體文件，通過應用Chimera軟件來刪除非核心區(qū)肽鏈和原有配體及水分子，從而得到簡化后的PDB受體文件。然后準備對接文件，首先打開AutoDock Tools軟件生成配體PDBQT文件及受體PDBQT文件，再運用Python來修改受體PDBQT文件中錯誤的電荷參數(shù)，接著運用AutoDock Tools軟件對上述2個文件設定對接模式參數(shù)和對接網(wǎng)格，獲得DPF文件及GPF文件。用AutoGrid 4軟件使GPF文件生成相應的Map對接文件，再用AutoGrid 4軟件將其中的DPF文件與由GPF文件生成Map文件進行對接計算得到DLG數(shù)據(jù)文件，用AutoDock Tools軟件分析DLG數(shù)據(jù)文件，得到吉布斯自由能（ΔG）及抑制常數(shù)Ki等相關分子對接數(shù)據(jù)。當ΔG≤0，說明配體與受體容易結合，且ΔG越小分子間的結合越穩(wěn)定；Ki值越小說明配體與受體結合能力越強。

2.4 Western blot法檢測細胞中Smad2的磷酸化水平與細胞外基質蛋白FN的表達

取對數(shù)生長期的MCs，制成密度為1.0×105mL－1的細胞懸液，按每皿2 mL接種于直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞達到80%融合時，換無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步化。然后將細胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY對照組（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），每組設6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，在培養(yǎng)皿中加入細胞裂解液120 μL，然后置于4℃冰箱中裂解10 min。用細胞刮刷將細胞刮下，將其吸入EP管中后置于離心半徑為8 cm的冷凍離心機中離心（1 2000 r/min）10 min，收集上清。采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品中的蛋白成分，各泳道蛋白上樣量為50 μg。再將凝膠上的蛋白轉印到0.45 μm硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%脫脂奶粉封閉，然后與一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后再與HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗膜。ECL檢測免疫印跡信號，用灰度值表示蛋白表達量。將正常組蛋白表達量的灰度值看作1，其他組相應蛋白灰度值和正常組蛋白灰度值的比值就是該蛋白量。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對所得結果進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多個樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 DMY對HG環(huán)境下MCs增殖的影響

與正常組比較，HG組細胞的OD值顯著升高（P＜0.05），說明HG能夠誘導MCs增殖。與HG組比較，DMY各濃度組細胞的OD值均顯著降低（P＜0.05），且呈濃度效應關系，可見DMY可明顯抑制HG誘導的MCs增殖，結果見表1。

表1 DMY對系膜細胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

表1 DMY對系膜細胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.HG group，#P＜0.05

細胞存活率，%100.00 128.81 72.03 45.34 39.62組別正常組HG組DMY低濃度組DMY中濃度組DMY高濃度組OD值0.472±0.083 0.608±0.105＊0.340±0.041#0.214±0.037#0.187±0.015#

3.2 DMY與Smad2的分子對接數(shù)據(jù)

通過運用計算機軟件進行計算并模擬分析，得到配體DMY與Smad2蛋白分子結合的ΔG為－5.64 kJ/mol，Ki為73.53 μmol/L。當ΔG≤0，配體與受體的結合會比較容易，且其數(shù)值與結合傾向的穩(wěn)定性呈負相關。在圖1三維結合模擬中，筆者也發(fā)現(xiàn)配體化合物DMY與其模擬結合的蛋白（Smad2）在第465、464、461、458這4個氨基酸殘基位點有氫鍵供體與受體的結合。DMY與Smad2蛋白的分子對接立體空間示意圖見圖1。

圖1 DMY與Smad2蛋白的分子對接立體空間示意圖Fig1Moleculardockingthree-dimensional space diagram of DMY with Smad2 protein

3.3 DMY對HG環(huán)境下細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達的影響

與正常組比較，HG組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平顯著升高（P＜0.05），DMY對照組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明HG能夠誘導MCs中Smad2的磷酸化及細胞外基質蛋白FN表達上調。與HG組比較，DMY組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平顯著降低（P＜0.05），說明DMY能夠顯著抑制HG誘導的MCs中Smad2的磷酸化及細胞外基質蛋白FN表達上調。DMY對照組和正常組比較，細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明DMY對正常MCs中Smad2磷酸化及細胞外基質蛋白FN表達沒有明顯影響，結果見圖2、圖3。

圖2 各組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達的電泳圖Fig2Electrophoresischartsofexpressions ofp-Smad2andextracellularmatrix protein FN in each group

4 討論

DKD的主要病理學表現(xiàn)為腎體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜細胞增生、肥大及系膜區(qū)ECM進行性積聚。FN是TGF-β/Smads信號通路下游的一個重要靶蛋白，也是ECM的主要組成成分之一，在DKD動物模型中表達會顯著增加，是DKD腎小球硬化主要指標之一[14-16]。本研究通過MTT試驗發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度DMY均能夠顯著抑制HG誘導的MCs增殖。

TGF-β/Smads信號通路是腎纖維化的一個經(jīng)典的信號通路，在糖尿病大鼠和HG刺激的系膜細胞中該通路是異常激活的，其激活可誘導腎小球和腎小管的細胞肥大，介導足細胞損傷，促進系膜細胞增生、基底膜增厚，以及促進腎間質纖維化，是發(fā)病機制的最后共同通路，因而通過抑制TGF-β/Smads信號通路可以減緩DKD的進程[17-20]。而Smad2是TGF-β/Smads信號通路下游的一個重要信號分子，TGF-β主要是通過調節(jié)其下游的Smad2和Smad3的磷酸化來發(fā)揮生物學功能[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，DMY能夠抑制HG誘導下MCs中Smad2的磷酸化與細胞外基質蛋白FN的表達。

綜上所述，本研究結果表明，DMY可能是通過與Smad2結合，抑制了Smad2的磷酸化，抑制了DKD大鼠MCs中TGF-β/Smads信號通路激活，繼而影響MCs中FN的堆積，從而改善DKD的腎小球硬化。

圖3 各組細胞中p-Smad2及細胞外基質蛋白FN表達的測定結果Fig 3Determination results of protein expressions of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in each group

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Effect of Dihydromyricetin on High Glucose-induced Glomerular Mesangial Cell Proliferation and Fibronectin Accumulation

LI Jialin1，GUO Xiaohua1，WU Yanjiao1，HUANG Zhiwei1，LIU Siqi1，WU Suzhen2（1.School of Pharmacy，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China；2.School of Basic Medicine，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of dihydromyricetin（DMY）on high glucose（HG）-induced glomerular mesangial cell（MCs）proliferation and fibronectin（FN）accumulation，and explore its mechanism for diabetic nephropathy glomerulosclerosis.METHODS：Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY low-concentration，medium-concentration，high-concentration groups（30 mmol/L glucose+22.5，45，90 μmol/L DMY）.After incubating 48 h，MTT was used to detect the proliferative activity[reflected by the optical density（OD）value]of cells；molecular docking method was adopted to conduct simulation analysis for DMY binding state with Smad2.Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY group（30 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）and DMY control group（5.5 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）.After incubating 5 h，Western blot was used to detect the expression levels of phosphorylated Smad2（p-Smad2）and extracellular matrix protein FN.RESULTS：Results of MTT detection showed，compared with normal group，OD values in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，OD values in DMY each concentration group were significantly reduced（P＜0.05）.The Gibbs free energy（ΔG）of DMY and Smad2 protein was－5.64 kJ/mol，Kiwas 73.53 μmol/L，and there were hydrogen bond donor and receptor binding in No.465，464，461，458 amino acid residues.Results of Western blot showed，compared with normal group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in DMY group were significantly decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：DMY inhibits HG-induced MCs proliferation and improves diabetic nephropathy glomerulosclerosis by combining with Smad2 and inhibiting Smad2 phosphorylation to reduce the extracellular matrix protein FN expression.

Dihydromyricetin；Glomerular mesangial cells；Proliferation；Fibronectin；Molecular docking

R587.2

A

1001-0408（2017）34-4784-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.08

國家自然科學基金資助項目（No.31660334）；江西省青年科學基金資助項目（No.20161BAB215217）

＊副教授，碩士。研究方向：天然藥物活性成分。電話：0797-8169775。E-mail：jialinli2005@126.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：糖尿病腎病發(fā)病機制及藥物防治。電話：0797-8169770。E-mail：wusuzhen2005@126.com

2017-06-12

2017-09-17）

（編輯：林靜）