王 瑩, 王 洲, 章 勤, 王青青, 蔣 瀾, 吳 璇, 丁恒武, 劉必融, 薛正蓮, 闞顯照

(1. 安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物信息研究所, 蕪湖 241000; 2. 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 蕪湖 241000)

黏質(zhì)沙雷氏菌plaA及plaS的生物信息學(xué)分析

王 瑩1,2, 王 洲2, 章 勤1, 王青青1, 蔣 瀾1, 吳 璇1, 丁恒武1, 劉必融1, 薛正蓮2, 闞顯照1

(1. 安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物信息研究所, 蕪湖 241000; 2. 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 蕪湖 241000)

磷脂酶A1是一類(lèi)水解磷脂的酶類(lèi)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)磷脂酶A1基因及輔助蛋白基因進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究磷脂酶提供基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌plaA(Phospholipase A1)及plaS(accessory protein) 進(jìn)行克隆和測(cè)序，對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列特征進(jìn)行分析；對(duì)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)；同時(shí)運(yùn)用ML、MP和BI 3種方法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，plaS的dN/dS的值較plaA高，所受的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快；PlaA蛋白和PlaS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)都以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主；plaA與plaS聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率較16S單獨(dú)構(gòu)建的支持率高。基于plaA、plaS和 16S 3個(gè)基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，解脲沙雷氏菌和嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌都與黏質(zhì)沙雷氏菌聚為一支，在親緣關(guān)系上，這兩種沙雷氏菌可能跟黏質(zhì)沙雷氏菌更為接近。

磷脂酶A1基因；輔助蛋白基因plaS；沙雷氏菌；系統(tǒng)發(fā)育

磷脂酶A1是一類(lèi)水解磷脂sn-1位酰基的酶類(lèi)[1]，廣泛存在于自然界，在動(dòng)物[2-4]、植物[3,5]和微生物中均有發(fā)現(xiàn)。含有磷脂酶A1的微生物主要包括耶和森菌[6]、微白黃鏈霉菌[7]、曲霉菌[8]、假單胞桿菌[9]和沙雷氏菌[10-12]等。磷脂酶A1主要應(yīng)用于食品、制藥和生物燃料產(chǎn)業(yè)[13]。磷脂酶A1在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，目前研究材料多來(lái)自于沙雷氏菌屬。

Song等[14]將沙雷氏菌MK1磷脂酶A1基因(plaA)克隆到大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)其下游的plaS也參與該基因的表達(dá)；plaA編碼321氨基酸，與液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)和結(jié)腸炎耶爾森桿菌(Yersiniaenterocolitica)的plaA核苷酸序列相似度達(dá)到70%左右。付建紅[15]、蘇燕南[16]等發(fā)現(xiàn)plaS編碼一段為224個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白沒(méi)有酶活性，可能對(duì)于磷脂酶A1基因的表達(dá)有輔助作用。

目前，磷脂酶A1的研究主要是在工業(yè)上，而對(duì)于plaA及輔助蛋白基因plaS的生物信息學(xué)方面研究較少。沙雷氏屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并不是很清楚，且多是利用單基因16S進(jìn)行研究探討，利用單基因進(jìn)行研究的不足之處在于構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持率較低。所以本研究對(duì)我們自主分離的黏質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014的plaA和plaS進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，并利用生物信息學(xué)方法，主要探討：1)plaA和plaS的序列結(jié)構(gòu)特征；2)PlaA蛋白的理化性質(zhì)及沙雷氏屬間的進(jìn)化速率；3)產(chǎn)磷脂酶的沙雷氏菌屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。從而為進(jìn)一步探討磷脂酶的功能以及提高磷脂酶活性提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株的來(lái)源

黏質(zhì)沙雷氏菌菌株(ESE-2014)由安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心分離和培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA的提取

所選實(shí)驗(yàn)材料總DNA的提取采用傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法[17]。

1.2.2 磷脂酶A1基因的克隆

根據(jù)NCBI公布的磷脂酶A1基因序列(No.JX138535)及含有輔助蛋白的磷脂酶A1基因plaS序列(No.JX138537)設(shè)計(jì)引物(表1)分別擴(kuò)增磷脂酶A1基因plaA和含有輔助蛋白的磷脂酶A1基因plaS。以黏質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行克隆和回收并測(cè)序。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL, dNTPs (2 mmol/L) 3 μL, primer-F(5 μmol/L) 2.2 μL, primer-R (5 μmol/L) 2.2 μL, TaKaRaTaq(5 U/μL) 0.13 μL, template 1 μL, ddH2O 13.97 μL。PCR反應(yīng)體系為：70℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火20 s,72℃延伸2 min 30 s, 共4個(gè)循環(huán); 94℃變性20 s，53℃退火20 s, 72℃延伸2 min 30 s, 共36個(gè)循環(huán); 最后再72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化克隆選取陽(yáng)性克隆，克隆試劑盒為p-EASY-T5 Zero Cloning Kit。挑取的陽(yáng)性克隆由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用的引物

1.2.3 基因的核苷酸序列分析及堿基替代模型分析

運(yùn)用BioEdit 7.2.5分析plaA和plaS的AT含量；使用ModelGenerator V. 0.851軟件對(duì)核苷酸替代最適模型進(jìn)行分析，通過(guò)Bayesian Information Criterion(BIC)統(tǒng)計(jì)后估算。

1.2.4 磷脂酶A1蛋白分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)主要利用ExPASy在線軟件分析(http://web.expasy.org/protparam/)；二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)則是利用在線網(wǎng)站NPS@SOMPA進(jìn)行分析(https://npsa-prabi.ibcp.fr);利用TMHMM 2.0實(shí)現(xiàn)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)采用PHD[18]軟件在線分析平臺(tái)預(yù)測(cè)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.2.5 進(jìn)化速率分析

基于磷脂酶A1基因plaA和含有輔助蛋白的磷脂酶A1基因plaS序列，對(duì)本文測(cè)序的序列并聯(lián)合GenBank中已釋放的其他10個(gè)種50條序列進(jìn)行選擇壓力分析，所受的選擇壓力分析使用Datamonkey(http://www.datamonkey.org)[19]在線分析平臺(tái)，分別對(duì)plaA、plaS的平均dN/dS進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

建樹(shù)前使用MAFFT軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

最大簡(jiǎn)約法 (MP) 分析，使用PAUP*4.0b10軟件。采用啟發(fā)式 (heuristic) 搜索最大簡(jiǎn)約樹(shù) (MP)，序列添加方式選用100次的隨機(jī)分類(lèi)群重復(fù)，樹(shù)等分與重連分支交換法 (TBR)獲取系統(tǒng)樹(shù)。自展法(bootstrap)重復(fù)檢驗(yàn)1000次，用以分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。

最大似然法(ML)分析，使用RaxML GUI v.1.3.1軟件。核苷酸替代模型采用GTRCAT，ML + slow bootstrap，run 10次，通過(guò)1000次重復(fù)的自展法評(píng)估ML樹(shù)上分支的可靠性。

貝葉斯法(BI)分析，使用軟件MrBayes 3.2.3軟件構(gòu)建貝葉斯樹(shù)，氨基酸和核苷酸的序列分段計(jì)算模型，起始樹(shù)設(shè)為隨機(jī)樹(shù)，3條熱鏈和一條冷鏈共4條馬爾可夫鏈(Markov chains)，運(yùn)算10 000 000代(每隔1000代抽樣1次)，前25%的樹(shù)舍棄，余下的75%的樹(shù)推測(cè)貝葉斯后驗(yàn)概率和支持率高于50%的一致樹(shù)。馬爾可夫鏈都運(yùn)算2次，這樣可以保證得到可信的貝葉斯后驗(yàn)概率。

2 結(jié)果與分析

2.1 plaA及plaS的擴(kuò)增和序列分析

利用兩對(duì)引物KLSERF3/ KLSERR3、KLPERF4/KLSERR4分別對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌plaA、plaS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得963 bp、756 bp兩條序列。將所得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，plaA與黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06plaA(No.JX138535)相似度達(dá)到99%，plaS與黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06的plaS(No.JX138537)相似度達(dá)到99%，由此推測(cè)，擴(kuò)增獲得的目的片段為plaA、plaS序列。

沙雷氏菌plaA長(zhǎng)度為963到969 bp，AT含量為33.64%～47.25%(表2)。以黏質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014為例，基因長(zhǎng)度為963 bp，AT含量為35.83%。plaS長(zhǎng)度在705到772 bp，AT含量為30.15%～46.83%。小腸結(jié)腸炎耶爾森桿菌和鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)plaA、plaS序列AT%含量最高，plaA序列AT含量分別為50.97%～50.36%，plaS序列AT含量分別為52.51%～51.60%。黏質(zhì)沙雷氏菌AT含量在34%～38%左右，菌株FGI94 AT為38.42%；普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)plaA序列AT含量在39%～41%，plaS序列AT含量在38%左右。在沙雷氏菌屬中，其中居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)plaA、plaS序列AT含量最高，無(wú)花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)plaA、plaS序列AT含量最低，分別為33.64%～30.15%。

表2 本研究物種的來(lái)源及plaA和plaS的GenBank登錄號(hào)

(續(xù)表2 Continued Table 2)

菌株StrainsplaA登錄號(hào)GenBankaccessionnumberplaS登錄號(hào)GenBankaccessionnumber液化沙雷氏菌SerratialiquefaciensHUMV-21CP011303CP011303液化沙雷氏菌SerratialiquefaciensATCC27592NC_021741NC_021741液化沙雷氏菌SerratialiquefaciensFDAARGOS_125CP014017CP014017普城沙雷氏菌SerratiaplymuthicaAS9NC_015567NC_015567普城沙雷氏菌SerratiaplymuthicaV4CP007439CP007439普城沙雷氏菌Serratiaplymuthica3Rp8CP012096CP012096普城沙雷氏菌Serratiaplymuthica3Re4-18CP012097CP012097普城沙雷氏菌SerratiaplymuthicaS13NC_021659NC_021659普城沙雷氏菌SerratiaplymuthicaRVH1NZ_ARWD01000001NZ_ARWD01000001普城沙雷氏菌Serratiaplymuthica4Rx13NC_021591NC_021591普城沙雷氏菌SerratiaplymuthicaA153LRQU01000001LRQU01000001居泉沙雷氏菌SerratiafonticolaGS2CP013913CP013913居泉沙雷氏菌SerratiafonticolaDSM4576CP011254CP011254格氏沙雷氏菌SerratiagrimesiiA2JGVP01000019JGVP01000019無(wú)花果沙雷氏菌SerratiaficariaNBRC102596BCTS01000010BCTS01000010深紅沙雷氏菌Serratiarubidaea1122CP014474CP014474小腸結(jié)腸炎耶爾森桿菌Yersiniaenterocolitica8081CP009846CP009846鼠疫耶爾森氏菌YersiniapestisCO92CP009973CP009973

圖1 PlaA蛋白序列比對(duì)

Fig 1 PlaA protein sequence alignment

2.2 磷脂酶A1蛋白質(zhì)分析

2.2.1 磷脂酶A1蛋白基本信息的獲取及理化特性分析

通過(guò)同源比對(duì)(相似度高于75%)，利用NCBI網(wǎng)站獲取沙雷氏菌磷脂酶A1蛋白序列，利用ExPASy在線軟件分析它們的理化性質(zhì)。PlaA蛋白分子質(zhì)量大約在28.9～33.7 ku，等電點(diǎn)為4.71～5.58，其中居泉沙雷氏菌蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)較高，居泉沙雷氏菌菌株GS2等電點(diǎn)最高。

2.2.2 PlaA蛋白序列比對(duì)分析

對(duì)沙雷氏屬10個(gè)種的PlaA蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)分析(圖1)。沙雷氏屬的PlaA蛋白序列長(zhǎng)度為318～320個(gè)氨基酸, 序列相對(duì)比較保守，有多個(gè)保守區(qū)域，分別在45～54、56～74、91～99、195～211、214～224、244～258的位置。其中居泉沙雷氏菌和深紅沙雷氏菌在8～55的位置變異比較大。

2.2.3 磷脂酶A1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)于黏質(zhì)沙雷氏菌菌株ESE-2014的PlaA和PlaS蛋白，利用在線網(wǎng)站NPS@SOMPA預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。黏質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014 PlaA和PlaS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都主要是以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，PlaA蛋白α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例分別為38.75%和35.94%，PlaS蛋白α螺旋占的比例高達(dá)58.57%，無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例為35.94%。通過(guò)TMHMM分析表明，PlaA蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，PlaS蛋白則有一個(gè)跨膜區(qū)，所在的位置為7～26。

2.2.4 磷脂酶A1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要預(yù)測(cè)方法包括同源建模、折疊識(shí)別和從頭預(yù)測(cè)，由于已知蛋白的序列與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中模板蛋白的序列一致性小于30%，所以采用折疊識(shí)別法預(yù)測(cè)PlaA和PlaS蛋白的三維結(jié)構(gòu)。利用phyre2在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，折疊子d3tgla與PlaA蛋白的匹配性非常高，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由數(shù)個(gè)α螺旋和β片組成，PlaS蛋白則是無(wú)規(guī)則卷曲連接的多個(gè)α螺旋構(gòu)成，與折疊子c4cj9A匹配性非常高(圖2)。

圖2 黏質(zhì)沙雷氏菌ESE-2014 PlaA/PlaS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

注：圖左為PlaA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)， 圖右為PlaS蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.5 沙雷氏菌的進(jìn)化速率分析

每個(gè)基因的進(jìn)化速率都不相同，同一個(gè)基因的不同序列位置進(jìn)化速率也不同，因此，在進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化之前對(duì)基因的進(jìn)化速率進(jìn)行評(píng)估比較相當(dāng)重要。本文通過(guò)對(duì)plaA及plaS在沙雷氏屬的非同義替換(dN)和同義替換(dS)之間的比值進(jìn)行計(jì)算，分別從種上和種下水平來(lái)探討plaA和plaS的進(jìn)化特征。在遺傳學(xué)中，dN/dS表示的是非同義替換(dN)和同義替換(dS)之間的比值。核苷酸位點(diǎn)可以根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性(degeneracy)分成兩類(lèi)：同義替換位點(diǎn)(Synonymous site)和非同義替換位點(diǎn)(Non-synonymous site)，同義替換是指引起所編碼的氨基酸發(fā)生的替換是不改變，同義替換受到的選擇作用比較??；非同義替換是指所編碼的氨基酸發(fā)生改變的替換。如果dN/dS>1，則認(rèn)為基因受正選擇(positive selection)，dN/dS=1，則基因受中性進(jìn)化(neutral evolution)，dN/dS<1時(shí)，則基因受純化選擇(purify selection)。在黏質(zhì)沙雷氏菌種下水平上，黏質(zhì)沙雷氏菌plaA的dN/dS為0.105，plaS為0.158；在普城沙雷氏菌種下水平上，普城沙雷氏菌plaA的dN/dS為0.124，plaS為0.288；沙雷氏屬plaA的dN/dS為0.135，plaS為0.202。在沙雷氏菌種下水平上，黏質(zhì)沙雷氏菌、普城沙雷氏菌plaS的dN/dS值較高；在沙雷氏屬間，也是plaS的dN/dS值較高，plaS的所受的選擇壓力相對(duì)較小，進(jìn)化速率相對(duì)較快。

2.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)Mafft軟件序列比對(duì)，我們得到了用于系統(tǒng)發(fā)育分析的數(shù)據(jù)矩陣: 1)plaA序列長(zhǎng)度為1005 bp。2)plaS序列長(zhǎng)度為775 bp。3)16S序列長(zhǎng)度為1545 bp。4)plaA和plaS整合序列組長(zhǎng)度為1780 bp。5)plaA、plaS和16S整合序列組長(zhǎng)度為3308 bp。用Bayesian Information Criterion(BIC)法確定plaA序列的最佳模型為T(mén)rN+G；plaS為K81uf+G，16S序列的最佳模型為HKY+I。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖的枝長(zhǎng)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)自最大似然圖。鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)作為外類(lèi)群，其余物種作為內(nèi)類(lèi)群。節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字按順序分別表示ML、MP的bootstrap支持率及BI法的后驗(yàn)概率。用MP、ML和BI 3種方法對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行分析，均得到相同或相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，不同之處是節(jié)點(diǎn)的支持率(或后驗(yàn)概率)及枝長(zhǎng)。

基于plaA、plaS聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，主要分成六大枝，各分支的支持率和后驗(yàn)概率較高，同一個(gè)物種不同菌株聚在一起?；趐laA、plaS和16S聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，對(duì)沙雷氏屬10個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行探討，ML和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，支持率較高。

3 討論

基于plaA、plaS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，同一個(gè)物種的不同菌株大都聚在一起，黏質(zhì)沙雷氏菌聚為一大支，再和無(wú)花果沙雷氏菌聚為一支，居泉沙雷氏菌單獨(dú)聚為一支位于基部。Bhadra等[20]認(rèn)為解脲沙雷氏菌NiVa51T利用尿素作為氮源，DNA雜交及生理學(xué)和生物學(xué)上的實(shí)驗(yàn)表明該菌株基因型和表型都不同于沙雷氏菌，提出NiVa51T作為一個(gè)新種；Zhang等[21]同樣提出嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌DZ0503SB1T是一個(gè)新種?；诹字富驑?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，解脲沙雷氏菌Lr5/4 LG59與黏質(zhì)沙雷氏菌RSC-14互為姐妹類(lèi)群，ML和MP的bootstrap值分別為88和90，BI后驗(yàn)概率為1.00；嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌DZ0503SB1與黏質(zhì)沙雷氏菌B3R3聚為一小支，ML和MP的bootstrap值分別為70和62，BI后驗(yàn)概率為0.93，然后和黏質(zhì)沙雷氏菌U36365聚為一支，支持率和后驗(yàn)概率都非常高，ML和MP支持率都為100，BI后驗(yàn)概率為1.00；解脲沙雷氏菌和嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌都聚在黏質(zhì)沙雷氏菌這一大支上，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上來(lái)看，解脲沙雷氏菌和嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌與黏質(zhì)沙雷菌親緣關(guān)系更為接近。

圖3基于plaA、plaS的核苷酸序列運(yùn)用ML、MP和BI法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(各節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字指的分別是ML、MP支持率和貝葉斯后驗(yàn)概率)

Fig 3 Phylogenetic tree based on the nucleotide dataset ofplaA,plaSgenes using ML, MP and BI methods. Numbers by nodes refer to ML, MP bootstrap values and Bayesian posterior probability

注：系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖采用ML法的樹(shù)圖；“*”表示ML、MP支持率為100(%)或貝葉斯后驗(yàn)概率為1.00；“-”表示ML、MP支持率低于50%或后驗(yàn)概率小于0.5

基于plaA、plaS和16S構(gòu)建基因樹(shù)(圖4)，使用了最大簡(jiǎn)約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)，其中ML法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，BI法存在微小差異。黏質(zhì)沙雷氏菌和解脲沙雷氏菌聚為一支，再和嗜線蟲(chóng)沙雷氏菌聚在一起；居泉沙雷氏菌單獨(dú)聚為一支，ML和MP支持率都為100%，BI后驗(yàn)概率為1。García Fraile[22]利用16S構(gòu)建的ML樹(shù)中有大都一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但是大都非常低，說(shuō)明僅用16S構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)探討沙雷氏屬間的關(guān)系不夠充分。而基于磷脂酶基因和16S聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ML、MP和BI法的支持率和后驗(yàn)概率都較16S單獨(dú)構(gòu)樹(shù)高，能夠反映沙雷氏菌種間的發(fā)育關(guān)系。

圖4基于plaA、plaS和16S核苷酸序列的沙雷氏屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(各節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字指的分別是ML、MP支持率和貝葉斯后驗(yàn)概率)

Fig 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide dataset ofplaA,plaSand 16S using ML, MP and BI methods ofSerratia. Numbers by nodes refer to ML, MP bootstrap values and Bayesian posterior probability

注：系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖采用ML法的樹(shù)圖；“*”表示ML、MP支持率為100(%)或貝葉斯后驗(yàn)概率為1.00；“-”表示ML、MP支持率低于50%或后驗(yàn)概率小于0.5

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BioinformaticsanalysisofplaAandplaSinSerratiamarcescens

WANG Ying1， 2, WANG Zhou2, ZHANG Qin1, WANG Qing-qing1, JIANG Lan1, WU Xuan1, DING Heng-wu1, LIU Bi-rong1, XUE Zheng-lian2, KAN Xian-zhao1

(1. The Institute of Bioinformatics, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000; 2. College of Biological and Chemical Engineering, Anhui Engineering University, Wuhu 241000, China)

Phospholipase A1 (plaA) is an enzyme that hydrolyzes phospholipids. We used bioinformatics methods to analyzeplaAand its accessory protein gene (plaS), which will provide a basis for further study of phospholipase. We cloned and sequenced theplaAandplaSofSerratiamarcescens, and the characteristics of nucleotide and amino acid sequence were analysed. Furthermore, we also predicted the secondary structure and tertiary structure of PlaA and PlaS protein. Phylogenetic trees were reconstructed using maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) and bayesian inference (BI) methods. The results showed that the dN / dS ofplaSwas higher than that ofplaA, suggesting that the selection pressure is stronger and the evolution rate is slower. The secondary structure of PlaA and PlaS protein were mainly composed of α-helix and random coil. Bootstrap values of 16S tree were lower than that of trees referred from two genes (plaA+plaS). Based on the phylogenetic tree which constructed byplaA，plaSand 16S, bothSerratianematodiphilaandS.ureilyticawere clustered together withS.marcescens. The two strains ofSerratiamay be more related toS.marcescens.

phospholipase A1; accessory protein geneplaS;Serratia; phylogeny

2016-11-08；

2016-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.31471615)

王 瑩，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锘蚪M學(xué), E-mail:wangyingad@163.com

薛正蓮，教授，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物育種及發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，E-mail: xuezhen0851@sina.com；闞顯照，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿酉到y(tǒng)與進(jìn)化，E-mail: xianzhao@ahnu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.001

Q951.3

A

2095-1736(2017)06-0001-06