張燕靈，李靖宇，劉建利，劉雅琴，張翼飛，趙 吉，鄧 蔚

(1. 北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 銀川 750021； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院， 呼和浩特 010010； 3. 內(nèi)蒙古大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院, 呼和浩特 010021)

基于高通量測序技術(shù)對(duì)沙湖水體細(xì)菌多樣性的分析

張燕靈1，李靖宇1，劉建利1，劉雅琴1，張翼飛2，趙 吉3，鄧 蔚1

(1. 北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 銀川 750021； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院， 呼和浩特 010010； 3. 內(nèi)蒙古大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院, 呼和浩特 010021)

為了解沙湖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，采用E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒提取水樣總DNA，對(duì)細(xì)菌群落的16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進(jìn)行MiSeq測序，利用Mothur軟件和R語言進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的分析。共得到427 975條優(yōu)化序列，在97%的相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到20門，50綱，95目，161科，276屬。樣點(diǎn)A、B、C、D的OTU分別為497、496、487和511。優(yōu)勢類群為變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)。沙湖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但不同位點(diǎn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成以及多樣性差異不顯著。

細(xì)菌群落；沙湖；水體；MiSeq測序

細(xì)菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在湖泊的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用。由于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)限制，利用平板培養(yǎng)法測定的細(xì)菌類群數(shù)量只能占到湖泊中實(shí)際存在的細(xì)菌總數(shù)的1%～10%[1]。近年來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為細(xì)菌多樣性研究開辟了新的途徑，不斷革新著我們對(duì)細(xì)菌多樣性的認(rèn)識(shí)。高通量測序可獲得的基因序列以百萬甚至億萬計(jì)，不但分辨率高，而且可以同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品，是分析自然界中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度的重要工具[2]。目前，許多學(xué)者對(duì)寧夏沙湖的浮游植物和浮游動(dòng)物進(jìn)行了研究報(bào)道[3-5]，但是關(guān)于沙湖水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究還未見報(bào)道。據(jù)此，本研究通過高通量測序技術(shù)對(duì)寧夏沙湖細(xì)菌群落開展研究，從而了解沙湖不同位點(diǎn)的細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)、豐度和多樣性，為深入認(rèn)識(shí)湖泊的生物地球化學(xué)循環(huán)提供細(xì)菌生態(tài)學(xué)視角。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水樣取自寧夏回族自治區(qū)平羅縣沙湖旅游區(qū)(38°47′N～38°50′N，106°20′E～106°23′E)。水體樣品的采集時(shí)間為2015年10月2日，根據(jù)沙湖的形狀選取12個(gè)取樣點(diǎn)A1～A3，B1～B3，C1～C3，D1～D3(圖1)。將水樣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存于4℃冰箱備用。取樣點(diǎn)作圖利用Landsat 8影像，2014年10月23日下載于美國地質(zhì)調(diào)查局(www.usgs.gov)，利用band5、band4、band3 3個(gè)波段合成假彩色影像圖，然后和band8融合為分辨率為15 m的最終影像圖。利用arcgis10.0，疊加取樣點(diǎn)坐標(biāo)即為取樣示意圖。

圖1 沙湖采樣點(diǎn)設(shè)定

1.2 方法

1.2.1 水樣基因組總DNA提取及擴(kuò)增

每個(gè)點(diǎn)樣品取2.5 L水樣后經(jīng)0.22 μm濾膜(直徑150 mm; Millipore)過濾，并將濾膜在無菌條件下剪碎。然后采用E.Z.N.A.?water DNA Kit試劑盒(Omega, USA)，參照說明書提取沙湖水體細(xì)菌DNA。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

20 μL PCR反應(yīng)體系：2.0 μL 2.5×10-3mol/L dNTPs，0.8 μL 0.5×10-5mol/L 338F (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)，0.8 μL 0.5×10-5mol/L 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′) ，2.0 μL 10×緩沖液，0.2 μL BSA，10 ng模板以及0.2 μL，5 U/μLrTaq聚合酶，最后加ddH2O到20 μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，28個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

獲得的PCR產(chǎn)物使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收；使用Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量并將每個(gè)樣品按測序量比例混合，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行Illumina MiSeq雙端測序。

1.2.2 Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)分析

利用Trimmomatic和FLASH軟件，過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截取后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的read；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。進(jìn)一步運(yùn)用RDP Classifier 軟件包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，在97%置信度下將每個(gè)樣品中的所有16S rRNA基因序列進(jìn)行分類，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。Alpha多樣性分析采用mothur[7]version v.1.30.1指數(shù)分析，設(shè)置指數(shù)評(píng)估的OTU相似水平為97%，計(jì)算多樣性指數(shù)：菌群豐度指數(shù)，Chao和Ace；菌群多樣性指數(shù)，Shannon和Simpson；深度指數(shù)，Coverage。應(yīng)用R語言進(jìn)行PCA統(tǒng)計(jì)分析和作圖，其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，顏色和形狀相同的點(diǎn)同屬于一個(gè)組，兩個(gè)點(diǎn)之間的距離越遠(yuǎn)表示兩個(gè)樣本組成差異越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

通過各樣品中細(xì)菌的16S rRNA 基因 V4-V5 區(qū)測序，12個(gè)樣品測得的高質(zhì)量序列為427 975條，其中A1為37 018，A2為38 758，A3為31 082，B1為31 032，B2為32 579，B3為43 747，C1為34 558，C2為33 599，C3為38 466，D1為29 210，D2為39 143，D3為38 783。如圖2所示，由Shannon-Wiener 指數(shù)結(jié)合測序深度繪制的12個(gè)樣品曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的細(xì)菌信息。

圖2 樣品Shannon-Wiener曲線圖

2.2 沙湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由細(xì)菌樣本聚類樹與柱狀圖組合分析可知樣本中細(xì)菌的組成、相對(duì)豐度及樣本間基于群落組成的層次聚類[9]。如圖3-A所示，在細(xì)菌分類學(xué)門水平上，高通量測序發(fā)現(xiàn)沙湖水樣12個(gè)取樣點(diǎn)擁有7個(gè)相同的優(yōu)勢細(xì)菌類群(豐度>0.7%為優(yōu)勢類群)，它們分別是變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi )。

各取樣點(diǎn)的細(xì)菌群落差異各不相同，這種差異體現(xiàn)在某些種群的相對(duì)豐度上，由圖3-A可知，A1和A2的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為相似，各細(xì)菌的相對(duì)豐度分別為：變形菌門，A1為32.13%，A2為29.72%；藍(lán)細(xì)菌門，A1為15.38%，A2為22.09%；放線菌，A1為29.19%，A2為27.17%；擬桿菌，A1為12.19%，A2為11.1%；厚壁菌門，A1為4.72%，A2為3.51%；疣微菌門，A1為2.97%，A2為2.52%；綠彎菌門，A1為1.73%，A2為1.87%。對(duì)于相對(duì)豐度<0.7%的弱勢細(xì)菌類群，A1中的細(xì)菌總量為1.68%，A2為1.75%。其次為B1和B2，各細(xì)菌的相對(duì)豐度分別為：變形菌門，B1為24.85%，B2為26.36%；藍(lán)細(xì)菌門，B1為21.62%，B2為17.18%；放線菌，B1為23.95%，B2為28.4%；擬桿菌，B1為20.98%，B2為17.12%；厚壁菌門，B1為3.18%，B2為2.88%；疣微菌門，B1為2.66%，B2為4.1%；綠彎菌門，B1為1.09%，B2為2.2%。對(duì)于相對(duì)豐度<0.7%的弱勢細(xì)菌類群，B1中的細(xì)菌總量為1.67%，B2為1.77%。而C2中的各種細(xì)菌相對(duì)豐度與其他取樣點(diǎn)相差最大。C2中的各細(xì)菌相對(duì)豐度分別為：變形菌門為35.29%，藍(lán)細(xì)菌門為27.47%，放線菌為7.77%，擬桿菌為19.88%，厚壁菌門為1.41%，疣微菌門為4.47%，綠彎菌門為2.63%，弱勢細(xì)菌總量為1.09%。

圖3 沙湖水體細(xì)菌在門水平的高通量相對(duì)豐度及相似性

如圖3-B所示，同一區(qū)域3個(gè)樣點(diǎn)的測序數(shù)據(jù)看成一個(gè)整體，水樣A、B、C和D的細(xì)菌群落最為相似的是C和B，其次為D，而A和其他的相差最大，但差異不顯著。各細(xì)菌的相對(duì)豐度分別為：變形菌門，A為32.65%，B為22.77%，C為26.06%，D為27.61%；藍(lán)細(xì)菌門，A為15.09%，B為26.56%，C為30.36%，D為24.78%；放線菌，A為27.71%，B為22.48%，C為12.96%，D為12.98%；擬桿菌，A為13.52%，B為18.82%，C為20.35%，D為18.46%；厚壁菌門，A為4.97%，B為2.67%，C為2.35%，D為7.17%；疣微菌門，A為2.45%，B為3.59%，C為4.47%，D為3.66%；綠彎菌門，A為1.8%，B為1.54%，C為2.02%，D為3.44%。劣勢細(xì)菌總量分別為：A為1.82%，B為1.56%，C為1.43%，D為1.9%。

2.3 沙湖水體細(xì)菌多樣性

如表1所示，在97%相似度下，A、B、C、D的ace指數(shù)分別為509、511、502和516，chao指數(shù)分別為514、512、509和521，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均表明取樣點(diǎn)D的物種總數(shù)最多，而A、B、C、D的Shannon指數(shù)分別為4.47、4.24、4.46和4.62，Simpson指數(shù)分別為0.022、0.0383、0.0331和0.0243，Shannon指數(shù)表明取樣點(diǎn)D的物種種類最多，而Simpson指數(shù)表明取樣點(diǎn)A的物種種類最多。所有取樣點(diǎn)的Coverage均大于99%，說明本次測序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況。

表1 不同樣品細(xì)菌群落的豐度和多樣性指數(shù)

注：NT表示沒有檢測不同樣品之間的顯著性；P<0.05表示顯著

Rank-abundance[10]曲線是分析物種豐度和物種均勻度的一種方式，如圖4所示，在97%相似度的OTU下，D的細(xì)菌豐度最高，其次為A，而C的細(xì)菌豐度最低。并且D的細(xì)菌種類分布最均勻，而C的細(xì)菌種類分布最不均勻。

圖4 高通量測序分析沙湖水體細(xì)菌多樣性

2.4 主成分分析

通過PCA分析不同樣本OTU(97%相似性)組成來反映樣本間的差異[8]。本研究中PC1貢獻(xiàn)度為65.66%，PC2貢獻(xiàn)度為12.24%，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)77.9%，是變異的主要來源，可以解釋變量的絕大部分信息。如圖5所示，樣品A1、A2、B1和B2中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似；樣品C3和樣品D3距離最近，說明兩個(gè)取樣點(diǎn)間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為相似；樣品C2和樣品A1在PC2軸方向上間隔最大，說明兩個(gè)取樣點(diǎn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，且PC2是導(dǎo)致兩個(gè)取樣點(diǎn)差異的主要因素；A1和B3距離較大，說明兩個(gè)取樣點(diǎn)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，且PC1是導(dǎo)致兩個(gè)取樣點(diǎn)差異的主要因素。

圖5 主成分分析

3 討論

細(xì)菌多樣性是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈和食物網(wǎng)的重要組成部分，驅(qū)動(dòng)著湖泊生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數(shù)生物活性元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[11]。本研究采用高通量測序技術(shù)對(duì)沙湖水體細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，根據(jù)沙湖面積的大小及其形狀以及邱小琮等[4]的報(bào)道，布設(shè)了12個(gè)采樣點(diǎn)，共獲得427 975條優(yōu)化序列，覆蓋度數(shù)據(jù)達(dá)99%以上，可以反映沙湖水體細(xì)菌群落組成的真實(shí)情況。優(yōu)勢類群主要是變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門和擬桿菌門等4大類群，占細(xì)菌總量的80%以上。這與任麗娟等[11]報(bào)道的在湖泊水體中主要以變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門等5個(gè)淡水細(xì)菌門類基本一致，說明這些類群在湖泊水體生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。但在不同的取樣位點(diǎn)，以上四大類群細(xì)菌相對(duì)豐度變化沒有明顯規(guī)律，這可能與湖泊面積大小以及水體流動(dòng)造成營養(yǎng)物質(zhì)、光照、氧氣以及微生物分散程度不同等密切相關(guān)。這些因素會(huì)影響水體中微生物的多樣性以及均勻度， 本研究中shannon指數(shù)范圍在4.24～4.62之間，與淺水淡水湖泊——鄱陽湖類似[12](表層水體細(xì)菌多樣性shannon指數(shù)為4.18)，明顯低于養(yǎng)殖水體[13](shannon指數(shù)范圍在4.82～5.33)，高于青藏高原東北部10個(gè)湖區(qū)細(xì)菌多樣性[14](shannon指數(shù)范圍在0.56～1.48)，這也說明湖泊水體中微生物多樣性的高低會(huì)受到不同區(qū)域、湖泊類型、富營養(yǎng)化程度、海拔高低等因素的影響，或者不同尺度條件下微生物多樣性差異也會(huì)大不相同。在微生物群落結(jié)構(gòu)組成上，與未受到嚴(yán)重污染的我國最大的淡水湖泊——鄱陽湖[12]相比，沙湖水體中除了優(yōu)勢類群變形菌門、擬桿菌門和放線菌門外，藍(lán)細(xì)菌門出現(xiàn)且相對(duì)含量較高，這與當(dāng)?shù)毓まr(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，特別是農(nóng)田灌溉退水以及水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)等使得過量營養(yǎng)鹽進(jìn)入沙湖，致使沙湖水體的富營養(yǎng)化所致[15]。本研究通過MiSeq測序技術(shù)對(duì)沙湖水體進(jìn)行測序，首次全面揭示了寧夏沙湖水體內(nèi)的細(xì)菌的豐度和多樣性分析。這些結(jié)果將為沙湖水體質(zhì)量的預(yù)測和理解沙湖水體中物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)提供理論基礎(chǔ)。

[1]柴麗紅, 崔曉巧, 彭 謙, 等.青海兩鹽湖細(xì)菌多樣性研究[J]. 細(xì)菌學(xué)報(bào), 2004, 44(3):271-275.

[2]RINKE C, SCHWIENTEK P, SCZYRBA A, et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter[J]. Nature, 2013, 499(7459):431-437.

[3]崔安琪,翟 昊,于洪賢.寧夏沙湖浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)及多樣性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(9):121-124.

[4]邱小琮,趙紅雪.寧夏沙湖浮游植物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2011,32(1):20-26.

[5]朱明瑩,于洪賢,馬成學(xué),等. 沙湖浮游植物多樣性分析及水質(zhì)評(píng)價(jià)[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2015,28(3):39-43.

[6]WANG P, CHEN B, YUAN R, et al. Characteristics of aquatic bacterial community and the influencing factors in an urban river[J]. Science of the Total Environment, 2016, 569-570:382-389.

[7]SCHLOSS P D, GEVERS D, WESTCOTT S L. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies[J]. PLoS One, 2011, 6(12): e27310.

[8]WANG Y, SHENG H F, HE Y, et al. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater, intertidal wetland, and marine sediments by using millions of illumina tags[J]. Applied Environmental Microbiology, 2012, 78(23):8264-8271.

[9]SRINIVASAN S, HOFFMAN N G, MORGAN M T, et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria[J]. PLoS One, 2012, 7(6): e37818.

[10]BATES S T, CLEMENTE J C, FLORES G E, et al. Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J]. The ISME Journal, 2012, 7(3):652-659.

[11]任麗娟, 何 聃, 邢 鵬, 等. 湖泊水體細(xì)菌多樣性及其生態(tài)功能研究進(jìn)展[J]. 生物多樣性, 2013, 21(4): 421-432.

[12]寇文伯, 黃正云, 張 杰, 等. 鄱陽湖湖泊細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)—以松門山為例[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015, 35(23): 7608-7614.

[13]侯婷婷, 鐘志平, 劉 纓, 等. 青石斑魚海水循環(huán)水養(yǎng)殖水體的細(xì)菌群落特征[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2016, 56(2): 253-263.

[14]李 明, 郭 嘉, 石正國, 等. 春季青藏高原東北部湖泊細(xì)菌種類組成[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2013, 19(5):750-758.

[15]邱小琮, 趙紅雪, 孫曉雪. 寧夏沙湖浮游植物與水環(huán)境因子關(guān)系的研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2012, 33(7):2265-2271.

BacterialdiversityanalysisinShahuLakebased-onhigh-throughputsequencing

ZHANG Yan-ling1, LI Jing-yu1, LIU Jian-li1, LIU Ya-qin1, ZHANG Yi-fei2, ZHAO Ji3, DENG Wei1

(1. College of Biological Science & Engineering, Beifang Univesity of Nationality, Yinchuan 750021； 2. Inner Mongolia Academy of Environmental Sciences, Hohhot 010010； 3. College of Environment & Resources, Inner Mongolia University， Hohhot 010021, China)

In order to investigate the structure and diversity of microbial community in Shahu Lake, the total DNA of bacteria from water samples was extracted by E.Z.N.A.?Water DNA extraction kit, then the V4-V5 region of 16S rRNA gene was sequenced by MiSeq technology. Mothur software and R language were used to analyze the microbial community structure and diversity. A total of 427975 optimized sequences were obtained, and 20 Phylum, 50 Class, 95 Order, 161 Family, and 276 Genus were predicted at the 97% similarity level. The OTUs for A, B, C and D were 497, 496, 487 and 511, respectively. Proteobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes are dominant groups. The microbial community structure in Shahu Lake is complex, but the composition and diversity of microbial community structure are not significant at different sites.

microbial communities； Shahu Lake； water； MiSeq sequencing

2016-11-15；

2016-11-21

國家自然科學(xué)基金(41661053);寧夏自然科學(xué)基金(NZ15098);北方民族大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(44/4400302502)

張燕靈, 專業(yè)方向?yàn)樯锕こ? E-mail:2806186414@qq.com

李靖宇,博士,講師,研究方向環(huán)境微生物學(xué)、微生物生態(tài)學(xué), E-mail: lijingyu1986@126.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.056

Q93

A

2095-1736(2017)06-0056-04