張明亮，潘成武，王 崗，金功圣，錢 軍

·基礎(chǔ)研究·

二氫楊梅素通過抑制胰島素樣生長因子1受體下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號途徑增強赫賽汀對乳腺癌細胞的抑制作用

張明亮，潘成武，王 崗，金功圣，錢 軍

目的觀察胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信號激活對赫賽汀敏感性的影響，探討二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)增強赫賽汀敏感性的機制。方法大劑量胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)作用乳腺癌SKBR3細胞，激活I(lǐng)GF1R及其下游PI3K/PKB信號通路。分別給予赫賽汀、DMY、DMY聯(lián)合赫賽汀作用，Western Blot檢測細胞受體分子IGF1R、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)及下游信號蛋白胰島素受體底物1(insulin receptor substrates 1，IRS1)、PKB、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)表達及磷酸化水平變化；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法、流式細胞儀和Transwell小室侵襲實驗分別檢測腫瘤細胞增殖活性、凋亡及侵襲性變化。結(jié)果親代SKBR3細胞經(jīng)大劑量IGF1作用后，細胞內(nèi)IRS1磷酸化水平顯著升高(P＜0.01)，PKB磷酸化水平先緩慢上升、后逐漸平穩(wěn)，PTEN表達水平顯著下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；DMY可以顯著降低細胞內(nèi)IRS1(P＜0.01)及PKB(P＜0.01)磷酸化水平，提高PTEN表達水平(P＜0.01)；DMY聯(lián)合赫賽汀作用可顯著降低細胞的侵襲能力(P＜0.01)、增強細胞凋亡率(P＜0.01)。結(jié)論IGF1激活I(lǐng)GF1R下游PI3K/PKB信號通路可能是導(dǎo)致SKBR3細胞對赫賽汀產(chǎn)生耐藥的原因之一，DMY能夠通過抑制PI3K/PKB信號途徑增強赫賽汀的敏感度。

二氫楊梅素；赫賽??；人表皮生長因子受體2；胰島素樣生長因子1受體；信號通路

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)過表達型乳腺癌約占整個乳腺癌分子分型的30%左右，此類腫瘤惡性度高、侵襲性強，容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。靶向藥物赫賽汀(herceptin)是一種人源化單克隆抗HER2抗體，可以有效地與腫瘤細胞HER2結(jié)合，阻止HER2下游信號的傳導(dǎo)，抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，已廣泛應(yīng)用于臨床。然而其耐藥性發(fā)生率較高，目前已明確胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的下游信號通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)與HER2的下游信號通路重疊，IGF1R的異常激活是導(dǎo)致抗HER2治療失敗的重要原因之一，抑制IGF1R的過度激活是一種有效恢復(fù)赫賽汀敏感性的可行方案[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，純天然黃酮類化合物二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)具有顯著抗腫瘤效應(yīng)，其可以促進抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)的表達，抑制腫瘤細胞增殖[3-4]；且聯(lián)合化療應(yīng)用時，可以增加化療藥物的療效[5-7]。那么，DMY聯(lián)合赫賽汀治療，是否具有協(xié)同療效目前尚鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌SKBR3細胞株(上海奧陸生物科技有限公司)。

1.1.2 主要藥品與試劑 DMY(南京景竹生物科技有限公司)，赫賽汀(瑞士Roche公司)，達伯爾改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，中國賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，IGF1、IGF1R抗體、HER2抗體、胰島素受體底物1(insulin receptor substrates 1，IRS1)及磷酸化IRS1抗體、PKB及磷酸化PKB抗體、PTEN抗體(中國Boster公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑盒(日本Amresco公司)，二辛可寧酸蛋白定量盒(碧云天生物科技研究所)，單抗與二抗(中國Boster公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(中國Forma Scientific公司)，離心機(中國Hema醫(yī)學(xué)儀器生產(chǎn)有限公司)，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，顯微鏡(日本OLYMPUS)，酶標(biāo)儀(德國萊卡公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Ultra-Violet Products公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌SKBR3細胞株從液氮取出后，1 min內(nèi)連同凍存管一并放置于溫水(37℃)中復(fù)蘇，直至凍存管內(nèi)凍存液完全溶解后，置于離心機以1 000 r/min離心5 min。再置于超凈工作臺，棄去凍存管內(nèi)上清凍存液，向管內(nèi)加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液5 mL輕輕吹打至均勻后，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱。48 h后更換細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有IGF1 100 ng/mL。根據(jù)細胞培養(yǎng)情況，間隔2～3 d更換培養(yǎng)液或傳代。

1.2.2 Western Blot檢測 分別經(jīng)過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠的制備、細胞樣本上樣、電泳(1～1.5 h)、轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜、抗體封閉、一抗、洗膜、二抗、洗膜、顯影等步驟，分別給予IGF1(1 mg/mL)、DMY(40、80 μmol/L)、赫賽汀(25、50 μg/mL)作用后，測細胞IGF1R、HER2、IRS1、PKB、PTEN的表達及磷酸化狀態(tài)。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖抑制率 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，加樣至細胞密度1 000～10 000/孔，5%CO237℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入相應(yīng)濃度藥物，孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的光密度值。同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。分別給予梯度遞增的赫賽汀(0、1、2、4、8、16、32、64 μg/L)作用SKBR3及SKBR3-R細胞(經(jīng)IGF1作用后的SKBR3細胞)，觀察對細胞增殖抑制率的影響。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù) 胰酶消化后，小心收集培養(yǎng)的細胞。用PBS洗滌細胞2次，置于離心機離心，轉(zhuǎn)速2 000 r/min，時間5 min。收集(1～5)×105個細胞，用移液槍向其內(nèi)加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，再分別加入錨定蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，放置于搖床輕搖以充分混勻。在常溫避光環(huán)境下，靜置反應(yīng)5～15 min。將樣本迅速置于流式細胞儀分析。設(shè)置流式細胞儀激發(fā)波長，Annexin VFITC通過綠色熒光通道(流式Ex＝488 nm、發(fā)射波長Em＝530 nm)檢測，PI通過紅色熒光(流式Ex＝488 nm、發(fā)射波長Em≥630 nm)通道檢測。進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊并設(shè)定十字門的位置。熒光補償調(diào)節(jié)方式以經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細胞作為對照。分別給予DMY(80 μmol/L)、赫賽汀(25、50 μg/mL)作用后，測細胞凋亡情況。

1.2.5 腫瘤Transwell小室遷徙實驗 將具有聚碳酸酯膜的Transwell小室(孔徑為8 μm)放置在24孔板的孔中。首先利用0.25%胰蛋白酶消化子代SKBR3細胞，以無血清DNEM重懸胰酶消化的細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)；將細胞密度為4×104/mL的細胞懸液200 μL接種于Transwell上室中，24孔板孔內(nèi)置600 μL的含10%PBS DMEM。培養(yǎng)至細胞貼壁生長后，分別用赫賽汀、DMY、赫賽?。獶MY作用細胞，培養(yǎng)24 h后；將Transwell小室取出，以無菌棉棒輕柔地去除半透膜上表面殘留的SKBR3細胞，PBS洗3次；然后利用甲醇和冰乙酸混合液(3∶1)固定30 min，根據(jù)Giemsa法染色15 min。輕輕甩掉染液，蒸餾水沖洗3次，在倒置顯微鏡下計數(shù)遷移到半透膜下表面的細胞數(shù)量。每組6孔，每孔隨機計數(shù)6個100×視野內(nèi)的細胞數(shù)，給予DMY(80 μmol/L)、赫賽汀(25、50 μg/mL)作用后，測腫瘤細胞遷徙情況。最后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗、方差分析，GraphPad Prism 5.0作圖軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKBR3及SKB3-R細胞對赫賽汀敏感性及細胞周期分布 赫賽汀對親代SKBR3細胞的半數(shù)抑制濃度為1.8 μg/mL，對SKBR3-R細胞半數(shù)抑制濃度升至35 μg/mL，兩者對赫賽汀敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t＝－5.141、P＝0.001，圖1)。

圖1 梯度遞增的赫賽汀作用SKBR3及SKBR3-R細胞后細胞增殖抑制率

2.2 IGF1對SKBR3細胞IGF1R和HER2磷酸化的影響 在SKBR3細胞中IGF1(1 ng/mL)作用30 min后可檢測到磷酸化的IGF1R，并且隨著時間延長(0、30、60、90、120 min)，IGF1R的磷酸化程度逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(120 min與0 min比較，t＝2.825、P＝0.048)；而HER2的磷酸化程度始終保持在較平穩(wěn)的水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(120 min與0 min比較，t＝－1.835、P＝0.14)。見圖2A。

2.3 IGF1R激活后下游信號分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表達 隨著IGF1作用時間的延長(0、30、60、120 min)，細胞下游IRS1的磷酸化程度隨之升高(120 min與0 min比較，t＝11.062、P＝0.001)，PKB磷酸化水平升高后逐漸平穩(wěn)；而PTEN表達量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F＝263.062、P＝0.004)。見圖2B。

2.4 DMY對SKBR3-R細胞IGF1R、HER2磷酸化的影響 DMY(40、80 μmol/L)作用后，IGF1R磷酸化水平顯著降低(χ2＝32.84、P＝0.001)，而HER2磷酸化程度無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝0.14、P＝0.707)。見圖3。

2.5 DMY聯(lián)合赫賽汀對SKBR3-R細胞內(nèi)信號分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表達的影響 DMY聯(lián)合赫賽汀作用后相比較單純赫賽汀作用細胞內(nèi)信號分子IRS1(χ2＝18.84、P＝0.001)、PKB(χ2＝22.04、P＝0.001)磷酸化程度降低明顯，而PTEN表達顯著升高(χ2＝8.79、P＝0.003)。見圖4。

2.6 DMY聯(lián)合赫賽汀對SKBR3-R細胞的影響相比單一赫賽汀作用，DMY聯(lián)合赫賽汀有顯著促進SKBR3-R細胞凋亡(χ2＝43.67、P＝0.001)、抑制侵襲作用(χ2＝56.79、P＝0.001)。見圖5、6。

圖2 IGF1對SKBR3細胞的影響

圖3 DMY對SKBR3-R細胞IGF1R、HER2磷酸化的影響

圖4 DMY聯(lián)合赫賽汀對SKBR3-R細胞內(nèi)信號分子IRS1、PKB磷酸化及PTEN表達的影響

圖5 DMY聯(lián)合赫賽汀對SKBR3-R細胞凋亡的影響

圖6 DMY聯(lián)合赫賽汀對SKBR3-R細胞侵襲的影響

3 討論

IGF1R過表達和激活，以及血清中配體IGF1水平升高在很多腫瘤中存在[8-11]。對伴有HER2過表達的乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R系統(tǒng)的異常激活是赫賽汀耐藥發(fā)生的原因之一[12]。IGF1R與HER2有著共同的下游信號傳導(dǎo)通路——PI3K/PKB信號通路和Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號通路，IGF1R的異常激活，可從旁路激活HER2下游信號通路，導(dǎo)致腫瘤細胞對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。其中PI3K/PKB介導(dǎo)的信號通路在耐藥機制中起主導(dǎo)作用[13]。IRS1是IGF1R作用的底物，IGF1R激活后募集并磷酸化細胞內(nèi)IRS1，通過磷酸化IRS1繼續(xù)下游信號的傳導(dǎo)。

在本研究中，IGF1作為配體結(jié)合IGF1R，IGF1R被激活，細胞周期發(fā)生改變，大量細胞進入到S期，分裂增殖旺盛，細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)增強，信號蛋白IRS1、PKB磷酸化程度升高，PI3K/PKB信號通路被激活。該信號通路是IGF1/IGF1R系統(tǒng)下游主要信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、抗腫瘤治療及耐藥性的發(fā)生過程中起重要作用[14]。此外，IGF1作用后，還可導(dǎo)致細胞內(nèi)PTEN表達水平下降。PTEN為抑癌基因，在體內(nèi)主要作用是負反饋抑制PI3K的激活，降低PKB的磷酸化水平，從而起到抑制PI3K/PKB信號通路的作用[15]。PTEN的表達下降也是腫瘤細胞對赫賽汀耐藥的重要原因之一[16]。在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)，DMY能夠增加赫賽汀敏感性的另一個重要原因就是其可以促進PTEN的表達，可能與DMY能夠抑制細胞核內(nèi)PTEN轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)[17]。

通過初步的研究發(fā)現(xiàn)，DMY至少通過以下方式起到抗腫瘤作用:①抑制由配體IGF1激發(fā)的IGF1R的磷酸化，阻礙IGF1R下游PI3K/PKB信號的異常激活。DMY對親代SKBR3細胞及耐藥SKBR3-R細胞增殖均有一定的抑制作用，并隨作用濃度的升高，抑制作用加強。其抑瘤作用在其他腫瘤細胞的研究中也得到了論證[5，18]。②DMY可促進PTEN的表達，降低IRS1、PKB磷酸化水平，抑制PI3K/PKB信號通路異常激活。Chakraborty等[19-20]通過大量實驗在對表達HER2的乳腺癌細胞研究時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單一受體靶向治療藥物不足以誘導(dǎo)細胞凋亡時，聯(lián)合雙受體抑制可以顯示明顯效果。即使在被抑制的其中之一受體并沒有過表達的情況下，這種誘導(dǎo)凋亡的作用同樣存在。原因可能是一種受體抑制劑只能抑制特異的下游信號通路，但該通路仍可能會被另外一個存在交叉信號的通路激活，而2個受體同時抑制能夠?qū)ο掠涡盘栠M行更優(yōu)化阻斷[21]。基于此結(jié)論，即使單一藥物赫賽汀治療出現(xiàn)耐藥的情況下，聯(lián)合應(yīng)用另一種抑制IGF1R激活的藥物，仍可能對抗腫瘤起到良好效果。DMY可以起到抑制IGF1R激活的作用，對赫賽汀耐藥的SKBR3-R細胞經(jīng)DMY處理后，細胞恢復(fù)對赫賽汀的敏感性，細胞的侵襲和增殖程度顯著降低，凋亡增加。

綜上所述，DMY作為一種純天然植物提取的化合物，對因IGF1R過度激活導(dǎo)致赫賽汀耐藥的SKBR3細胞，可以通過抑制IGF1R下游PI3K/PKB信號通路的激活，恢復(fù)腫瘤細胞對赫賽汀的敏感性，并具有協(xié)同抗腫瘤作用。而細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)存在非常復(fù)雜的相互聯(lián)系，導(dǎo)致赫賽汀耐藥性的產(chǎn)生還有很多途徑[22]，DMY是否還具有其他未知曉的機制，還有待進一步深入的研究。

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Dihydromyricetin enhances herceptin sensitivity to breast cancer cells through inhibiting the insulin-like growth factor 1 receptor downstream phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway

ZHANG Mingliang，PAN Chengwu，WANG Gang，JIN Gongsheng，QIAN Jun
(Department of Oncology Surgery，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China)

ObjectiveTo observe the influence of herceptin sensitivity after the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B(PI3K/PKB)signaling pathway activated in SKBR3 cells，and investigate the cooperative mechanism of dihydromyricetin(DMY)enhancing the sensitivity of herceptin to SKBR3 cells.MethodsPI3K/PKB signal pathway was activated by the high dose of insulin-like growth factor 1(IGF1)effected on IGF1 receptor(IGF1R)in SKBR3 cells.SKBR3 cells were treated with DMY，herceptin，DMY combined with herceptin respectively after cultured by high dose of IGF1，western blot was used to detect the expression of IGF1R，human epidermal growth factor receptor 2(HER2)and downstream signaling proteins insulin receptor substrates 1(IRS1)，PKB，phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN)and the phosphorylation level of the molecules；3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay，transwell migration experiment and flow cytometry were used to observe the proliferation，migration and apoptosis of tumor cells.ResultsThe IRS1 protein phosphorylation level increased significantly(P＜0.01)，PKB protein phosphorylation level rose slowly and then becamestable gradually，and the expression level of PTEN decreased significantly in tumor cells after they cultured by high dose of IGF1(P＜0.01)；DMY could significantly decrease the levels of IRS1(P＜0.01)，PKB protein phosphorylation(P＜0.01)，and increase the expression level of PTEN(P＜0.01)；DMY combined with herceptin treatment could significantly reduce the cells migration ability(P＜0.01)，improve the cells apoptosis rate(P＜0.01).ConclusionIGF1R downstream PI3K/PKB signaling pathway abnormal activation leads to herceptin resistant to SKBR3 cells，DMY could recover the sensibility of herceptin by inhibiting PI3K/PKB signal pathway.

Dihydromyricetin(DMY)；Herceptin；Human epidermal growth factor receptor 2(HER2)；Insulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R)；Signal pathway

R392.114；R73－332

A

2095-3097(2017)06-0340-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.006

安徽省教育廳一般項目(KJ2015B093by)

233030安徽蚌埠，蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科(張明亮，潘成武，王 崗，金功圣，錢 軍)

2017-06-18 本文編輯:徐海琴)