謝宛君，方 琛，黃偉峰，杜秀婷，肖志勛，朱亞強，鐘少文

一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠防護作用研究

謝宛君，方 琛，黃偉峰，杜秀婷，肖志勛，朱亞強，鐘少文

目的探討一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠的防護作用及其機制。方法以6 MVX直線加速器一次性全身照射小鼠造成輻射損傷，觀察一貫煎及其加味對小鼠外周血象、外周血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性水平及免疫功能(胸腺、脾指數)、骨髓細胞計數、血漿與骨髓環(huán)磷酸腺苷水平等指標的變化，推測其對小鼠造血功能、免疫功能的影響及其可能機制。結果成功制備輻射損傷小鼠模型。一貫煎原方及其加味能升高輻射損傷小鼠外周血中白細胞計數、血小板計數、血紅蛋白及骨髓細胞計數(P＜0.05)，提高胸腺、脾指數(P＜0.05)，升高骨髓環(huán)磷酸腺苷水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性(P＜0.05)，各指標在原方組與加味組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論一貫煎原方及其加味對小鼠輻射損傷有較好防護作用，能在一定程度上促進輻射損傷小鼠造血與免疫功能恢復，抗自由基損傷可能是其作用機制之一。

一貫煎；加味；輻射；損傷；防護

隨著科學技術的迅猛發(fā)展，人類生活與電磁設備關系越來越密切。如今電磁輻射(electromagnetic radiation，EMR)污染是繼水污染、大氣污染、噪音污染的第四大公害[1]。研究表明，長時間暴露在電磁輻射環(huán)境中對作業(yè)人員神經、免疫、心血管、消化、血液等多系統(tǒng)均存在不同程度危害[2]，EMR的防護越發(fā)受人矚目。目前，多數抗EMR藥物不僅毒性和不良反應較大且價格較昂貴[3]。植物和中草藥等天然化合物廣泛應用于醫(yī)學中，具有毒性小、價格低，可以口服給藥，并且可以通過調節(jié)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等多種機制發(fā)揮優(yōu)勢[4]。因此，逐漸成為EMR防護藥物開發(fā)的研究熱點。本研究以滋陰疏肝治法為切入點，觀察一貫煎及其加味對輻射損傷小鼠的防護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，購自廣州中醫(yī)藥大學大學城校區(qū)實驗動物中心[SCXK-(粵)-2013-0020]，實驗動物合格證號44005900001579。

1.1.2 藥劑與儀器 一貫煎原方、加味一貫煎、補中益氣湯全方飲片經廣州中醫(yī)藥大學中藥學院方劑學教研室鑒定后，分別水煎、濃縮，分裝冷藏備用。外周血超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)試劑盒、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)、3%醋酸液、水合氯醛等(深圳市恩緹生物科技有限公司)。輻射源Varian 2300C/D直線加速器(美國瓦里安公司，廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院放射科提供)，高速冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，FA2004N電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)，超低溫冰柜，玻璃毛細吸管，F-820型血細胞計數儀(日本東亞公司)，雙目光學顯微鏡(日本OLYMPUS)，FJ-2107液體閃爍測量儀(西安二六二廠)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模 將小鼠隨機分為正常組、模型組、益氣組、原方組、加味組5組，每組10只。益氣組、原方組、加味組分別灌胃相應藥液，給藥劑量為0.4 g/mL(成人臨床等效劑量)；正常組和模型組按相同容量灌胃給予蒸餾水；每天灌胃1次，持續(xù)40 d。灌胃第30天，除正常組外，其余各組小鼠置于大小20 cm×20 cm、內置隔板、分為16個大小5 cm×5 cm的空間中，每個空間放置1只小鼠以避免照射時產生重疊。使用Varian 2300C/D直線加速器產生的6 MV X線建立EMR損傷模型；照射距離1 m，照射面積25 cm×25 cm，照射劑量6 Gy，時間3 min，劑量率2 Gy/min，一次性全身照射。

1.2.2 外周血常規(guī)檢測 分別于照射后3、10 d對小鼠斷尾取血約20 μL，稀釋，推片，使用血細胞計數儀檢測外周血常規(guī)白細胞(white blood cell，WBC)計數、紅細胞(red blood cell，RBC)計數、血小板(platelet，PLT)計數和血紅蛋白(hemoglobin，Hb)水平，并計算網織紅細胞(reticulocyte，Ret)。

1.2.3 骨髓細胞計數 分2批次腹腔注射水合氯醛處死小鼠，剝離小鼠右側完整股骨，以PBS 10 mL從一側關節(jié)沖出骨髓內細胞，血細胞計數儀自動計算右側股骨骨髓細胞(bone marrow cell，BMC)計數。

1.2.4 脾臟、胸腺稱重和外周血SOD、GPX活性水平檢測 小鼠稱重，記錄數據后水合氯醛處死，剖開胸腹部，取出脾臟和胸腺，稱重并記錄，計算胸腺、脾臟指數，胸腺(脾臟)指數(%)＝胸腺(脾臟)重量(g)/小鼠體重(g)×100%。摘除小鼠眼球，毛細玻璃管取血，按照試劑盒說明書檢測酶活性水平。

1.2.5 血漿和骨髓cAMP檢測 取小鼠血100 μL，以0.5 mol/L四乙酸二氨基乙烷15 μL抗凝，2 000 r/min離心10 min，分離出的血漿按cAMP試劑盒說明測定外周血cAMP水平。同時取小鼠左側股骨，以6號針頭沖出骨髓，先進行BMC計數，再按試劑盒說明測定骨髓中cAMP水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0軟件，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血常規(guī)及Ret 照射后各組小鼠WBC計數大幅降低，照射后3 d原方組WBC計數高于模型組(t＝3.05、P＝0.037)；照射后10 d各組小鼠WBC計數不同程度升高，加味組、益氣組WBC計數高于模型組(t分別為7.11、1.59，P分別為0.004、0.032)。照射后各時段，模型組Hb低于正常組(照射后3、10 d，t分別為2.85、2.36，P分別為0.041、0.028)，照射后3 d益氣組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(t＝1.50、P＝0.011)，照射后10 d原方組、加味組Hb高于模型組(t分別為2.61、1.16，P分別為0.013、0.048)。照射后模型組與正常組比較PLT計數下降明顯(照射后3、10 d，t分別為4.68、2.36，P分別為0.009、0.028)，益氣組PLT計數在2個時段均高于模型組(照射后3、10 d，t分別為3.07、4.85，P分別為0.029、0.038)，照射后3 d加味組和照射后10 d原方組PLT計數高于模型組(t分別為2.61、1.16，P分別為0.017、0.021)。照射后各組Ret先下降后逐漸上升。照射后模型組Ret明顯低于正常組(照射后3、10 d，t分別為6.39、4.98，P分別為0.003、0.008)，益氣組小鼠Ret在照后2個時段均高于模型組(照射后3、10 d t分別為3.52、2.19，P分別為0.007、0.046)。見表1。

表1 各組10只小鼠外周血常規(guī)及Ret(ˉx±s)

2.2 股骨BMC計數 照射后模型組小鼠BMC計數較正常組下降明顯(t＝9.36、P＝0.001)，益氣組、原方組小鼠BMC計數與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為3.16、4.24，P分別為0.046、0.003)。見表2。

2.3 免疫功能及SOD、GPX活力水平 照射后各組小鼠胸腺、脾指數均降低，2個指標在原方組和益氣組小鼠中高于模型組(胸腺指數，t分別為3.28、2.13，P分別為0.048、0.029；脾臟指數，t分別為2.94、2.70，P分別為0.033、0.045)，加味組脾指數高于模型組(t＝6.51、P＝0.028)。照射后各組小鼠SOD活性均降低，其中正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(t＝4.28、P＝0.038)。模型組GPX活性低于正常組(t＝7.12、P＝0.024)，原方組、加味組高于模型組(t分別為5.29、4.85，P分別為0.019、0.042)。見表2。

2.4 外周血、骨髓cAMP水平 照射后模型組與正常組比較cAMP水平降低明顯(t分別為3.24、4.01，P分別為0.036、0.029)，加味組外周血cAMP與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(t＝0.82、P＝0.044)。3個給藥組骨髓cAMP水平顯著高于模型組(t分別為1.47、1.53、0.30，P分別為0.004、0.001、0.007)。見表2。

表2 各組10只小鼠股骨BMC計數、胸腺與脾臟指數、SOD與GPX活性、外周血與骨髓cAMP水平(ˉx±s)

3 討論

熱效應、非熱效應與累積效應是目前公認的EMR危害健康的3種生物學效應[5]。熱效應損傷即機體受照射后，內部水分子相互快速摩擦產熱，使體溫升高，改變人體細胞生存的內外環(huán)境，進一步影響細胞結構及細胞分裂增殖過程，引起病理反應。非熱效應認為外界電磁場干擾了人體內部正常“自身磁場”，從而在細胞和分子水平上影響其生物物理和生物化學反應的過程[6]。累積效應即反復多次經受上述2種效應，損傷累積到一定程度后，機體正常生理機制出現不可逆的損傷。中醫(yī)認為高能射線是一種火邪、熱毒[7]?！端貑枴り庩枒蟠笳摗吩啤皦鸦鹬畾馑ァ瓑鸦鹗硽狻瓑鸦鹕狻保渚€熱毒充斥體內，耗傷人體氣陰津液，傷及肝腎之陰，易致生風動血，臨床表現主要包括口干舌燥、渴欲飲水、目赤咽腫、小便短赤、皮膚發(fā)斑、衄血甚至煩躁不寧、譫妄發(fā)狂、昏迷等神志癥狀；熱盛肉腐，易致瘡瘍，因此也可導致腫瘤占位等病變。治療上，當以“壯水之主，以制陽光”為基本治則，滋陰為重。中藥方劑一貫煎由沙參、麥冬、生地黃、當歸、枸杞子幾味藥組成，旨在滋陰養(yǎng)血、疏肝清熱。本課題研究一貫煎及其加味(原方基礎上加柴胡、黃芩)對EMR損傷小鼠的防護作用，各項檢測結果顯示照射后小鼠外周血WBC計數、Hb、PLT計數、Ret均比正常組低，BMC損傷較重，血中SOD與GPX活性水平、外周血與骨髓中cAMP水平均降低，同時胸腺、脾指數下降，與高明澤等[8]研究一致，證明成功建立EMR損傷小鼠模型。

造血系統(tǒng)對輻射高度敏感[9]，造血功能損害是貫穿病程始終的基本損傷[10]，外周血RBC計數、WBC計數、Hb和PLT計數能夠客觀地反映造血系統(tǒng)的損傷程度[11]。照射后模型組小鼠BMC計數下降明顯，益氣組、原方組小鼠BMC計數與模型組比較有顯著性差異，反映照射后小鼠骨髓抑制嚴重，而2個方能較好地緩解骨髓抑制程度、保護和促進BMC增生。造血器官的EMR損傷首先體現在外周血WBC計數上，是反映輻射損傷最直接、最經典的指標[12]。照射后各組小鼠WBC計數大幅降低，照射后3 d原方組小鼠WBC計數高于模型組，照射后10 d各組小鼠WBC計數較前升高，加味組、益氣組小鼠WBC計數高于模型組，說明一貫煎及其加味對輻射所致WBC損傷有較好的防護作用。照射使Ret分裂增殖功能受阻，照射后模型組Ret明顯低于正常組，照射后2個時段原方組、加味組與模型組相比差異不明顯，提示對小鼠Ret作用不明顯。成熟RBC由Ret發(fā)育而成，但成熟RBC壽命約120 d，更新慢，加上對射線敏感性較WBC低，故照射后3、10 d 4組小鼠RBC變化均不明顯。照射后2個時段模型組Hb均低于正常組，照射后3 d益氣組及照射后10 d原方組、加味組Hb高于模型組，提示3個方均具有促進Hb生成的潛力。成熟巨核細胞在損傷初期仍然殘留生成PLT的能力，而PLT壽命為9～10 d，隨著受損的巨核細胞功能逐漸喪失，數量減少，PLT生成受阻[13]，故照射后10 d小鼠PLT計數下降程度明顯比照射后3 d嚴重。照射后模型組PLT計數下降明顯，益氣組在2個時段、照射后3 d加味組、照射后10 d原方組小鼠PLT計數高于模型組，提示3個方可一定程度上減緩外周血中PLT計數下降速度。

免疫系統(tǒng)損傷是EMR損傷的另一個重要表現[14]。胸腺、脾臟指數可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱，照射后各組小鼠胸腺、脾指數均降低，2個指標在原方組和益氣組小鼠中均高于模型組，加味組脾指數高于模型組，說明3個方可不同程度增強照射后胸腺、脾臟組織修復能力，改善機體免疫功能。

EMR可以直接與水作用，使水分子輻射分解產生大量自由基，破壞機體氧化還原平衡狀態(tài)，導致機體抗氧化能力下降[15]。SOD、GPX是抗自由基損傷的重要物質，可用來作為抗EMR損傷的一個客觀生化指標。本研究顯示，補中益氣湯、一貫煎及其加味對EMR損傷小鼠SOD活性水平修復作用不明顯；原方組、加味組GPX活性高于模型組，反映一貫煎原方及其加味對EMR所致自由基損傷有一定保護作用。cAMP作為信號轉導最普遍的第二信使，參與體內多種造血調控因子對造血細胞增殖、分化和凋亡的調節(jié)[16]，機體免疫反應以及細胞增殖和分化均與cAMP有關[17]。因此，cAMP水平間接影響造血、免疫功能。照射后小鼠cAMP水平降低明顯，益氣組、原方組、加味組骨髓cAMP水平均顯著高于模型組，提示3個方可有效升高骨髓中cAMP水平，通過促進受損細胞代謝，激活BMC增殖分化，修復造血功能及受損組織、臟器。

本實驗成功制備了EMR損傷小鼠模型，各項指標檢測結果顯示一貫煎原方及其加味可有效修復小鼠部分造血功能，特別是對外周血WBC計數、Hb、PLT計數和BMC計數4個指標，同時能在一定程度上修復EMR損傷小鼠免疫功能，提高其胸腺、脾指數，升高骨髓中cAMP水平，上述指標與益氣組效果相差不大；2個方對提高EMR損傷小鼠SOD活性作用不明顯，但對GPX活性效果明顯，在抗自由基損傷方面優(yōu)于補中益氣湯，考慮為其EMR防護作用的可能機制之一。上述各項指標在原方組與加味組之間比較差異均不明顯。

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Protective effect of Yiguanjian and its additives against radiation injury in mice

XIE Wanjun1，FANG Chen2，HUANG Weifeng1，DU Xiuting1，XIAO Zhixun1，ZHU Yaqiang1，ZHONG Shaowen2
(1.The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510405，China；2.Department of Breast Disease，Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong 510120，China)

ObjectiveTo discuss the protective effect and mechanisms of Yiguanjian and its additives on mice with radiation injury.MethodsExpose the mice to total body irradiation by 6 MV X linear accelerator to cause radiation injury，to observe the changes of Yiguanjian and its additives on indexes such as peripheral hemogram，superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPX)activity levels，immune functions(thymus coefficient and spleen coefficient)，bone marrow cells(BMC)，cyclic adenosine monophosphate(cAMP)levels in plasma and bone marrow，and infer their influence on hematopoietic function，immune function and the possible mechanisms.ResultsWe built up the radiation injury mouse model successfully.Yiguanjian and its additives could increase white blood cells(WBC)，hemoglobin(Hb)，platelet(PLT)of peripheral blood and BMC(P＜0.05)，rise the thymus coefficient and spleen coefficient(P＜0.05)，together with cAMP levels in bone marrow and GPX activity levels(P＜0.05).The difference of the related indexes between the Yiguanjian group and the additive group was not obvious(P＞0.05).ConclusionYiguanjian and its additives have preferable protective effects on irradiated mice，they can promote the recovery of hematopoietic function and immune function of mice with radiation injury to a certain extent，anti-free radical injury may be one of the possible mechanisms.

Yiguanjian；Additives；Radiation；Injury；Protection

R286.96－332

A

2095-3097(2017)06-0345-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.007

廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目立項資助(1057213041)

510405廣東廣州，廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院(謝宛君，黃偉峰，杜秀婷，肖志勛，朱亞強)；510120廣東廣州，廣東省中醫(yī)院乳腺科(方 琛，鐘少文)

鐘少文，E-mail:1330366581＠qq.com

2017-05-25 本文編輯:徐海琴)