何潔英，王汝上

(1.佛山市第一人民醫(yī)院/中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 佛山 528000； 2.廣州康臣藥物研究有限公司研發(fā)部，廣東 廣州 510530)

糖腎方的高效液相指紋圖譜研究Δ

何潔英1*，王汝上2#

(1.佛山市第一人民醫(yī)院/中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 佛山 528000； 2.廣州康臣藥物研究有限公司研發(fā)部，廣東 廣州 510530)

目的：建立糖腎方的高效液相指紋圖譜分析方法，為該藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Aglient C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、二極管陣列檢測(cè)器，以甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：建立了糖腎方的指紋圖譜，確認(rèn)了22個(gè)共有峰。經(jīng)相似度評(píng)價(jià)，10批糖腎方的相似度均>0.99。結(jié)論：本研究建立的方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為糖腎方的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

糖腎方； 高效液相色譜； 指紋圖譜; 總黃酮

*主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：hjieying@fsyyy.com

#通信作者：研究工程師。研究方向：新藥研究。E-mail：resun-com@163.com

糖腎方是源于古方黃耆散的加味方。黃耆散最早出自北宋《圣濟(jì)總錄》(第五十九卷·消渴門·渴利)：“治三消渴疾，肌膚瘦弱，飲水不休，小便不止。黃耆(銼)、桑根白皮(銼細(xì)各一兩)、葛根(銼二兩)，上三味，搗羅為散，每服三錢匕，煎燖豬湯，澄清調(diào)下，不拘時(shí)”[1]。糖腎方由黃芪、葛根、桑白皮和茯苓等4味藥組成，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中無(wú)不良反應(yīng)的記載或報(bào)道，且大量臨床及基礎(chǔ)研究結(jié)果表明糖腎方及方中各藥對(duì)糖尿病及糖尿病腎病具有良好的療效[2-5]。糖腎方具有改善糖、脂代謝和血液流變，對(duì)抗胰島素抵抗[6-9]、氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥[10-13]，降低尿蛋白，保護(hù)肝臟、腎臟和胰腺等作用[14-17]，可能通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效。糖腎方已廣泛用于臨床，但目前尚無(wú)科學(xué)合理的質(zhì)量控制方法。本研究建立了糖腎方的高效液相指紋圖譜分析方法，為有效、全面控制糖腎方的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1260型液相色譜儀、DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫科技公司)；Millipore超純水系統(tǒng)(廣州東銳科技有限公司)；BT-125D型電子天平(Sartorius公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)。

1.2 藥品與試劑

糖腎方(廣州康臣藥物研究有限公司提供10批中試研究樣品，批號(hào)：S1—S10)；甲醇(Merck公司)、甲酸(Merck公司)均為色譜純，其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液：取糖腎方處方藥材各10 g，精密稱定，加8倍量70%乙醇回流提取3 h，過濾，置于1 000 ml容量瓶中，加入相同溶劑定容，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照組溶液：取葛根素對(duì)照品適量，精密穩(wěn)定，置于100 ml容量瓶中，加30%乙醇溶解定容至刻度(0.169 mg/ml)，作為葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。再取儲(chǔ)備液適量制成每1 ml含有42.25 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液：按處方比例及制備方法，制備不含黃芪、葛根、桑白皮和茯苓藥材的樣品，并按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 陽(yáng)性對(duì)照溶液：按處方比例及制備方法，制備只含黃芪、葛根、桑白皮和茯苓藥材中的1味藥材的樣品，并分別按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備陽(yáng)性對(duì)照溶液A、B、C及D。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫(洗脫程序見表1)，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedures

2.3 提取溶劑考察

取糖腎方處方藥材各10 g，共5份，精密稱定，分別采用40%、50%、60%、70%和80%的乙醇進(jìn)行提取，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，70%乙醇的提取效率最好，特征峰面積總和最大，各特征峰分離度最好。

A.40%乙醇；B.50%乙醇；C.60%乙醇；D.70%乙醇；E.80%乙醇 A. 40% ethyl alcohol; B. 50% ethyl alcohol; C. 60% ethyl alcohol; D. 70% ethyl alcohol; E.80 % ethyl alcohol圖1 不同提取溶劑提取的糖腎方的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of Tangshen formula extracted from different solvent

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)：取同一批糖腎方(批號(hào)：S1)處方中藥材適量，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μl，記錄色譜圖。結(jié)果表明，6張色譜圖相似度均>0.999，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的RSD均<0.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批糖腎方(批號(hào)：S1)處方中藥材適量，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，放置0、4、8、12、16、24和48 h后按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，7張色譜圖相似度均>0.999，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的RSD均<1.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批糖腎方(批號(hào)：S1)處方中藥材適量，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，6張色譜圖相似度均>0.999，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的RSD均<1.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5 糖腎方指紋圖譜的建立及相似度計(jì)算

2.5.1 糖腎方指紋圖譜的建立：取10批糖腎方處方藥材，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以糖腎方(批號(hào)：S1)作為對(duì)照，生成10批指紋圖譜，見圖2。

2.5.2 主要色譜峰的指認(rèn)：結(jié)合10批樣品的相似度，標(biāo)定22個(gè)共有特征峰，見圖2。取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將圖2與對(duì)照品溶液色譜圖進(jìn)行比較，確定5號(hào)峰為葛根素峰，其他色譜峰的指認(rèn)有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2.5.3 相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積：以5號(hào)峰(葛根素)為參照峰，計(jì)算22個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，22個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.2%，相對(duì)峰面積的RSD為0.826%～40.153%,表明10批糖腎方樣品間相對(duì)保留時(shí)間的差異較小，相對(duì)峰面積的差異較大，見表2—3。

圖2 10批糖腎方高效液相指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprinting of 10 batches of Tangshen formula

表2 10批糖腎方22個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of 22 common peaks of 10 batches of Tangshen formula

2.5.4 共有峰的藥材歸屬：取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液，陰性對(duì)照溶液和陽(yáng)性對(duì)照溶液A、B、C及D，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并將保留時(shí)間一致、陰性對(duì)照溶液色譜圖中未出現(xiàn)且紫外吸收相同的色譜峰進(jìn)行比較，確定特征峰的藥材歸屬，結(jié)果見表4。

2.5.5 相似度評(píng)價(jià)：采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”軟件，對(duì)10批糖腎方指紋圖譜和生成的對(duì)照指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，10批糖腎方的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.99，見表5。

3 討論

隨著中藥現(xiàn)代化的要求越來(lái)越高，中藥指紋圖譜已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制。指紋圖譜的最大特點(diǎn)是可在不清楚所有化學(xué)成分的情況下進(jìn)行質(zhì)量控制，從而提高藥物的穩(wěn)定性及療效[18]。本研究采用高效液相色譜法建立糖腎方的指紋圖譜分析方法，經(jīng)過方法學(xué)考察，表明本方法具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于糖腎方的質(zhì)量控制。

本研究曾對(duì)色譜條件進(jìn)行考察。(1)流動(dòng)相考察：考察了不同濃度的乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液及甲醇-甲酸水溶液等不同體系的梯度洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明，以甲醇-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，特征峰明顯，分離效果最好。因此，本研究選擇的流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫，洗脫時(shí)間為85 min。(2)檢測(cè)波長(zhǎng)考察：取供試品溶液適量，根據(jù)色譜條件在DAD檢測(cè)器進(jìn)行190～400 nm的全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，大多數(shù)成分在波長(zhǎng)260 nm處有較大吸收，且主要色譜峰分離效果較好、基線平穩(wěn)，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。(3)柱溫考察：分別考察了柱溫25、30和40 ℃時(shí)對(duì)色譜分離度的影響。結(jié)果表明，相較于25 ℃，柱溫30 ℃的分離效果好，保留時(shí)間適宜；而柱溫30、40 ℃時(shí)的保留時(shí)間和分離效果差異不大，為節(jié)約成本和保護(hù)色譜柱，最終選擇柱溫為30 ℃。

表3 10批糖腎方22個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積Tab 3 Relative peak area of 22 common peaks of 10 batches of Tangshen formula

表4 高效液相指紋圖譜特征峰的藥材歸屬Tab 4 HPLC fingerprint characteristic peak of the medicinal materials

在提取溶劑的選擇上，本研究曾采用薄層色譜法考察不同濃度的甲醇、乙醇和水等溶劑提取糖腎方有效成分。結(jié)果顯示，以甲醇和乙醇提取的糖腎方有效成分(總黃酮)斑點(diǎn)數(shù)明顯多于水提取的，且相同濃度的甲醇和乙醇提取的斑點(diǎn)大小和數(shù)量基本一致，表明醇的總黃酮提取率比水高，故選擇甲醇或乙醇作為提取溶劑。而考慮到成本、環(huán)保和安全性，最終選擇乙醇作為提取溶劑，并進(jìn)一步考察了不同濃度乙醇對(duì)提取結(jié)果的影響，最終選擇70%乙醇作為糖腎方總黃酮的提取溶劑。

表5 10批糖腎方指紋圖譜相似度結(jié)果Tab 5 Similarity evaluation of HPLC fingerprinting of 10 batches of Tangshen formula

綜上所述，本研究建立了糖腎方的高效液相指紋圖譜分析方法，可用于糖腎方的質(zhì)量控制；并采用“中藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”評(píng)價(jià)指紋圖譜的相似度，簡(jiǎn)便、快捷，可為糖腎方及其他中藥方劑的臨床應(yīng)用和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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ResearchonHighPerformanceLiquidChromatographyFingerprintingofTangshenFormulaΔ

HE Jieying1, WANG Rushang2

(1.Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Foshan/Affiliated Foshan Hospital of Sun Yat-sen University, Guangdong Foshan 528000, China; 2.Dept.of Research and Development, Guangzhou Consun Drug Research Ltd., Guangdong Guangzhou 510530, China)

OBJECTIVE: To establish the method of high performance liquid chromatography(HPLC)fingerprinting of Tangshen formula, so as to provide basis for the quality control. METHODS: Aglient C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column and diode-array detector were adopted, methanol-0.2% formic acid aqueous solution was set as mobile phase to conduct gradient elute. The flow rate was 1.0 ml/min, detection wavelength was 260 nm. Similarity evaluation was conducted according to “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version 2004A)”. RESULTS: HPLC fingerprinting of Tangshen formula was established, 22 characteristic peaks were determined. After similarity evaluation, the similarity of 10 batches of Tangshen formula were >0.99. CONCLUSIONS: The method is stable and reliable with a good reproducibility and can provide basis for the quality control.

Tangshen formula; HPLC; Fingerprints; Total flavonoids

R927.1

A

1672-2124(2017)11-1464-05

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.11.007

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011A080504005)

2017-02-08)