于少泓

·論著·

馬黛通絡(luò)飲對(duì)APOE基因敲除小鼠脂質(zhì)代謝的影響

于少泓

目的觀察馬黛通絡(luò)飲對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。方法64只5周齡 ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，馬黛通絡(luò)飲灌胃干預(yù)8周后，檢測(cè)小鼠血脂含量及主動(dòng)脈的酯酰輔酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1(acy1-coenzyme A-cholesterol acyltransferases1，ACAT1)、氧化低密度脂蛋白的內(nèi)皮受體(lectin-like OX-LDL receptor 1，LOX-1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組血液中的總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)濃度明顯高于正常組。與模型組相比較，馬黛通絡(luò)飲高劑量組明顯降低血清TC、TG、LDL-C水平及主動(dòng)脈組織中的ACAT1、LOX-1的表達(dá)，明顯升高血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平(P<0.05)，低劑量組對(duì)TG、LDL-C、HDL-C的作用效果顯著(P<0.05)，而對(duì)TC及ACAT1、LOX-1作用效果不明顯(P>0.05)。結(jié)論馬黛通絡(luò)飲能降低ApoE-/-小鼠血脂水平，抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中的ACAT1、LOX-1的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)血脂異常和脂質(zhì)沉積發(fā)揮其阻止動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的作用。

馬黛通絡(luò)飲； 血脂； 載脂蛋白E基因敲除小鼠； 動(dòng)脈粥樣硬化； 脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的主要機(jī)制，是心腦血管疾病發(fā)病的重要原因。既往研究表明南美馬黛草具有降脂、促進(jìn)微循環(huán)、抗炎等作用[1-7]，因其功效符合中藥化痰活血的特點(diǎn)，筆者以馬黛草為君藥，在血府逐瘀湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，形成馬黛通絡(luò)飲，從活血化痰的角度探討其對(duì)載脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血脂代謝的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡雄性ApoE基因敲除小鼠64只，體質(zhì)量17～18 g，同遺傳背景C57BL/6J小鼠雄性12只，體質(zhì)量21～23 g，均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證分別為SCXK(蘇)2015-0001、SCXK(蘇)2014-0037。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

馬黛通絡(luò)飲方藥組成為：馬黛20 g、黃芪15 g、石菖蒲15 g、桃仁12 g、紅花9 g、當(dāng)歸9 g、枳殼6 g、赤芍6 g、川芎6 g、桔梗6 g、柴胡3 g、甘草3 g，按常規(guī)方法煎煮、過(guò)濾、濃縮，制成每毫升含生藥1 g的濃縮液。其中，馬黛草購(gòu)自阿根廷Molienda Company，中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫衛(wèi)生證書(shū)編號(hào)：370200112023716，其余中藥購(gòu)自建聯(lián)中藥店。辛伐他汀片：20 mg/片，批號(hào)H20084420，山東鑫齊藥業(yè)；總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；氧化低密度脂蛋白的內(nèi)皮受體(lectin-like OX-LDL receptor 1，LOX-1)抗體購(gòu)自abcam公司，酯酰輔酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(acy1- coenzyme A-cholesterol acyltransferases1，ACAT1)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

光學(xué)顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)；成像系統(tǒng)(Tanon公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃酶標(biāo)儀)；洗板機(jī)，(芬蘭ThermoLabsystems公司)；電泳儀(BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型的建立和分組 5周齡ApoE基因敲除小鼠及C57BL/6J小鼠，飼養(yǎng)室通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫保持19～21°C，相對(duì)濕度50%～60%，小鼠自由進(jìn)食飲水。ApoE基因敲除小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予0.15%膽固醇+21%脂肪+普通鼠料的高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組、馬黛通絡(luò)飲高劑量組、馬黛通絡(luò)飲低劑量組，每組12只，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)并給予相應(yīng)藥物灌胃給藥干預(yù)8周取材。另外，選取具有相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.4.2 藥物干預(yù)方法 將馬黛通絡(luò)飲用蒸餾水配成高、低不同濃度的0.4 mL溶液，根據(jù)小鼠體重，馬黛通絡(luò)飲高劑量組給予20 g/(kg·d)灌胃，馬黛通絡(luò)飲低劑量組給予5 g/(kg·d)灌胃，辛伐他汀組給予0.01 g/(kg·d)的辛伐他汀稀溶液0.4 mL灌胃，模型組及正常對(duì)照組給予相同體積(0.4 mL)的生理鹽水灌胃,各組均每天灌胃1次，12周后取材。

1.4.3 標(biāo)本取材 禁食12小時(shí)，注射戊巴比妥鈉處死小鼠，眼球取血0.8 mL，常溫靜置分離血清用于血脂檢查。其他血液樣本被收集在無(wú)菌試管內(nèi)，4 ℃溫度下以3000 rpm離心10分鐘，分離血清，以備檢測(cè)。處死小鼠后，打開(kāi)胸腔，沿胸椎體前面下降穿過(guò)膈的主動(dòng)脈裂孔進(jìn)入腹腔。將主動(dòng)脈緊貼心臟的部分剪斷，沿著動(dòng)脈剝離血管周圍的脂肪，最終在膈的主動(dòng)脈裂孔處剪斷，分離出動(dòng)脈血管，小心剝開(kāi)血管，刮凈血管內(nèi)壁的脂肪，部分樣本置于4%多聚甲醛浸泡溶液中固定，備做病理標(biāo)本。

1.4.4 檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法 小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本用OCT包埋，-80℃凝固包埋劑，冰凍切片機(jī)制作6 μm冰凍切片。將切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，中性樹(shù)脂封片，吹干，400倍鏡下觀察斑塊組織學(xué)特點(diǎn)并拍照。按照試劑盒方法測(cè)定小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量。其中，小鼠血清中TG含量通過(guò)酶法測(cè)定；TC的含量通過(guò)酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)；LDL-C的含量采用直接法檢測(cè)；HDL-C的含量選擇性沉淀法檢測(cè)。ELISA方法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中ACAT1，Western blot檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈組織中LOX-1的蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)分析

正常對(duì)照組光鏡可見(jiàn)主動(dòng)脈管腔正常，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完整，內(nèi)膜光滑無(wú)增厚，未見(jiàn)泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積；模型組的主動(dòng)脈管腔有狹窄處，內(nèi)皮細(xì)胞缺失，內(nèi)膜增厚，有大量泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)(細(xì)胞面積增大、胞漿充滿脂滴、核被推至胞漿的邊緣)，形成斑塊；辛伐他汀組和馬黛通絡(luò)飲治療組可見(jiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞含量較模型組顯著減少，隨馬黛通絡(luò)飲濃度增高，泡沫細(xì)胞含量遞減，治療組可見(jiàn)有大小不等斑塊，但斑塊病變較輕,見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)ApoE-/-小鼠血脂的影響

馬黛通絡(luò)飲高、低劑量組小鼠血清TG及LDL-C含量較模型組均可明顯降低(P<0.05)，低劑量馬黛通絡(luò)飲對(duì)TC的影響不大，而高劑量馬黛通絡(luò)飲可明顯降低TC水平(P<0.05)，馬黛通絡(luò)飲低、高劑量均可升高血清HDL-C水平(P<0.05)，大劑量馬黛通絡(luò)飲干預(yù)效果最佳，見(jiàn)表1。

2.3 對(duì)小鼠ACAT1的影響

ELISA方法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中ACAT1，經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，馬黛通絡(luò)飲高劑量組明顯降低ACAT1水平(P<0.05)。低劑量組ACAT1的降低效果不佳，見(jiàn)表1。

2.4 小鼠LOX-1的影響

Western blot檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈組織中LOX-1蛋白結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬黛通絡(luò)飲高劑量組可降低主動(dòng)脈組織中的LOX-1蛋白水平，低劑量組降低效果不佳。詳見(jiàn)表1、圖2。

3 討論

血脂異常是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因子。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血脂異常是由于嗜食肥甘厚味，脂質(zhì)攝入過(guò)多，損傷脾胃，脾氣虛弱，運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，聚濕生痰，痰濕蘊(yùn)積成膏脂，阻遏脈道而為瘀，痰瘀互結(jié)，因脾氣虛弱，膏脂轉(zhuǎn)運(yùn)、輸布不利，沉積于脈管而導(dǎo)致血脂異常。因此，脾氣不運(yùn)，痰瘀互結(jié)是高血脂的主要病理基礎(chǔ)，治療應(yīng)以活血化痰、 健脾祛濕為主。 自擬的馬黛通絡(luò)飲中， 君藥馬黛是純天然、無(wú)毒副作用的南美冬青科大葉冬青多年草本植物IlexparaguariensisSt. Hil. var. Paraguariensis樹(shù)上的嫩葉。當(dāng)?shù)厝税疡R黛制成茶葉飲用，馬黛的抗氧化成分占50%以上，含有196種天然營(yíng)養(yǎng)成分與生物活性物質(zhì)，可廣泛影響人體各大系統(tǒng)。既往臨床、動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，馬黛能夠改善血脂四項(xiàng)、血液流變學(xué)、血小板功能、血管活性物質(zhì)的指標(biāo)，抑制炎性因子的表達(dá)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，增加膽汁分泌等作用，與中藥活血化瘀、健脾利濕的功能相近[8-10]。馬黛的這些藥物功效與高血脂活血化痰、健脾祛濕的治法相吻合，因此選擇馬黛為君藥進(jìn)行治療；黃芪益氣健脾，利水消腫，石菖蒲化濕開(kāi)胃，開(kāi)竅豁痰，兩藥相伍，助君藥健脾化痰；桃仁、紅花、赤芍、川芎助君藥活血祛瘀，共為臣藥；佐以當(dāng)歸養(yǎng)血活血，柴胡、桔梗、枳殼調(diào)節(jié)氣機(jī),使氣行則血行。甘草調(diào)和諸藥，為使藥，全方合用則具有活血化瘀、健脾利濕、行氣化痰之功。本研究針對(duì)于此，選取馬黛通絡(luò)飲作為實(shí)驗(yàn)用藥，分析該方藥對(duì)ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

圖1 小鼠主動(dòng)脈石蠟切片HE染色(×400)

組別TC(mmol/l)TG(mmol/l)LDL-C(mmol/l)HDL?C(mmol/l)ACAT1(ng/L)LOX?1/GAPDH正常對(duì)照組5．72±0．412．42±0．241．11±0．293．13±0．1438．86±5．760．11±0．05模型組8．52±0．63b3．71±0．17b4．21±0．35b1．27±0．07b81．13±9．51b0．81±0．09b辛伐他汀組5．74±0．54a2．74±0．21ab1．17±0．47ab2．94±0．08ab46．41±7．27a0．28±0．045ab馬黛通絡(luò)飲低劑量組8．14±0．45b3．29±0．24ab2．04±0．24ab2．11±0．16ab73．41±11．35b0．64±0．02b馬黛通絡(luò)飲高劑量組6．04±0．65a2．78±0．16ab1．19±0．47ab2．76±0．26ab51．13±6．17ab0．41±0．05ab

注： 與模型組比較，aP<0.05；與正常對(duì)照組比較，bP<0.05。

圖2 Western blot檢測(cè)馬黛通絡(luò)飲對(duì)LOX-1蛋白表達(dá)的影響

研究表明，血脂水平的降低可減少內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，逆轉(zhuǎn)AS斑塊形成[11]。在血脂代謝過(guò)程中，沉積的脂質(zhì)構(gòu)成AS斑塊的脂質(zhì)核心，膽固醇酯和游離膽固醇是脂質(zhì)核心的主要成分。斑塊內(nèi)的膽固醇隨著血液中LDL-C的下降而降低，TC的下降促進(jìn)斑塊內(nèi)脂質(zhì)降低，故LDL-C和TC水平影響到斑塊內(nèi)的脂質(zhì)核心[12]。而HDL可以將細(xì)胞流出的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟分解代謝，以膽酸的形式排出體外，達(dá)到抗AS的作用[13-14]。本文研究證實(shí)了馬黛通絡(luò)飲可以降低血清TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，使斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積減少，改善斑塊的構(gòu)成成分，促進(jìn)AS斑塊消退和穩(wěn)定。

LOX-1特異性大量攝取Ox-LDL是形成泡沫細(xì)胞的病理基礎(chǔ)，同時(shí)ACAT-1使細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇酯化為膽固醇酯，大量的膽固醇酯蓄積在巨噬細(xì)胞內(nèi)，則轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[15]。LOX-1無(wú)限制地?cái)z取修飾的脂蛋白和ACAT-1酯化細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)為膽固醇酯是泡沫細(xì)胞形成的兩個(gè)關(guān)鍵步驟[16]，研究表明人或鼠As病變MFC內(nèi)有ACAT-1大量表達(dá)[17]，LOX-1和ACAT-1是參與As形成的重要靶點(diǎn)。本部分研究在ApoE基因敲除小鼠模型中探討了馬黛通絡(luò)飲對(duì)主動(dòng)脈病變中LOX-1和ACAT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，馬黛通絡(luò)飲降低了主動(dòng)脈LOX-1、ACAT-1表達(dá)，證實(shí)了馬黛通絡(luò)飲通過(guò)下調(diào)泡沫細(xì)胞形成基因LOX-1、ACAT-1表達(dá)而抑制AS斑塊巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

本實(shí)驗(yàn)觀察了ApoE-/-小鼠血脂、主動(dòng)脈內(nèi)膜及LOX-1和ACAT-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示馬黛通絡(luò)飲可以調(diào)節(jié)血脂異常和脂質(zhì)沉積，具有健脾利濕、行氣活血、化痰降脂的效果，對(duì)AS及心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用。

[1] Ar?ari DP，Bartchewsky W，dos Santos TW，et al. Antiobesity effects of yerb mate extract (Ilex paraguariensis) in high-fat diet-induced obese mice[J]. Obesity，2009，17：2127-2133.

[2] Pang J，Choi Y，Park T. Ilex paraguariensisextract ameliorates obesity induced by hyperlipidemic diet，potential role of AMPK in the visceral adipose tissue[J]. Arch Biochem Biophys，2008，476：178-185.

[3] Bixby M，Spieler L，Menini T，et al. Ilex paraguariensis extracts are potent inhibitors of nitrosative stress，a comparative study with green tea and wines using a protein nitration model and mammalian cell cytotoxicity[J]. Life Sci，2005，77：345-358.

[4] Burris KP，Davidson PM，Stewart CNJr，et al. Antimicrobial activity of Yerba Mate (ilex paraguariensis) aqueous extracts against Escherichia coli O157，h7 and Staphylococcus aureus[J]. J Food Sci，2011，76：456-462.

[5] Puangpraphant S，Berhow MA，Vermillion K，et al. Dicaffeoylquinic acids in Yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hilaire) inhibit NF-κB nucleus translocation in macrophages and induce apoptosis by activating caspases-8 and -3 in human colon cancer cells[J]. Mol Nutr Food Res，2011，55(10)：1509-1522.

[6] Morais EC，Stefanuto A，Klein GA，et al. Consumption of yerba mate (Ilex paraguariensis) improves serum lipid parameters in healthy dyslipidemic subjects and provides an additional LDL holesterol reduction in individuals on statin therapy[J]. J Agr Food Chem，2009，57：8316-8324.

[7] Mosimann AL，Wilhelm-Filho D，Da Silva EL. Aqueous extract of Ilex paraguariensis attenuates the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits[J]. Biofactors，2006，26：59-70.

[8] 于少泓.馬黛多酚對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的干預(yù)機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2015.

[9] 于少泓，吳俊玲，劉昭純.馬黛茶臨床作用研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34(4)：370-372.

[10] Yu Shaohong，Yue Shou Wei，Liu Zhaochun，et al. Yerba mate (Ilex paraguariensis) improves microcirculation of volunteers with high blood viscosity：A randomized，double-blind，placebo-controlled trial[J]. Experimental Gerontology，2015，(62)：14-22.

[11] Tiwari RL，Singh V，Barthwal MK. Macrophages：an elusive yet emerging therapeutic target of atherosclerosis[J]. Med Res Rev，2008，28(4)：483-544.

[12] Nissen SE，Tuzcu EM，Schoenhagen P，et al. Effect of intensive compared with moderate lipid-lowering therapy on progression of coronary atherosclerosis：a randomized controlled trial [J].JAMA，2004，291(9)：1071-1080.

[13] Wissler RW. Update on the pathogenesis of atherosclerosis [J]. Am J Med，1991，91(1B)：3S-9S.

[14] Koro CE，Bowlin SJ，Stump TE，et al. Low high-density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease[J].Am Heart J，2006，151(3)：556-563.

[15] PN DuiTington，B-Mackness，MI Mackness. Paraoxonase and atherosclerosis[J].Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2001，21(4)：473-480.

[16] Jovinge S，Hamsten A，Tomvall R，et al. Evidence for a role of tumor necrosis factor alpha in disturbances of triglyceride and glucose metabolism predisposing to coronary heart disease [J]. Metabolism，1998，47(1)：113.

[17] Lei L，Xiong Y，Chen J，et al. TNF-alpha stimulates theACAT1 expression in differentiating monocytes to promote the CE-laden cell formation[J]. J Lipid Res，2009，50(6)：1057-1067.

EffectsofMadaiTongluodecoctiononlipidmetabolisminapolipoproteinE-deficientmice

YUShaohong.

RehabilitationCollege，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China

YUShaohong，E-mail：sutcm2006@163.com

ObjectiveTo study the effect mechanism ofMadaiTongluodecoction on vascular endothelial injury of atherosclerosis in apolipoprotein e-knockout mice.MethodsFive-week-old male ApoE -/- mice were fed with a high fat high cholesterol diet. 8 weeks after the intervention ofMadaiTongluodecoction. The level of serum lipid and the expression of acy1-coenzyme A-cholesterol acyltransferases1(ACAT1)、Lectin-like OX-LDL receptor 1(LOX-1) was detected.ResultsSerum contents of TC, TG and LDL-C in the Model group were significantly higher than that in normal group. Serum contents of TC, TG, LDL-C and the ACAT1、LOX-1 of aortic tissue inMadaiTongluodecoction high-dose group were significantly lower than those in model group (P<0.05), and serum HDL-C inMadaiTongluodecoction high-dose group was significmitly lower than that in model group. TG、LDL-C、HDL-C and LOX-1 inMadaiTongluodecoction low-dose group were significant improved(P<0.05), but TC and ACAT1 were non-significant(P>0.05).ConclusionsMadaiTongluodecoction can regulate lipid metabolism of ApoE -/- mice and inhibit ACAT1 and LOX-1 expression of aortic tissue.MadaiTongluodecoction can inhibit the occurrence and development of atherosclerotic lesions，cardiovascular and cerebrovascular diseases, the possible mechanisms may be associated with lipid metabolism and inhibition of lipid deposition.

MadaiTongluodecoction； Blood lipid； ApoE -/- mice； Atherosclerosis； Lipid metabolism

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃(J16LK09)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2011-022)；國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2010-016)

250355 濟(jì)南，山東中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)學(xué)院

于少泓(1975- )，博士，副教授。研究方向：心腦血管疾病的康復(fù)研究。E-mail：sutcm2006@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.09.006

2016-12-22)

(本文編輯： 董歷華)