肖鵬 白樺 栗敏 劉桂舉 李瑞君 梅家轉(zhuǎn)

山茱萸提取物對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌組織中B7-H6表達(dá)的影響

肖鵬 白樺 栗敏 劉桂舉 李瑞君 梅家轉(zhuǎn)

目的：探討山茱萸提取物對(duì)原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）大鼠B7-H6表達(dá)的影響。方法：選取60只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、苦參堿組和山茱萸組，以二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠模型，分別給予苦參堿組和山茱萸組大鼠相應(yīng)藥物灌胃，模型組大鼠給予0.9%NaCl溶液灌胃。計(jì)數(shù)各組大鼠肝臟表面的癌結(jié)節(jié)數(shù)及其抑瘤率；經(jīng)H&E染色后觀察各組大鼠肝癌組織的病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)模型組、苦參堿組和山茱萸組大鼠肝癌組織中B7-H6的表達(dá)。結(jié)果：苦參堿組和山茱萸組大鼠的肝癌結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于模型組（P＜0.05）；山茱萸組的抑瘤率顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，山茱萸組和苦參堿組肝癌組織中B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.05），山茱萸組B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。Western blot法結(jié)果顯示，山茱萸組和苦參堿組B7-H6的蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.05），山茱萸組B7-H6的蛋白表達(dá)顯著高于苦參堿組（P＜0.05）。結(jié)論：山茱萸提取物可能通過(guò)上調(diào)腫瘤組織B7-H6的表達(dá)，抑制大鼠肝癌組織的生長(zhǎng)。

原發(fā)性肝癌 山茱萸提取 苦參堿 SD大鼠 B7-H6

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國(guó)惡性腫瘤致患者死亡人數(shù)中排名第2位［1］。盡管手術(shù)治療仍為HCC的最有效的治療方式，但是對(duì)于部分無(wú)法行手術(shù)治療的HCC患者，特別是晚期HCC患者的治療一直未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。因此，基因治療顯得尤為重要。NK細(xì)胞是重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)其表面的活化性受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)的配體而行使其殺傷功能。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的這些配體由自身基因編碼，通過(guò)應(yīng)激條件在細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)，因此被稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的識(shí)別［2］。NCR3（natural cytotoxicity receptors 3，NCR3）是新近發(fā)現(xiàn)的重要NK細(xì)胞活化性受體，B7-H6是已知唯一一種膜蛋白形式表達(dá)NCR3的配體，B7-H6在正常組織細(xì)胞表面不表達(dá)，卻能在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，B7-H6通過(guò)與NK細(xì)胞表面的活化受體NCR3結(jié)合激活并促進(jìn)NK細(xì)胞釋放TNFα、IFNγ殺傷靶細(xì)胞等［4-5］，是NK細(xì)胞腫瘤免疫的重要機(jī)制之一。有研究表明，山茱萸提取物具有調(diào)節(jié)免疫、降低氧化應(yīng)激以及抗腫瘤等作用［6］，但其機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)觀察山茱萸提取物對(duì)HCC大鼠模型HCC組織中B7-H6表達(dá)的影響，探討了其抑制HCC生長(zhǎng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

SPF級(jí)Sprague Dawley雄性近交系大鼠60只，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2008-0004］，平均體質(zhì)量為（200±20）g。HCC的HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑和儀器

山茱萸黃酮提取方法：山茱萸藥材粉碎以10倍量95%乙醇回流提取8 h，脫脂冷卻抽濾，濃縮，乙醇沉淀除去蛋白質(zhì)，干燥得到粗提物［7］?？鄥A注射液購(gòu)自山西振東泰盛制藥有限公司（批號(hào)：20059335）；二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；0.9%氯化鈉注射液購(gòu)自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20071011）；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒Max VisionTM和EDTA抗原修復(fù)液均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑購(gòu)自丹麥Dako公司；RIPA buffer購(gòu)自廣州泛思生物科技有限公司；兔抗人B7-H6多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自上海合星生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；四唑硝基藍(lán)（tetranitrobluetetrazolium chloride，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，BCIP）染色試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司；凝膠圖像處理系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、動(dòng)物模型建立及各組的給藥方法所有大鼠分籠飼養(yǎng)，各組均給予標(biāo)準(zhǔn)化飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)在通風(fēng)、25℃、相對(duì)濕度為70%的二級(jí)生物安全（P2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大鼠隨機(jī)分為模型組、苦參堿組和山茱萸組，20只/組。3組大鼠均腹腔注射DEN（50 mg/kg）建立HCC模型，1次/d，5次/周，共16周。第17周的首日，將山茱萸提取物60 mg/kg·d給予山茱萸組大鼠灌胃治療，灌胃容量為0.2 mL/10 g大鼠體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥2周。將15 mL苦參堿（150 mg）溶入500 mL蒸餾水中，配成質(zhì)量濃度為300 mg/L的苦參堿溶液，給予苦參堿組大鼠灌胃治療，灌胃容量為0.2 mL/10 g大鼠體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥2周。模型組大鼠給予等量0.9%NaCl注射液灌胃。

1.3.2 觀察各組大鼠腫瘤的變化 各組大鼠給藥結(jié)束后24 h脫頸處死，觀察各組大鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，仔細(xì)計(jì)數(shù)各組肝臟表面的HCC結(jié)節(jié)數(shù)，并且計(jì)算各組腫瘤形成率（腫瘤形成率=形成腫瘤的大鼠數(shù)/大鼠總數(shù)）。仔細(xì)剝離大鼠肝腫瘤組織，稱量模型組、苦參堿組和山茱萸組的大鼠瘤重，計(jì)算各組抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤重-山茱萸組或苦參堿組平均瘤重）/模型組平均瘤×100%［5］。

1.3.3 H&E染色觀察大鼠肝組織的病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變 選取各組大鼠的腫瘤組織標(biāo)本，組織緩沖液沖洗干凈，再以3.5%甲醛溶液固定，石蠟包埋，進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，常規(guī)H&E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠HCC組織的病理改變。

1.3.4 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠HCC組織中B7-H6的表達(dá) 選取各組石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，再以3%過(guò)氧化氫溶液抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；PBS沖洗，將1：75稀釋的兔抗人B7-H6多克隆抗體滴在切片上，放于4℃冰箱中過(guò)夜；滴加1：500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，在室溫條件下反應(yīng)10 min；使用DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色；脫水，并用中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 應(yīng)用Western blot法檢測(cè)各組大鼠HCC組織中B7-H6蛋白的表達(dá)水平 提取每組大鼠HCC組織，加入1 mL RIPA buffer裂解，于4℃離心5 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取10 μg/孔的蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝基纖維膜上并予5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1：1 000稀釋的兔抗人B7-H6或β-actin（內(nèi)參照）多克隆抗體，在4℃冰箱中搖晃過(guò)夜；次日取出室溫下復(fù)溫30 min，TBST搖床洗滌3次，室溫避光孵育熒光二抗，應(yīng)用Quality One軟件分析蛋白表達(dá)。

1.3.6 應(yīng)用Western blot法檢測(cè)HCC的HepG2細(xì)胞B7-H6蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為l×104/L，接種于6孔板內(nèi)（2 mL/孔）。培養(yǎng)24 h后，分3組（模型組、苦參堿組、山茱萸組），再培養(yǎng)24 h。蛋白質(zhì)濃度用BCA法檢測(cè)，各樣本稀釋成統(tǒng)一濃度，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，按1：1 000稀釋B7-H6抗體，在4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，用1：2 000稀釋的二抗孵育2 h，應(yīng)用Quality One軟件分析蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法；抑瘤率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的腫瘤形成率、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的比較

模型組14只大鼠成瘤，苦參堿組和山茱萸組各有14和15只大鼠成瘤。模型組與兩組干預(yù)組的腫瘤形成率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組干預(yù)組的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和腫瘤質(zhì)量均明顯低于模型組（P＜0.05）。其中以山茱萸組的腫瘤質(zhì)量最低（P＜0.05），其抑瘤率明顯高于苦參堿組大鼠（P＜0.05，表1）。

2.2 各組大鼠肝組織的病理學(xué)改變

H&E染色結(jié)果顯示，各組大鼠均形成肝細(xì)胞肝癌，模型組大鼠肝組織中肝索排列紊亂，肝竇變窄甚至消失，肝小葉內(nèi)可見(jiàn)大量碎片狀壞死，壞死細(xì)胞周圍伴隨增生的纖維細(xì)胞和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成數(shù)個(gè)假小葉，伴有顯著的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)，并可見(jiàn)癌巢生成，癌細(xì)胞呈多形性和多角形，細(xì)胞核大，核仁明顯深染，同時(shí)可見(jiàn)多核巨細(xì)胞。山茱萸組和苦參堿組大鼠肝組織也有輕度破壞，但與模型組比較，肝細(xì)胞變性、壞死均顯著減輕，并且癌結(jié)節(jié)數(shù)、癌灶的數(shù)目及大小均有明顯地減少、縮小，可見(jiàn)細(xì)胞體積固縮，有部分細(xì)胞裂解，形成大小不一的凋亡小體狀結(jié)構(gòu)和凋亡細(xì)胞核，染色質(zhì)濃縮。與苦參堿組比較，山茱萸組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕、癌結(jié)節(jié)數(shù)減少更顯著，可見(jiàn)更多凋亡小體（圖1）。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠肝組織中B7-H6蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，苦參堿組和山茱萸組大鼠HCC組織中B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于模型組，山茱萸組大鼠HCC組織中B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于苦參堿組（圖2）。

表1 各組大鼠的腫瘤形成率、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的比較Table 1 Comparison of the tumor formation rate,tumor nodule number,tumor weight,and tumor inhibition rate of each group

圖1 各組大鼠肝組織的病理學(xué)改變 （H&E×200）Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of pathological changes of liver tissue in each group(H&E×200)

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠肝組織中B7-H6蛋白的表達(dá) （IM×200）Figure 2 Expression of B7-H6 protein in liver tissue was detected by immunohistochemistry(IM×200)

2.4 應(yīng)用Western blot法檢測(cè)各組大鼠HCC組織B7-H6蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組大鼠比較，苦參堿組和山茱萸組HCC組織B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC組織中B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot法檢測(cè)各組大鼠HCC組織B7-H6蛋白的表達(dá)Figure 3 B7-H6 expression in hepatocellular carcinoma tissues was detected by Western blot

檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC細(xì)胞B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC細(xì)胞中B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞B7-H6蛋白表達(dá)Figure 4 B7-H6 expression in HepG2 cells was detected by Western blot

3 討論

在惡性腫瘤中，HCC嚴(yán)重威脅人類生命，其發(fā)病特點(diǎn)為起病隱匿，患者早期常無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，因此大多數(shù)患者在出現(xiàn)癥狀時(shí)已無(wú)手術(shù)時(shí)機(jī)，而對(duì)于這類患者的治療目前束手無(wú)策［8］。近年來(lái)采用傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療癌癥成為研究熱點(diǎn)［9］。山茱萸作為臨床常用的一味扶正固本的中藥，在抗腫瘤方面已早有應(yīng)用，如《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中含有山茱萸的定性湯可以護(hù)衛(wèi)機(jī)體，斂陰止汗治療腫瘤后期的驚悸，氣滯血瘀等。近期也有研究表明，山茱萸可以抑制人肺癌細(xì)胞的增殖［10］，且山茱萸可以調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的免疫狀態(tài)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用［11］，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚無(wú)詳細(xì)報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸提取物在體內(nèi)外對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞均有抑制作用，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和干擾細(xì)胞周期分布有關(guān)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)兩組干預(yù)組的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和腫瘤質(zhì)量均明顯低于模型組，其中以山茱萸組的腫瘤質(zhì)量最低，其抑瘤率明顯高于苦參堿組大鼠。在H&E染色結(jié)果方面，苦參堿組與山茱萸組的肝臟病理學(xué)變化得到明顯的改善，其中以山茱萸組的改善效果最佳。Wang等［10］通過(guò)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖能夠促進(jìn)Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果顯示，苦參堿組和山茱萸組大鼠B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于模型組，山茱萸組B7-H6的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于苦參堿組。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC組織B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高；而與苦參堿組比較，山茱萸組B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證山茱萸提取物抑制HCC與共刺激因子B7-H6的表達(dá)有關(guān)，本研究在體外實(shí)驗(yàn)即HCC細(xì)胞HepG2中同樣發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，苦參堿組和山茱萸組HCC細(xì)胞B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高；而與苦參堿組比較，山茱萸組HCC細(xì)胞中B7-H6蛋白表達(dá)明顯升高。

綜上所述，山茱萸提取物可抑制HCC的生長(zhǎng)，其可能的機(jī)制與共刺激因子B7-H6的表達(dá)有關(guān)。

[1]EI-Serag HB.Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellularcarcinoma[J].Gastroenterology,2012,142(6):1264-1273.

[2]Waldhauer I,Steinle A.NK cells and cancer immunosurveillance[J].Oncogene,2008,27(45):5932-5943.

[3]Pende D,Parolini S,Pessino A,et al.Identification and molecular characterizati-on of NKp30,a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells[J].J Exp Med,1999,190(10):1505-1516.

[4]Rusakiewicz S,Nocturne G,Lazure T,et al.NCR3/NKp30 Contributes to Pathogenesis in Primary Sjogren's Syndrome[J].Sci Transl Med,2013,5(195):195ra96.

[5]Matta J,Baratin M,Chiche L,et al.Induction of B7-H6,a ligand for the natural killer cell-activating receptor NKp30,in inflammatory condition[J].Blood,2013,122(3):394-404.

[6]Zhang LT,Yuan ZF,Du YF,et al.Recent development and prospect of Cornus officinalis[J].Chin Trad Herbal Drugs,2004,35(8):116-119.

[7]Li MH.Effects of Active components of cornus officinalis on tumor and senescence cell model[D].Nanjing Univ Chin Medi,Nanjing,2011.

[8]Konmun J,Danwilai K,Nqamphaiboon N,et al.A phaseⅡrandomized double-blind placebo-controlled study of 6-gingerol as an anti-emetic in solid tumor patients receiving moderately to highly emetogenic chemotherapy[J].Medi Oncol,2017,34(4):69.

[9]Wang HY,Li FA.Research status of anti-tumor traditional chinese medicine[J].J Qinghai Medi College,2008,29(4):278-282.

[10]Wang EJ,Jin Yi.Effect of corni fructus polysaccharides on apoptosis and Bcl-2,Bax expression in A549 cells[J].Chin Tradition Pat Medi,2012,34(5):808-811.

[11]Zou PW,Zhao CJ.Study on the anti-tumor effect of polysaccharides from cornus officinalis and its immunologic mechanism[J].Chin Hosp Pharm J,2012,32(1):20-22.

Effect of Fructus Corni extract on B7-H6 expression in primary liver cancer of rats

Peng XIAO,Hua BAI,Min LI,Guiju LIU,Ruijun LI,Jiazhuan MEI

Department of Oncology,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou 450053,China

Jiazhuan MEI;E-mail:mjzhuan@163.com

Objective:To investigate the effects of Fructus Corni extract on the B7-H6 expression in primary liver cancer cells of rats.Methods:Sixty SD rats were randomly divided into three groups,namely,model,matrine,and Cornus officinalis.The rat model bearing the primary liver cancer was induced by diethylnitrosamine,except for the rats in the control group.The rats in both the matrine and Cornus officinalis groups were fed with matrine and Cornus officinalis.The rats in model groups were fed with 0.9%sodium chloride solution.The number of hepatocellular carcinoma nodules was calculated,and the tumor growth inhibition rate was also calculated.The pathological changes of hepatic tissues in rats of each group were observed by hematoxylin and eosin staining.The expression levels of B7-H6 in these three groups were determined by immunohistochemistry and Western blot.Results:The number of liver nodules of the matrine and Fructus Corni group rats was lower than that of the model group(P＜0.05).The tumor inhibition rate of the Cornus group was significantly higher than that of the matrine group(P＜0.05).The tumor growth inhibition rate of the Cornus officinalis group was significantly higher than that of the matrine group(P＜0.05).Immunohistochemistry showed that the positive expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group and the matrine group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05),and the positive expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group was significantly higher than that in the matrine group(P＜0.05).Similarly,the protein expression of B7-H6 in the Cornus officinalis and matrine groups was significantly higher than that in the model group(P＜0.05)by Western blot,while the protein expression of B7-H6 in the Cornus officinalis group was significantly higher than that in the matrine group(P＜0.05).Conclusion:Fructus Corni extract may inhibit the growth of hepatocellular carcinoma through upregulating the B7-H6 expression.

primary hepatocarcinoma,Cornus officinalis extract,matrine,SD rats,B7-H6

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.376

鄭州人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（鄭州市450053）

梅家轉(zhuǎn) mjzhuan@163.com

（2016-12-05收稿）

（2017-08-08修回）

（編輯：鄭莉 校對(duì)：孫喜佳）

肖鵬 專業(yè)方向?yàn)榉伟?、消化系統(tǒng)腫瘤的綜合治療。

E-mail：zzrmyyxiaopeng@sina.com