林瑜亮 黨瑩 孫紅軍 荔志云

異甘草素增加人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放射敏感性的實驗研究*

林瑜亮 黨瑩 孫紅軍 荔志云

目的：研究異甘草素對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）放射敏感性的影響及作用機(jī)制。方法：無血清培養(yǎng)法提取SHG44人腦GSCs。檢測異甘草素和X射線聯(lián)合運用下GSCs活性和干細(xì)胞球形成情況。檢測Notch1信號通路、NF-κB和caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果：采用10 μM異甘草素在8 Gy較高劑量X射線存在的情況下，能夠抑制GSCs球的數(shù)目和直徑（P＜0.05）。20 μM異甘草素殺傷GSCs的作用明顯，且在4、8 Gy的X射線下聯(lián)合殺傷GSCs的能力依次增強(qiáng)（P＜0.05）。異甘草素干作用48 h后Notch1的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。4 Gy的X射線照射后，分別于6、24 h，異甘草素干預(yù)組P-NF-κB表達(dá)逐漸增高（P＜0.05），而cleaved caspase-3的表達(dá)在X射線照射后的24 h開始升高（P＜0.05）。結(jié)論：異甘草素能夠增加GSCs的放射敏感性，抑制Noch1信號通路，上調(diào)NF-κB和caspase-3的表達(dá)，參與X射線對GSCs的損傷過程。

異甘草素 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 放射敏感性 Notch1 NF-κB caspase-3

膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)上皮性顱內(nèi)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%［1］。目前，膠質(zhì)瘤的主要治療方法為確保手術(shù)安全范圍內(nèi)最大程度切除腫瘤并聯(lián)合放療和化療，然而高級別膠質(zhì)瘤5年生存率仍低于 10%［2］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）具有自我更新、無限增殖和致瘤的能力，對其一線治療藥物替莫唑胺耐藥，同時表現(xiàn)出放射抵抗，是膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的根源［1，3］。異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）是一種黃酮類化合物，主要來源于甘草，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝和保護(hù)心血管等生物學(xué)活性［4］。在前期實驗證明，異甘草素能抑制GSCs的增殖，同時增強(qiáng)替莫唑胺的殺傷作用［5］。本研究以SHG44人腦GSCs為研究對象，研究異甘草素對GSCs放射敏感性的影響及機(jī)制，進(jìn)一步為異甘草素治療膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SHG44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株取自ATCC（美國組織培養(yǎng)保藏中心）；異甘草素購自上海源葉生物科技有限公司；DAPT購自美國Gene Operation公司；胎牛血清購自以色列BI公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、D-MEM/F-12培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；B27添加劑購自美國Gibco公司；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）均購自美國PeproTech公司；兔抗人CD133抗體購自中國臺灣省Abnova公司；小鼠抗人Nestin抗體、兔抗人Bcl-2抗體、PE標(biāo)記的兔抗小鼠二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司；免疫染色封閉液抗熒光淬滅封片液均購自上海碧云天生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自北京Solarbio公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；小鼠抗人Hes1抗體、小鼠抗人Notch1抗體、小鼠抗人RBPJK抗體、兔抗人NF-κB抗體、小鼠抗人caspase-3抗體均購自中國臺灣省Abcam公司；兔抗人β-actin抗體購自美國Bioworld Technology公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Earthox公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自北京Solarbio公司；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板購自中國香港Beaver公司。

1.2 方法

1.2.1 GSCs的培養(yǎng)及鑒定 SHG44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第3代。取對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化1 min；改用無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基D-MEM/F-12（含2%B27、20 μg/L EGF和20 μg/L bFGF）終止消化。1 500 r·min-1離心8 min，棄上清，采用培養(yǎng)基重懸，接種于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板中，隔天補充約1/5新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察GSCs生長，7～9 d傳代。

取活力良好的人腦GSCs球，接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的玻片上。取細(xì)胞爬片，37℃晾干，PBS漂洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS漂洗3次，每次5 min，0.5%Triton-X-100 37℃透膜10 min。PBS漂洗3次，每次5 min，加免疫染色封閉液，室溫孵育30 min。滴加稀釋的一抗：Nestin（1：200）、CD133（1：200）和Bcl-2（1：100），4℃孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加PE標(biāo)記的兔抗小鼠二抗（1：100）及FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：1 000），用DAPI染核，37℃孵育40 min。PBS漂洗3次，每次5 min，封片液封片，熒光顯微鏡鑒定GSCs表面分子標(biāo)志物的表達(dá)。

1.2.2 異甘草素處理和X射線照射 取第3代GSCs，1 000 r·min-1離心 8 min，棄上清，胰酶消化 5 min。加入無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心8 min。棄上清，再次用培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板每孔接種5.0×104個細(xì)胞。各實驗組的孔中加入DMSO溶解的異甘草素或DAPT（γ分泌酶抑制劑，用于特異性阻斷Notch1信號通路），使異甘草素濃度為0、10、20、40、80、160 μM，DAPT濃度為2.5 μM。異甘草素干預(yù)24 h后，室溫下對細(xì)胞進(jìn)行X射線照射（21EX型雙光子高能直線加速器），劑量率為4 Gy/min，總劑量為0、2、4、6、8、10 Gy。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 取異甘草素干預(yù)和X射線照射后的GSCs，調(diào)整密度至2 500個/100 μL，接種到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板中，每組均設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)12、24、48、72 h。加入CCK-8試劑，37℃孵育3 h，使用酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度。

1.2.4 異甘草素和X射線照射后GSCs的形態(tài)觀察異甘草素干預(yù)和X射線照射后的細(xì)胞繼續(xù)在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板中培養(yǎng)，隔日加藥。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察異甘草素和放療作用至第9 d GSCs球的形成情況，測量干細(xì)胞球數(shù)量和直徑。

1.2.5 應(yīng)用Western blot法檢測Notch1信號通路、NF-κB和caspase-3表達(dá) 應(yīng)用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以40 μg/孔的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，在暗室曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果采用表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHG44GSCs鏡下形態(tài)和鑒定

本研究前期已經(jīng)證實，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板為培養(yǎng)GSCs較理想的載體，SHG44人腦GSCs在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮克隆球樣生長。傳代后，GSCs得到純化。免疫熒光染色鑒定干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、CD133表達(dá)呈陽性，癌基因Bcl-2表達(dá)呈陽性，細(xì)胞克隆球為 GSCs［6］。

2.2 異甘草素和X射線對SHG44人腦GSCs活性的影響

異甘草素和X射線照射12、24、48、72 h后檢測細(xì)胞活性。異甘草素處理組的細(xì)胞活性在72 h后開始呈現(xiàn)劑量依賴性下降（P＜0.05）。160 μM異甘草素在12 h就對 GSCs活性產(chǎn)生抑制作用（P＜0.05）（圖1A）。GSCs暴露于不同劑量X射線后，在同一時間點，各組細(xì)胞活性無明顯差別，且各組GSCs活性隨著時間增加的趨勢相同（圖1B）。

2.3 異甘草素和X射線對SHG44人腦GSCs成球能力的影響

異甘草素單獨作用至第9 d，20～80 μM異甘草素組GSCs球的數(shù)量和直徑均呈劑量依賴性下降（P＜0.01），且在160 μM異甘草素組中未觀察到GSCs球，僅有少量單細(xì)胞的懸浮GSCs（圖2）。

X射線照射后第9 d，各劑量的X射線對GSCs球數(shù)目的影響無差異。2 Gy的X射線能夠引起GSCs球的直徑下降（P＜0.05）。4～10 Gy的X射線照射后GSCs球直徑下降更明顯（P＜0.01），但其之間無顯著性差異（圖3）。

2.4 異甘草素對SHG44人腦GSCs放射敏感性的影響

選取較有代表性的10、20、40 μM的異甘草素濃度，聯(lián)合4、8 Gy的X射線劑量，從GSCs成球能力的角度評估異甘草素放射增敏的效果。

測量干預(yù)后第9 d GSCs球的數(shù)目。10 μM異甘草素聯(lián)合8 Gy高劑量的X射線后降低GSCs球的數(shù)量（P＜0.05）。20 μM異甘草素聯(lián)合X射線照射后，GSCs球數(shù)量顯著下降，且8 Gy較4 Gy下降更明顯（P＜0.05），這一趨勢與DAPT組相似。40 μM異甘草素單獨運用就能將GSCs懸浮球的數(shù)量抑制在較低的水平，聯(lián)合X射線照射后沒有進(jìn)一步減少GSCs成球數(shù)目（圖4A）。

測量干預(yù)后第9 d GSCs球的直徑。10 μM異甘草素組在接受4 Gy的X射線照射后，GSCs球所形成的直徑下降（P＜0.05），但更高劑量的X射線照射，未進(jìn)一步降低GSCs球的直徑，這一趨勢與對照組和DAPT組類似。20、40 μM異甘草素單獨作用下對GSCs球直徑的抑制較強(qiáng)，聯(lián)合X射線照射后未表現(xiàn)出進(jìn)一步抑制的效果（圖4B）。

圖1 不同濃度異甘草素和不同劑量的X射線對GSCs增殖的影響Figure 1 Effect of isoliquiritigenin and radiation on glioma stem cell growth

圖2 異甘草素對GSCs球數(shù)量和直徑的影響Figure 2 Effect of isoliquiritigenin on the diameters and numbers of neurospheres

圖3 X射線對GSCs球數(shù)量和直徑的影響Figure 3 Effect of radiation on the diameters and numbers of neurospheres

圖4 異甘草素對SHG44人腦GSCs放療敏感性的影響Figure 4 Effect of isoliquiritigenin on the cell radiosensitivity of glioma stem cells

2.5 應(yīng)用Western blot法分析異甘草素對Notch1信號通路蛋白的表達(dá)

Notch1信號通路能夠促進(jìn)GSCs的放射抵抗［7］，本研究也觀察到運用Notch1通路的特異性阻斷劑DAPT能夠增加GSCs對X射線照射的敏感性，與異甘草素放射增敏效果相似。選取10、20、40 μM異甘草素處理GSCs 48 h。Notch1（信號通路受體）、RBPJK（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）和Hes1（靶基因）的表達(dá)在DAPT組和20、40 μM異甘草素組呈劑量依賴性下降（P＜0.05，圖5）。

圖5 異甘草素對GSCs的Notch1信號通路蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of isoliquiritigenin on the protein expression levels of Notch1 pathway of glioma stem cells

2.6 應(yīng)用Western blot法分析放療后NF-κB和caspase-3的變化

采用20 μM的異甘草素預(yù)先處理細(xì)胞24 h，然后觀察4 Gy的X射線照射后6、24 h的NF-κB和caspase-3的表達(dá)情況。

無X射線照射的情況下，各組P-NF-κB表達(dá)量均較低。4 Gy的X射線照射后，異甘草素組P-NF-κB比不加異甘草素組高，且24 h進(jìn)一步升高；異甘草素組cleaved caspase-3表達(dá)比不加異甘草素組高（P＜0.05），但不隨時間變化。未加異甘草素組的cleaved caspase-3在4 Gy的X射線照射后明顯增高（P＜0.05），但不隨時間變化。異甘草素組的cleaved caspase-3在4 Gy的X射線照射后的6 h無明顯改變，但在24 h后，進(jìn)一步升高（P＜0.05，圖6）。

圖6 異甘草素對X射線照射前后GSCs的NF-κB和caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of isoliquiritigenin on the protein expression levels of NF-κB

3 討論

人腦膠質(zhì)瘤因為放化療抵抗，局部復(fù)發(fā)并不少見。在膠質(zhì)瘤的臨床治療方案中，通常在術(shù)后聯(lián)合替莫唑胺，每日以2 Gy的X射線外照射，共30次，總量60 Gy，然而此類患者的5年生存率仍低于10%［2］。本研究觀察到在72 h內(nèi)GSCs的活性并不因X射線劑量的增加而改變。X射線能夠在一定程度上減小GSCs球的直徑，但是成球的數(shù)目并未下降，提示GSCs放射抵抗較強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的異甘草素在12～48 h內(nèi)具有促進(jìn)GSCs向星形細(xì)胞和神經(jīng)元分化的能力［5］，在72 h及9 d后，GSCs的活性和成球能力均被異甘草素所抑制?？梢姸虝r間內(nèi)的異甘草素干預(yù)改變了GSCs的特性。因此，用異甘草素干預(yù)24 h，再聯(lián)合X射線照射，觀察異甘草素對GSCs的放射增敏效果。本研究表明，10 μM的異甘草素對GSCs的直接抑制作用有限，但在8 Gy較高劑量X射存在的情況下，能夠增加GSCs放射敏感性，表現(xiàn)為GSCs球數(shù)量和直徑的下降。20 μM的異甘草素殺傷GSCs作用明顯，且在4 Gy的X射線照射時存在較強(qiáng)的增敏作用，在8 Gy的X射線下聯(lián)合殺傷作用進(jìn)一步提高。而40 μM以上的異甘草素本身的直接抑制增殖作用較好，增敏效果可能被掩蓋。

一些細(xì)胞信號通路的異常表達(dá)與GSCs的放射抵抗有關(guān)。Notch1信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化和命運決定，參與維持GSCs的特性［8］。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Notch1信號通路表達(dá)上調(diào)，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)［9］。Notch信號通路能夠促進(jìn)GSCs的放射抵抗［7］，因此為降低膠質(zhì)瘤治療的靶標(biāo)之一。本研究結(jié)果證實異甘草素能夠像DAPT一樣有效抑制GSCs的Notch1信號通路的表達(dá)，使靶基因Hes1表達(dá)下調(diào)，通過此途徑抑制GSCs的生長，同時增加GSCs對X射線照射的敏感性。

細(xì)胞在受到X射線照射后，會引起相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、代謝和分子水平的改變，以應(yīng)對X射線造成的損傷。NF-κB參與細(xì)胞應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡等過程，本研究觀察到異甘草素的單獨運用對GSCs的P-NF-κB蛋白影響較小，但是在X射線照射后，能夠在短時間內(nèi)導(dǎo)致P-NF-κB表達(dá)的上調(diào)，在24 h表達(dá)量顯著升高，異甘草素可能通過上調(diào)P-NF-κB的表達(dá)，影響GSCs在X射線照射后發(fā)生損傷和細(xì)胞死亡。caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，其中caspase-3為關(guān)鍵執(zhí)行分子。本研究提示異甘草素和X射線均能上調(diào)GSCs的cleaved caspase-3的表達(dá)，但在單一因素作用下表達(dá)量隨時間變化相對固定。當(dāng)異甘草素和X射線聯(lián)合時，GSCs的cleaved caspase-3表達(dá)在24 h后出現(xiàn)明顯上調(diào)，說明caspase-3可能參與異甘草素促進(jìn)GSCs放射敏感性的調(diào)節(jié)過程。

綜上所述，GSCs對X射線照射具有較強(qiáng)的抵抗性，異甘草素可能通過阻斷Notch1通路抑制GSCs的增殖，并增加其放射敏感性。在受到X射線干預(yù)后，通過上調(diào)NF-κB和caspase-3的表達(dá)參與X射線造成的GSCs的損傷過程。深入研究異甘草素對GSCs的放射增敏作用的機(jī)制，運用動物實驗驗證異甘草素的放射增敏效果，并與其他治療方式相結(jié)合，旨在為治療人腦膠質(zhì)瘤提供理論基礎(chǔ)和新的思路。

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Isoliquiritigenin promotes the radiosensitivity of human glioma stem cells

Yuliang LIN,Ying DANG,Hongjun SUN,Zhiyun LI

Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital of the PLA Lanzhou Military Area Command,Lanzhou 730050,China

Zhiyun LI;E-mail:lizhiyun456@163.com

Objective:To investigate the influence of isoliquiritigenin on the radiosensitivity of glioma stem cells and demonstrate the potential underlying mechanism.Methods:Glioma stem cells were isolated from SHG44 human glioma cells by serum-free medium.Cell proliferation abilities were detected after isoliquiritigenin treatment and radiotherapy by using Cell Counting Kit-8.The formation of glioma stem cell spheres was observed using an inverted microscope.The protein expression levels of Notch1 signal pathway,NF-κB,and caspase-3 were examined by Western blot analysis.Results:Isoliquiritigenin(10 μM)inhibited the formation of tumorspheres at 8 Gy radiation(P＜0.05).Isoliquiritigenin(20 μM)exerted evident growth inhibitory effect on glioma stem cells.Isoliquiritigenin pretreatment combined with 4 or 8 Gy radiation reduced the cell radioresistance significantly(P＜0.05).The protein expression levels of Notch1 in the isoliquiritigenin and DAPT groups were lower than those of the control at 48 h after isoliquiritigenin treatment(P＜0.05).The protein expression levels of P-NF-κB began to increase at 6 and 24 h after 4 Gy radiation with isoliquiritigenin pretreatment(P＜0.05).Isoliquiritigenin pretreatment combined with 4 Gy radiation increased the protein expression level of cleaved caspase-3 at 24 h after radiation compared with that of the isoliquiritigenin treatment alone(P＜0.05).Conclusion:Isoliquiritigenin may downregulate Notch1 signal pathway and affect different aspects of cell stress and death,including NF-κB-and caspase-3-associated processes,thereby promoting the radiosensitivity of glioma stem cells.

isoliquiritigenin,glioma stem cells,radiosensitivity,Notch1,NF-κB,caspase-3

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.22.402

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科（蘭州市730050）

*本文課題受甘肅省重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展類）項目（編號：17YFIFA136）資助

荔志云 lizhiyun456@163.com

This work was supported by the Key Program for Research and Development of Gansu Province(No.17YF1FA136)

（2017-04-05收稿）

（2017-08-16修回）

（編輯：楊紅欣 校對：孫喜佳）

林瑜亮 專業(yè)方向為顱內(nèi)腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

E-mail：linyuliang318@163.com