楊寧，蘇斌，寇璐，董博，李楊，楊靖宇，秦勤

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

載脂蛋白J在大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型中表達(dá)規(guī)律的研究

楊寧，蘇斌，寇璐，董博，李楊，楊靖宇，秦勤

目的：研究載脂蛋白J（Apo J）在大鼠頸動(dòng)脈球囊擴(kuò)張后血管再狹窄模型中的表達(dá)規(guī)律。 方法：40只Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。采用2F Fogarty球囊導(dǎo)管于右側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行球囊拉傷造模，術(shù)后1、2、3、4周共四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。在各時(shí)間點(diǎn)，取右側(cè)頸總動(dòng)脈后，采用蘇木伊紅染色法（HE）觀察其形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)Apo J蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)Apo J 基因的表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)相比，實(shí)驗(yàn)組在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)膜增生明顯，Apo J蛋白及基因表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；且實(shí)驗(yàn)組隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)膜持續(xù)增生至第四周達(dá)到最大值，Apo J蛋白及基因表達(dá)在第3周達(dá)到高峰，第4周有所下降（P＜0.05）。 結(jié)論：Apo J可能與血管損傷及損傷后內(nèi)膜增生密切相關(guān)，血管中高表達(dá)的Apo J主要來源于損傷組織局部的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）合成，推測(cè)它可能是損傷后的一種代償，通過抑制VSMC的增值和遷移的活性對(duì)再狹窄起保護(hù)作用。為尋找新的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血管再狹窄的干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。

載脂蛋白J 類；頸動(dòng)脈狹窄；內(nèi)膜增生

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1222.)

冠心病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率亦逐年攀升[1]。目前，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）是治療冠心病的有效方法之一，但其再狹窄率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響了PTCA的遠(yuǎn)期療效[2]。 雖然藥物洗脫支架（DES）及聯(lián)合雙聯(lián)抗血小板的藥物治療在某種程度上極大的降低了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）后血管再狹窄的發(fā)生[3]，但是，DES置入術(shù)后患者再狹窄的發(fā)生率仍高于10%[4]。DES球囊損傷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移、增值、基質(zhì)生成及重塑進(jìn)而導(dǎo)致PCI術(shù)后再狹窄。雖然在預(yù)防PCI術(shù)后血管再狹窄技術(shù)方面已有相關(guān)研究，但并未取得有意義的進(jìn)展[5]，說明PCI術(shù)后再狹窄這一病理生理過程具有復(fù)雜性及挑戰(zhàn)性。載脂蛋白（Apo J）可分為分泌型（s CLU）和核型（n CLU）兩種蛋白[5]，主要在肝臟合成，可與高密度脂蛋白、脂質(zhì)、載脂蛋白A、對(duì)氧磷酶等多種生物分子相結(jié)合[6]，廣泛分布于心臟、腎臟、腦組織等多種組織中，通過促進(jìn)細(xì)胞生存、減少氧化應(yīng)激、促進(jìn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[7]、促進(jìn)泡沫細(xì)胞中膽固醇外流[8]等功能發(fā)揮對(duì)心血管的保護(hù)作用[9]。已有研究報(bào)道Apo J參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)中膜及血管成形術(shù)后再狹窄的進(jìn)程[10]，但其在心血管疾病進(jìn)程中是保護(hù)作用還是致病作用尚存在爭(zhēng)議。本研究通過建立Wistar大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄動(dòng)物模型，檢測(cè)Apo J在血管再狹窄進(jìn)程中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，從而探討Apo J在再狹窄病程中的作用及其可能的機(jī)制，為尋找新的PCI術(shù)后再狹窄的干預(yù)靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重350～400 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。按照隨機(jī)數(shù)表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。其中各組再以損傷后的第1、2、3、4周分為四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。

1.2 建模方法：所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)組：手術(shù)當(dāng)天稱重，使用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉。頸部備皮，取頸正中切口約2～3 cm，經(jīng)皮鎖骨下靜脈穿刺（天津市胸科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供技術(shù)支持）并注射肝素（200 IU/kg）。于原擬定切口切開皮膚，逐層鈍性分離，充分暴露頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，永久結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，輕微向頭部牽拉血管，用止血夾臨時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈起始部。用眼科剪在頸外動(dòng)脈剪“V”型切口，然后插入2F Fogarty球囊導(dǎo)管（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司,中國）約3 cm，給予2～3個(gè)大氣壓，輕微回拉球囊至動(dòng)脈切口處，以出現(xiàn)摩擦感而又能拉動(dòng)球囊為合適壓力，以此方法反復(fù)損傷3次，撤除2F Fogarty球囊導(dǎo)管，永久結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，解除頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈止血夾，觀察頸內(nèi)動(dòng)脈血流情況，可見明顯搏動(dòng)表明血流通暢。觀察術(shù)野有無活動(dòng)性出血，無則逐層縫合傷口，硫酸慶大霉素注射液2萬單位肌肉注射預(yù)防感染。對(duì)照組：進(jìn)行假手術(shù)處理，除不插入2F Fogarty球囊，其他步驟均同實(shí)驗(yàn)組。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死及標(biāo)本獲?。?0%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，鎖骨下靜脈穿刺注射10%氯化鉀溶液2～3 ml處死動(dòng)物，沿頸正中切口切開皮膚，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，并取下頸總動(dòng)脈全段，剪下大約0.3 cm放入10%中性福爾馬林固定以備蘇木伊紅染色法（HE） 病理檢查，余下血管放入凍存管并放入液氮中速凍，24 h后放入-80℃冰箱中長(zhǎng)久保存，為免疫組化和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）備用。本實(shí)驗(yàn)已通過我院動(dòng)物倫理審查。

1.4 蘇木伊紅染色觀察頸總動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)變化：標(biāo)本在10%甲醛溶液中固定3～4 h，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚度4 μm。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血管損傷的情況。

1.5 免疫組化檢測(cè)頸總動(dòng)脈血管Apo J蛋白的表達(dá)：采用免疫組化S-P二步法檢測(cè)頸總動(dòng)脈中是否有Apo J蛋白表達(dá)。常規(guī)切片、烘片、脫蠟、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、蒸餾水沖洗及抗原修復(fù)、一抗、二抗孵育、最后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）方法顯色。一抗（兔抗人Apo J IgG多克隆抗體，美國Santa Cruz公司）。二抗（快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。所有照片使用IS Capture系統(tǒng)拍攝并保存，使用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。使用平均光密度值（MOD）對(duì)Apo J蛋白的陽性表達(dá)做半定量分析。在400倍光鏡下進(jìn)行測(cè)量，選取血管的中膜及內(nèi)膜為待測(cè)區(qū)域，通過測(cè)量獲得待測(cè)區(qū)域的面積（Area）及積分光密度值（IOD），以平均光密度值表示Apo J蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱。MOD計(jì)算公式如下：MOD=累積光密度值(sum of IOD)/累積面積(sum of Area)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)頸總動(dòng)脈血管中Apo J mRNA的表達(dá)：用Trizol一步法提取RNA，然后按試劑盒說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃1 h，95℃ 5 min，4℃ 10 min。Apo J引物上游 5’-TAA GGA GAT TCA GAA CGC CG-3’， 下 游 5’-ATC CCT GGT GTC ATC TAG AG-3’；GAPDH 引物上游5’- GTG ATG CTG GTG CCG AGT AG-3’，下游5’-GGT GGC AGT GAT GGC GTG C-3’。 按 SYBR?Premix Ex Taq?system （Perfect Real -time）試劑盒（日本Takara公司）進(jìn)行Real-time PCR操作。在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增（美國Applied Biosystems公司）。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性 95℃5 s，退火60℃ 34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。2-ΔΔCt的分析方法比較各組mRNA的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模存活率及成功率：實(shí)驗(yàn)組20只大鼠中1只因術(shù)中操作不慎壓迫氣道致窒息死亡，1只因血管切口剪開大小不當(dāng)，無法插入球囊導(dǎo)管，造模失敗，1只因動(dòng)脈出血于術(shù)后12 h死亡，最終存活大鼠17只，存活率85%。實(shí)驗(yàn)組病理檢查均出現(xiàn)內(nèi)膜增生增厚，成活的大鼠均造模成功。平均手術(shù)時(shí)間（34.19±6.09）min。

2.2 形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果：

2.2.1 各組血管切片形態(tài)學(xué)顯微鏡檢測(cè)及大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜面積比（I/M）的比較結(jié)果：血管切片形態(tài)學(xué)顯微鏡檢測(cè)詳見圖1～5。大鼠頸總動(dòng)脈I/M的比較（表1），對(duì)照組的I/M接近于0。實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4周的I/M較同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組損傷后各時(shí)間點(diǎn)間的I/M逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.2 各組大鼠頸總動(dòng)脈Apo J蛋白表達(dá)情況：免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Apo J蛋白主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，對(duì)照組血管全層中未見Apo J蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均可檢測(cè)到Apo J表達(dá)（圖6）。

以MOD表示Apo J蛋白表達(dá)的情況（表2），對(duì)照組的MOD接近于0，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Apo J蛋白的表達(dá)均高于其對(duì)照組， 3周Apo J蛋白表達(dá)最強(qiáng)， 4周表達(dá)強(qiáng)度減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 ～5 蘇木伊紅染色法染色檢查各組大鼠頸總動(dòng)脈血管切片形態(tài)意圖

表1 各組大鼠頸總動(dòng)脈I/M的比較

表1 各組大鼠頸總動(dòng)脈I/M的比較

注: I/M：總動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜面積比。與實(shí)驗(yàn)組1周比較aP＜0.05;與實(shí)驗(yàn)組2周比較 b P＜0.05; 與實(shí)驗(yàn)組3周比較 cP＜0.05。*：存活大鼠

表2 各組大鼠勁總動(dòng)脈Apo J蛋白表達(dá)水平

表2 各組大鼠勁總動(dòng)脈Apo J蛋白表達(dá)水平

注： Apo J：載脂蛋白J；與實(shí)驗(yàn)組1周比較aP＜0.05;與實(shí)驗(yàn)組2周比較bP＜0.05; 與實(shí)驗(yàn)組3周比較 cP＜0.05。*：存活大鼠

圖6 免疫組化檢測(cè)各組大鼠頸總動(dòng)脈Apo J蛋白表達(dá)情況(x400)

2.2.3 各組大鼠頸總動(dòng)脈Apo J mRNA表達(dá)情況（表3）：與對(duì)照組相比，Apo J mRNA在實(shí)驗(yàn)組1周未升高（P＞0.05）， 2周顯著升高， 3周達(dá)到最高，約為對(duì)照組的8倍， 4周開始下降，但仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動(dòng)脈Apo J mRNA表達(dá)水平

表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動(dòng)脈Apo J mRNA表達(dá)水平

注：qRT-PCR：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；Apo J：載脂蛋白J。與實(shí)驗(yàn)組1周比較aP＜0.05;與實(shí)驗(yàn)組2周比較 bP＜0.05; 與實(shí)驗(yàn)組3周比較cP＜0.05。*：存活大鼠

3 討論

目前，大量的研究結(jié)果提示Apo J/CLU可以通過抑制p53和p21的表達(dá)，刺激敲除CLU-KO小鼠的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和遷移[11]，進(jìn)而促進(jìn)PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生[12]。而Orlandi等[13]通過誘導(dǎo)Apo J亞型轉(zhuǎn)變的深入研究發(fā)現(xiàn)， n CLU對(duì)VSMC有促進(jìn)凋亡、抑制增殖的作用，而Kim等[14]卻提出高表達(dá)的s CLU能抑制VSMC的遷移、增殖，及抑制細(xì)胞的凋亡，但他們的研究并沒有直接的證實(shí)s CLU和n CLU各自對(duì)于VSMC的作用。

VSMC的增殖和遷移是導(dǎo)致PCI術(shù)后再狹窄的主要原因。VSMC又分為分化型（收縮型）和未分化型（合成型）兩種亞型。正常血管壁中的VSMC為分化型，無DNA的合成及增殖和遷移的能力，細(xì)胞中富含肌纖維，主要維持血管的彈性和收縮。心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞一旦分化后就失去增殖的能力，但是VSMC與這些細(xì)胞不同，分化型的VSMC在應(yīng)激性刺激的誘導(dǎo)下出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化而變?yōu)槲捶只?。未分化型的VSMC肌纖維的含量較少，結(jié)構(gòu)蛋白少，合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力強(qiáng)，有較強(qiáng)的增殖活性和向內(nèi)膜遷移的生物學(xué)特性[15]。VSMC表型的轉(zhuǎn)化使VSMC獲得了增殖和遷移的能力，進(jìn)而導(dǎo)致了PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)在Wistar大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后，血管內(nèi)膜于第1周時(shí)開始出現(xiàn)增生，并于第2周明顯可見大量的VSMC向內(nèi)膜遷移，內(nèi)膜中的VSMC數(shù)量較多，細(xì)胞核密集、排列紊亂，提示其轉(zhuǎn)化為增殖活躍狀態(tài)的未分化型，而與之伴隨的是Apo J mRNA的表達(dá)水平開始顯著升高，其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平亦顯著升高。第3周時(shí)內(nèi)膜的增生更加明顯，I/M面積比進(jìn)一步的增大，同時(shí)Apo J mRNA及蛋白的表達(dá)均達(dá)到最高，這提示Apo J的表達(dá)與平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移有密切的關(guān)系。在第4周時(shí)血管內(nèi)膜增生達(dá)到最大，而在其增生內(nèi)膜的管腔側(cè)仍可發(fā)現(xiàn)未分化型的VSMC，但是其管壁側(cè)的VSMC的排列開始趨向于整齊，多平行于管壁排列，細(xì)胞核趨向于成熟且數(shù)目減少，而細(xì)胞外基質(zhì)開始增多，表明VSMC再次轉(zhuǎn)化為無內(nèi)分泌及增殖活性的分化型，此時(shí)，Apo J mRNA及蛋白的表達(dá)水平開始下降，但仍是高于對(duì)照組，進(jìn)一步說明血管增生內(nèi)膜內(nèi)的Apo J表達(dá)與未分化型的VSMC密切相關(guān)。

Apo J是一種應(yīng)激蛋白，多在有損傷、應(yīng)激的情況下表達(dá)增加。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為球囊損傷作為機(jī)械刺激，誘導(dǎo)VSMC由分化型向未分化型轉(zhuǎn)變，未分化型的VSMC大量地向內(nèi)膜遷移并增殖，同時(shí)合成和分泌大量含Apo J的細(xì)胞外基質(zhì)。Apo J表達(dá)的持續(xù)增加可能作為一種應(yīng)答機(jī)制，反饋性地抑制VSMC的增殖和遷移，隨著VSMC增殖活性的降低，Apo J的表達(dá)開始減少。因此，我們進(jìn)一步推測(cè)Apo J有望作為干預(yù)術(shù)后血管再狹窄的一個(gè)靶點(diǎn)，通過局部或系統(tǒng)地調(diào)節(jié)Apo J的表達(dá)，從而減少血管再狹窄的發(fā)生，但需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)這些推測(cè)。本研究尚存在一些不足之處，實(shí)驗(yàn)所使用的抗體主要用于檢測(cè)s CLU，而未能探討n CLU在再狹窄過程中的變化，因此，針對(duì)不同的Apo J蛋白表達(dá)在PCI術(shù)后再狹窄進(jìn)程中的作用及分子機(jī)制的研究將是解決PCI術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵。

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Expression Pattern of Apolipoprotein J in Rat’s Model of Carotid Artery Restenosis

YANG Ning, SU Bin, KOU Lu, DONG Bo, LI Yang, YANG Jing-yu, QIN Qin.
Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin (300051), China

QIN Qin, Email: qinqin6351@163.com

Objective: To study the expression pattern of apolipoprotein J (Apo J) in rat’s model of vascular restenosis after cartid balloon dilation.

Methods: A total of 40 Wistar rats were randomly divided into 2 groups: Experimental group, the rat’s model of carotid artery injury was established by 2 F Fogarty balloon catheter scratching in right carotid artery and Control group, the rats received sham operation without catheter scratching. n=20 in each group. Right carotid artery tissue was taken at 1, 2, 3, 4 weeks after the operation respectively and 5 rats were used for each time point. The morphological changes were measured by HE staining, protein and gene expressions of Apo J were examined by immunohistochemistry and qRT-PCR.

Results: Compared with Control group, at each time point Experimental group had obvious intimal hyperplasia and upregulated protein and gene expressions of Apo J, P＜0.05. In Experimental group, with prolonged time of injury, consistent endometrial hyperplasia was observed and it reached the maximum at 4 weeks after operation; the peak protein and gene expressions of Apo J was found at 3 weeks after operation, then decreased at certain point at 4 weeks after operation, P＜0.05.

Conclusion: Apo J might be closely related to intimal hyperplasia after vascular injury, high expression of vascular Apo J was mainly derived from vascular smooth muscle cell synthesis, it could be a kind of compensation with protective role and might be used as a new biological target for treating vascular retenosis after percutaneous coronary intervention.

Apolipoprotein J; Carotid stenosis; Intimal hyperplasia

天津市衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（13KG131）；天津市衛(wèi)計(jì)委科技基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2015KR07）

300051 天津市胸科醫(yī)院 心內(nèi)科

楊寧 主治醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病防治的臨床與基礎(chǔ)研究 Email：mengshateng@163.com 通訊作者：秦勤 Email：qinqin6351@163.com

R541

A

1000-3614（2017）12-1222-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017. 12.019

2016-12-25）

（編輯：曹洪紅）