郭俊夫，宗蜜蜜，徐文平，陶黎明

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海洋鏈霉菌P10–16代謝產(chǎn)物的分離與鑒定

郭俊夫，宗蜜蜜，徐文平，陶黎明

(華東理工大學藥學院，上海 200237)

以海洋鏈霉菌P10–16為材料，采用柱層析、薄層層析和高效液相色譜等方法分離、純化其代謝物質，利用質譜和核磁等鑒定其化合物的結構，并以稻瘟病菌為指示菌，研究化合物的抑菌活性。結果表明：從海洋鏈霉菌中首次分離出伊枯草菌素類化合物(伊枯草菌素A–2、A–3、A–4、A–6和A–7)和鄰苯二甲酸二(2–乙基己基)酯(DEHP)。伊枯草菌素A–2對稻瘟病菌的半抑制濃度和最小抑制濃度分別為26.471、62.500 μg/mL, DEHP對稻瘟病菌的半抑制濃度和最小抑制濃度分別為1.916、15.625 μg/mL。

海洋鏈霉菌P10–16；分離；純化；伊枯草菌素A；結構鑒定；抗菌活性

農(nóng)業(yè)上大規(guī)模使用化學農(nóng)藥，既提高了病蟲害抗藥性，又造成了環(huán)境污染，還導致人畜中毒等事件增加，因此，高效、低毒、低殘留的微生物農(nóng)藥是環(huán)境友好型農(nóng)藥研究的新方向。放線菌是較有價值的微生物，已有超過一萬多種生物活性次級代謝產(chǎn)物從放線菌分離出來，而其中大約70%的產(chǎn)物來自鏈霉菌屬[1]。20世紀50年代以來，陸地放線菌已經(jīng)被逐步篩選出來，其中包括抗生素、抗癌、抗腫瘤[2]和免疫抑制藥物[3]。近年來，科技工作者日益關注海洋天然產(chǎn)物的進展[4]，在未勘探開發(fā)的棲息地中發(fā)現(xiàn)了新的微生物群[5–6]。海洋環(huán)境已經(jīng)被證明是一個豐富的微生物棲息地以及新穎的次生代謝物產(chǎn)生地[7–8]。本研究中，以海洋鏈霉菌P10–16為材料，對其代謝活性物質進行了分離、純化和鑒定，并研究其對稻瘟病菌的抑菌活性，現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1　材料

供試菌株：海洋鏈霉菌P10–16，從海南潮間帶紅樹林老鼠簕中分離而來，由國家海洋局第一海洋研究所的田黎老師采集，保存于中國微生物菌種保藏中心(CGMCC No. 11467)；稻瘟病菌由上海國家南方農(nóng)藥研究中心提供。

斜面培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g, FeSO40.01 g，土壤浸提液200 mL，人工海水50 mL，瓊脂15 g，加水配成1 L。調節(jié)pH至7.0~7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉10 g，葡萄糖20 g，黃豆粉25 g，肉膏1 g，酵母粉4 g，氯化鈉2 g，K2HPO40.05 g，加水配成1 L。調節(jié)pH至7.0~7.2。

抑菌活性指示菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

主要儀器：LC–20AT高效液相色譜儀和SCL–8A高效液相制備色譜儀(日本島津公司)、SPY–50雙層旋轉搖床(上海市離心機械研究所)、Bruker DPX–400 spectrometer核磁共振儀(Bruker, Switzerland)、Mass spectrometer質譜儀(Mass Spectrometry Instruments Ltd., Britain)和Toshiba UV–2501PC紫外全光譜掃描儀(Toshiba, Japan)等。

主要試劑：乙腈、甲醇，色譜純，美國Honeywell公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、正丁醇、氯化鈉、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、濃鹽酸、濃硫酸均為分析純。

1.2　方法

1.2.1菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，每瓶60 mL，121 ℃滅菌20 min。冷卻后，將1株長滿斜面的菌株P10–16接入發(fā)酵培養(yǎng)基。在搖床上220 r/min、28 ℃培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液4 000 r/min離心，收集上清液，待用。

1.2.2抑菌物質的分離與純化

發(fā)酵上清液用正丁醇萃取3次，合并有機相。正丁醇萃取相減壓蒸餾除去溶劑，用甲醇溶解過濾后得到粗提物。取少量粗提物溶于甲醇，用薄層層析和離體抗菌試驗來探索粗提物在不同流動相中的活性分布，調節(jié)薄層層析流動相比例，把粗提物中的各個抗菌活性成分盡量分開，結合離體抗菌試驗來確定活性成分在薄層層析板中的位置。探索發(fā)現(xiàn)在展開劑為二氯甲烷和甲醇，體積比為5∶2時，板中活性條帶在不同Rf值中都有分布。

探索出展開劑比例后，將粗提物溶于適量甲醇進行硅膠柱(直徑3 cm，長度100 cm，柱高50 cm，硅膠顆粒直徑為0.074 mm)層析分離。薄層層析展開劑比例的結果可以指導柱層析流動相配制。根據(jù)探索得到的薄層色譜展開劑比例來配制柱層析的流動相比例，分別設置二氯甲烷和甲醇體積比為5∶1、5∶2、1∶1和0∶1進行梯度柱層析。每50 mL收一餾分，將不同的餾分點板，合并相同條帶的餾分，得到7個組分，依次命名為A、B、C、D、E、F、G。

將7個組分進行離體抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)組分F活性較好且含量較高，故選取組分F進行下一步試驗。將組分F進行薄層層析，通過活性跟蹤發(fā)現(xiàn)Rf值為0.4~0.5區(qū)域條帶有抑菌活性。刮下薄層層析硅膠板上的活性條帶，將其浸泡在甲醇中，過濾濃縮后待用。

組分F在Rf值為0.4~0.5樣品進行高效液相色譜(制備柱型號為VP250/21 Nucleosil 100–7 C18，柱溫28 ℃，流速20 mL/min，紫外檢測波長為210 nm)分離，流動相為37.5%的乙腈–水溶液，樣品中含有5個具有抑菌活性的化合物。5個化合物的保留時間分別為12.8、18.7、20.0、36.3、41.1 min，相對應的質量分別為22、10、12、11、9 mg。

調整流動相比例為90%甲醇–水溶液，組分F在Rf值為0.4~0.5樣品中含有1個具有抑菌活性的化合物，其保留時間為18.7 min，質量為16 mg，命名為化合物6。

1.2.3組分的結構鑒定

制備所得的6個化合物通過質譜和核磁光譜來確定結構。

1.2.4抗菌活性測定

本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)， P10–16的次級代謝產(chǎn)物中的有效活性成分對稻瘟病菌有抑制作用，因此，選用稻瘟病菌作為指示菌。離體抗菌試驗采用紙碟法。將高效液相色譜制備所得化合物進行離體抗菌試驗。將待測化合物加無菌水配制成濃度為1 250 μg/mL的溶液，依次稀釋，分別得到濃度為625、312.50、156.25、78.125 μg/mL的溶液。在無菌條件下將1 mL含有待測藥物溶液和9 mL融化PDA混合均勻，分別制成濃度為125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μg/mL的含藥平板，以不含藥的平板為對照。用直徑5 mm打孔器打孔，將稻瘟病菌接種于平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)。當對照平板上的菌絲剛好長滿培養(yǎng)皿時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各個濃度平板的生長抑制率。抑菌率=(對照平板菌落直徑 – 處理菌直徑)/(對照平板菌落直徑 – 打孔器直徑)×100%。以化合物濃度對數(shù)為橫坐標，抑制率為縱坐標，得曲線方程，計算半抑制濃度和最小抑制濃度。

2　結果與分析

2.1　活性化合物的結構鑒定

2.1.1活性化合物1至化合物5的結構鑒定

化合物1至化合物5的結構式如圖1 所示?；衔?的質譜圖顯示1 043.5和1 065.5有出峰，從而確定1 043.5為[M+H]+峰，1 065.5為[M+Na]+峰，化合物1的分子量為1 042，推測分子式為C48H75N12O14。根據(jù)化合物1中所有1H(表1)和13C(表2)的核磁信息并結合相關文獻譜圖[9]，確定化合物1為伊枯草菌素A–2。

圖1　化合物1至化合物5的結構式

表1　化合物1的1H核磁信息

表2 化合物1的13C核磁信息

表2(續(xù))

化合物2的質譜圖顯示1 057.199 1為[M+H]+峰，化合物3的質譜圖顯示1 057.135 1為[M+H]+峰，推斷化合物2和3的分子量均為1 056?；衔?和5的質譜圖均顯示1 071.58為[M+H]+峰，推斷化合物4和5的分子量均為1 070。結合文獻譜圖分析，化合物2至化合物5均屬于伊枯草菌素A類化合物。化合物2至化合物5和化合物1除了–氨基酸側鏈結構不同，均有相同的氨基酸排列順序。–氨基酸側鏈(–R)中1H和13C的主要核磁信號區(qū)別如表3。結合相關文獻譜圖[10]，化合物2為伊枯草菌素A–3，化合物3為伊枯草菌素A–4，分子量均為1 056，分子式均為C49H77N12O14；化合物4為伊枯草菌素A–6，化合物5為伊枯草菌素A–7，分子量均為1 070，分子式均為C50H79N12O14。

表3　化合物1~5的β–氨基酸側鏈中1H和13C的主要核磁信號

2.1.2 活性化合物6的結構鑒定

化合物6的質譜圖顯示391.281 6為[M+H]+峰，可以推斷化合物6的分子量為390，推測分子式為C24H28O4。根據(jù)1H NMR和13C NMR譜圖信息(表4)并結合相關文獻譜圖[11]，化合物6(圖2)為鄰苯二甲酸二(2–乙基己基)酯。

圖2 化合物6的結構式

表4 化合物6的1H和13C的核磁信號

2.2　抗菌試驗結果

伊枯草菌素A–2和DEHP對稻瘟病菌的抗性試驗結果表明，隨著化合物濃度的增加，對稻瘟病菌的抑制率逐漸增大。伊枯草菌素A–2的濃度()與抑制率()的回歸方程為=2.436+1.516(2=0.994 0)，伊枯草菌素A–2對稻瘟病菌的半抑制濃度為26.471 μg/mL，最小抑制濃度為62.500 μg/mL。DEHP的濃度()與抑制率()的回歸方程為=1.042+4.640 (2=0.976 5)，DEHP對稻瘟病菌的半抑制濃度為1.916 μg/mL，最小抑制濃度為15.625 μg/mL。

3　結論

從海洋鏈霉菌P10–16發(fā)酵代謝物中分離得到5個伊枯草菌素A類化合物(伊枯草菌素A–2、A–3、A–4、A–6、A–7)和鄰苯二甲酸二(2–乙基己基)酯。伊枯草菌素A–2對稻瘟病菌的半抑制濃度和最小抑制濃度分別為26.471、62.500 μg/mL。鄰苯二甲酸二(2–乙基己基)酯對稻瘟病菌的半抑制濃度和最小抑制濃度分別為1.916、15.625 μg/mL。

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責任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Isolation and identification of metabolites from marineP10–16

GUO Junfu, ZONG Mimi, XU Wenping, TAO Liming

(School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

The secondary metabolites from marineP10–16 were isolated and identified by silica gel column chromatography and TLC, their structures were elucidated with spectra data analysis of ESI–MS and NMR, and their antifungal activities were tested with the indicator fungus of rice blast. The results showed that five iturins (iturin A–2, A–3, A–4, A–6 and A–7) and DEHP were isolated from marine. Half maximal inhibitory concentration(50) and minimum inhibitory concentration()of iturin A–2 (Po) were 26.471, 62.500 μg/mL, while50andof DEHP (Po) were 1.9159, 15.625 μg/mL, respectively.

marineP10–16; isolation; purification; iturin A; structure elucidation; antimicrobial activity

Q939

A

1007-1032(2017)06-0615-05

2017–03–25

2017–09–28

“十二五”國家科技支撐項目(2011BAE06B04)

郭俊夫(1985—)，男，湖南湘潭人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物分離研究，gjfdyx@163.com；

通信作者，陶黎明，教授，主要從事天然產(chǎn)物分離研究，taolm@ ecust.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn